Summary
Генерация ортотопический мышиной модели рака щитовидной железы анапластическую описан здесь. Эта техника используется хирургическое помещение человека анапластическую клетки рака щитовидной железы в щитовидную иммунодефицитных мышей, создавая тем самым более клинически значимых настройки для изучения прогрессирования заболевания, а также экран инновационных терапевтических вмешательств.
Protocol
1. Подготовка клеток
Примечания: 1) в комплекте RPMI 1640 питательных сред на основе рецептов (500 мл) содержит 435 мл RPMI 1640, 50 мл инактивированной нагреванием FBS, 5 мл несущественные аминокислоты, 5 мл пирувата натрия, 5 мл противогрибковым антибиотикам, 2) место матригель при 4 ° С за один день до сбора клеток.
- УВД человека клеточной линии THJ-11T 8 выращивают в 6-луночные планшеты культуры и собирали один раз 80-90% сливной.
- Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте СМИ и ресуспендирования клеток в среде RPMI 1640, [2 мл / 6 лунками].
- Возьмите небольшой объем клеточной суспензии, добавить его к одному объему 0,4% трипанового синего красителя и определить плотность клеток TC10 использованием автоматического счетчика Cell.
- Рассчитать объем клеточной суспензии, необходимые для получения 5 х 10 5 клеток / мышь раза число мышей инъекцией.
Примечание: Для обеспечения объявление приравнять клеточной суспензии для инъекций, подготовить клетки, как будто вы инъекционных двойных количество мышей (например, если инъекционных 5 мышей, а затем подготовить клеточной суспензии, как будто вы были потребителями инъекционных 10 мышей).
- Передача необходимый объем клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
- Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте СМИ и ресуспендируйте клеток в полной RPMI 1640.
- Передача клетки 1,6 мл пробирку, добавляют 1 объем матригель и аккуратно, медленно пипетки и выход.
Примечание: Каждая мышь получит 10 мкл клеточной суспензии / Матригель коктейль. С 5 х 10 5 клеток приостановлены в 10 мкл объема инъекций успешно использовались в предыдущих исследованиях УВД ортотопический 9-10, мы использовали те параметры, в настоящем докладе.
- Место для клеточной суспензии на льду до использования.
- Очистите хирургической зоны, включающей рассекает сферу и его окрестностях, путем протирания всех поверхностей с 70% этанола.
- Включите нагревательные лампы / колодки, где животные будут восстанавливается после операции.
- Администрирование 0,1 мл кетамина / ксилазина (препарат коктейль, состоящий кетамина 9 мг / мл и ксилазина 1mg/ml) в расчете на 10 г массы тела внутрибрюшинно с использованием 1 мл, 27G ½ "туберкулин шприца.
- Подготовка к операции мыши: 1) брить шею область мышиного (от линии челюсти верхней части грудины и к оружию), 2) скраб хирургической области три раза chorhexadine пропитанной марли квадратов, 3) окончательное скраб сделано бетадином пропитанной марли, 4 ) осторожно применять глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз.
- Проверьте педаль рефлекс для обеспечения адекватного мышь седации.
- Поместите животное в спинных лежачее положение одноразовый стерильный барьер поля под рассекает сферу и защитить животных в месте с тканевой лентой.
- Scrubs рук и ногingernails затем надеть стерильные хирургические перчатки.
- В стерильных моды, открытой хирургии упаковать и расставляем орудия.
- Наведите стерильная салфетка над животными, оставив только хирургическое сайте подвергаются.
3. Хирургический доступ к щитовидной железы и инъекции клеток
- Используя стерильный, одноразовый скальпель, сделать 1-к-1,5 см продольный разрез вдоль средней линии горла.
Примечание: Отклонение от средней линии глубокой резки усложняет доступ к трахее. Довольно точное срединный разрез позволяет дразнить и прорезать мембранной ткани удерживая левую и правую слюнных желез вместе и уменьшает шанс никующих или отделение крупных артерий.
- Сделать второй разрез в ремень мышцы, окружающие трахею затем вытащить правой стороны надрезанные мышц в сторону, чтобы подвергать правой щитовидной железы.
- Hemostats можно использовать в этот момент провести мышечного слоячасти для легкого доступа к щитовидной железе (рис. 1).
Примечание: Кроме того, если процедура выполняется двумя хирургического персонала, мышечный слой может быть просто сдерживали щипцами в то время как готовые инъекционные шприцы и вручается хирург вспомогательного персонала.
- Медленно введите 10 мкл клеточной суспензии в правую щитовидной железы использованием 31G 5/16 "инсулиновый шприц Затем аккуратно удалить иглу.
4. Закрытие операционного и мышь восстановления
- Шовный мышечный слой с 6,0 сшивания материала с использованием непрерывной или прерванный наложения швов стиля.
- Стежка кожи таким же образом.
- Нанесите слой тройной антибиотик мазь непосредственно на месте разреза.
- Разрешить животного восстанавливаться в спинных лежачее положение теплую грелку. Как только животное может достичь грудины лежачее положение без посторонней помощи, он может быть помещен обратно с другими мышами.
- Проверить сайт разрез и общее состояние здоровья животного ежедневно в течение недели после операции, а затем проверить раз в неделю. Если швы остаются нетронутыми после 14 дней, они удаляются.
Примечание: Животные, демонстрирующие признаки ухудшения здоровья (например, значительная потеря веса, потрепанными волосами, затрудненное дыхание) следует усыплять и тканей собраны.
- Как только мыши достигли заданной послеоперационный момент времени, управлять кетамин / ксилазина, как описано выше успокоить.
- Заливать животных внутрисердечно и урожай щитовидной железы / трахеи и других тканей интереса (подробно не описаны здесь).
Representative Results
Мы обнаружили 19 инвазивных опухолей щитовидной железы в общей сложности 20 мышей, которым инъецировали клетки ATC после 4 недель. В примере, показанном на фиг.2А, мышей, получавших ортотопической инъекции 5X10 5 клеток АТС, выращенных в прилагаемой условиях, проявляют значительную инфильтрацию раковых клеток в щитовидной железе на 4 недели после инъекции. Характер вторжения в клетки ATC с характерной веретенообразной клетки и средне-и гигантского размера клеток с эозинофильной цитоплазмой и большие ядра была проверена гематоксилином и эозином (H & E) окрашивания. Для сравнения, щитовидной железы и трахеи из неинъекционные контрольное животное показано на рисунке 2B. Фолликулы uninjected животных отображать близко, но свободные, ассоциации и имеют, по существу круглой морфологии.
Из-за небольшого размера щитовидной железы и использование инъекционного доставки, непреднамеренные результаты могут возникнуть. Фиг.3А иллюстрируетНаиболее часто наблюдается, что развитие опухолевой массы за пределами, но не охватывает, щитовидной железы. Это больше, чем, вероятно, из-за проникновения иглы, и в других щитовидной железы, когда клетки изгнаны. Иногда мышей представления, не рост опухоли, как грубо и гистологически обнаруживаются как показано на фиг.3В. Отсутствие определяемых развитием опухоли может быть вызвано изгнанием клеточную суспензию из места инъекции и распространение на соседние ткани и полостей.
Рисунок 1. Разоблачение щитовидной железы. Этикетки указывают на правой и левой щитовидной железы, фланкирующие трахеи.
Рисунок 2. Гистологическое исследование роста опухоли и вОбразцы vasion после успешной инъекции щитовидной железы. ткани рассекают вдоль фронтальной плоскости.) изображения, снятого при 200X мыши выставке существенного роста опухоли с характерной веретенообразной клетки и средних до гигантских размеров клеток с эозинофильной цитоплазмой и крупными ядрами в гематоксилином и эозином ( H & E) пятно Ту указывает на первичное поражение от которых опухолевые клетки проникают в щитовидной B) трахеи и щитовидной железы от контрольных животных (изображения, снятого при 100X) Ту, опухоли;... S, гладкие мышцы; Тр, трахеи; Твоего, щитовидной железы.
Рисунок 3. Непреднамеренных результатов ортотопический инъекции. Образцы тканей рассекают вдоль фронтальной плоскости.) Периферийное роста опухоли, не проявляется в росте thyroiD (черная стрелка, изображения, снятого при 100х). B) Отсутствие обнаружение опухоли на брутто (не показано) или гистологического исследования (изображения, снятого при 50х). Твоей, щитовидной железы.
Discussion
В нашей модели, животные продемонстрировали щитовидной железы метастазы опухоли и заболевания, связанного кахексии и дыхательной недостаточности на 4 недели после инъекции. Как и большинство других ортотопической модели использования инъекций доставки клеточной суспензии, инъекции в окружающие ткани и после инъекции утечки, которая распространяется за пределы целевого возможно. С этим, как говорится, один узнаваемый потенциал неизвестного производства этой процедуры является эффект от воздействия цели, не связанные с заболеванием метастазов или осложнений. Это общее беспокойство с большинством ксенографического трансплантации, независимо от изучаемой болезни. Тем не менее, непреднамеренных последствий от метастаз может быть значительно минимизированы путем обеспечения всей конической кончика иглы проникла мембраны плотно наложения щитовидной железы и медленно изгнания клеточной суспензии. Если утечка наблюдается во время или после инъекции, эти животные могут быть опущены из исследования.
В данном докладе рассматривается локальный рост и инвазия опухоли передовых щитовидной ортотопический после инъекции клеток УВД. ATC метастазы могут быть исследованы путем анализа гистологических препаратов других тканей с использованием стандартных гистологических красителей, таких как гематоксилином и эозином, или с помощью иммуногистохимии использованием клеток или патологии соответствующих маркеров. Эта система может быть дальнейшее развитие гenetically изменения клетки рака щитовидной железы с флуоресцентным журналистам, так что живого изображения может быть использован для мониторинга метастазов и эффективности терапевтических процедур.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Вэньцзюнь Ли и Дэниел Kreisel (Вашингтон школы медицины университета в Сент-Луисе) за помощь в подготовке операции. RYL при поддержке Национального института здоровья грант R01 DK068057 и исследованиям фонда Президента из Университета Сент-Луиса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
