Summary
我们提出了一个协议冻结和cryosectioning的酵母菌社区观察荧光细胞的内部模式。该方法依赖于甲醇固定，OCT-嵌入社区内的荧光蛋白失活的细胞没有保留的空间分布。
Abstract
微生物通常生活在社区。社区空间组织的细胞内被认为是影响社区1的生存和功能。光学切片技术，包括共聚焦和双光子显微镜，已被证明可用于观察细菌和古细菌的社区空间组织的2,3。共聚焦成像和物理切片的酵母菌菌落的组合显示内部组织单元4。然而，直接用激光共聚焦或双光子显微镜的光学切片只能达到几个细胞层深入酵母菌菌落。这种限制可能是因为强散射光从酵母细胞中4。
在这里，我们提出了一种基于固定和cryosectioning获得的荧光细胞内的空间分布酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）社区。我们使用甲醇作为定香剂保存细胞的空间分布。固定社区的渗透与OCT化合物，冷冻，和cryosectioned在低温恒温器。荧光成像的部分揭示了内部组织社区内的荧光细胞。
酵母表达红色和绿色荧光蛋白的菌株组成的社区的例子演示的cryosectioning方法来揭示的空间分布的荧光细胞，以及酵母菌落内的基因表达2,3的电位。虽然我们的重点是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）社区，同样的方法也可能适用于研究其他的微生物群落。
Protocol
1。固定酵母社区
- 酵母社区成长的膜过滤器（ 例如 ，Millipore公司的MF膜的过滤器， 图2A）。该协议对应于小于2×10 8个细胞的一个6毫米直径的膜过滤器上的一个典型的社区。
- 使用一块的Whatman 541滤纸覆盖1厘米直径的（ 图2B）的底部。此Whatman滤纸将用作载体，以在以后的阶段转让社区。加入1毫升100％的甲醇井，离开以及-20°C的温度达到平衡。
- 把在杜瓦瓶中的液N 2。社区浸渍在液体中的至少15秒N 2使用镊子（ 图2C），在液氮中冻结的社群。
- 把冷冻社区以及-20°C甲醇（ 图2D）。确保社会保持水平时淹没在甲醇。等待20分钟。 MF膜过滤器开始在甲醇中崩解。
- 社区，使用该载体的Whatman 541滤纸转移到冷的陪替氏培养皿保持在-20℃的甲醇蒸发（ 图2E）以及从甲醇。传送时，社会上运营商Whatman过滤器，引诱多余的甲醇在寒冷的培养皿中，然后再将使用另一块厚的滤纸置于滴。这将确保样品与样品蒸发的时间是一致的。
- 等待4-6小时蒸发，直到运营商Whatman过滤器看起来干的。蒸发留下残余的不足，甲醇干扰切片。过度干燥产生裂纹和变形的社区。
- 样品在-20℃的冰箱中。切掉的Whatman 541滤纸覆盖的社区。
- 车型的矩形立方体铝箔容器，该容器足够大，该样本具有至少〜2毫米毛利从的每一侧（ 图2F）。将社会上的铝箔容器的底面;，立刻覆盖的样品，10月至3〜4毫米以上社会高度。如果重要的是，样品的取向，可以调整在此步骤中与关于所述容器的侧面。等待10分钟。
- 将OCT-嵌入式样品干冰冻结的金属板。保存在-20℃或-80℃的冰箱中冷冻社区。
2。用于荧光成像切片冷冻社区
- 冰冻切片室的温度设置到-25℃，并离开样品在室中，直至其温度达到该室的温度。
- 样品安装到冷冻安装应用下降了OCT的安装后，。均匀地传播出去OCT暴露Whatman滤纸（在容器的底部）上的样品的侧使OCT的厚度为2-3毫米。让OCT冻结本身低温恒温器内室前ctioning。确保OCT缘2-3毫米的样品各方面的帮助，以保持完整的部分。
- 可以使用OCT取样块的两侧对齐样品。如果样品未对齐相对于刀片，切片将开始的样品从一个角落或侧面。调整的安装，以确保刀片切割一个完美的垂直（或水平）面的样品块。
- 〜14微米厚的典型酵母社区部分。切割后的部分中，使用在室温下保持在显微镜载玻片，收集部分中，慢慢接近滑动到切割部分。本节将融化，转移到显微镜幻灯片。多达18个部分可以转移到一个幻灯片。
- 在寒冷的温度，最好是-20°C，在成像之前，存储的幻灯片。是最小的，在4℃下保持一个星期时的信号损失为了获得最大的荧光信号，成像，优选立即进行后切片。
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Representative Results
在图3中示出的荧光图像的垂直截面包含红色和绿色标记的竞争种群6酵母社区。这些社区包括两个原养型菌株的共享资源，包括空间的酵母和其竞争，导致，显示在它们的垂直的横截面的柱状图形7。分辨率下降到一个单一的单元，可以解决在横截面， 图3比较复制社区获得的（底部）和无（顶部）甲醇-定影后，在图1中的协议的横截面。不固定，对于cryosectioning酵母社区，通讯协定后开始从步骤1.8。荧光信号保存在社区的部分不固定，但社会的完整性受到损害。其结果是：（1）一些细胞飘走周围的边缘部分，和（2）的整体义领域（ 即小部分章节波澜不惊的切片过程中的产物）是较固定的社区。
图4示出了代表性的明视场和荧光的垂直截面的酵母社区。细胞对社区顶部形成一个冠出现明显的来自其他小区的其特征在于，在明视场，更明亮的荧光强散射。这些模式是一致的报告模式的分化在酵母菌落4。
图1（左）和无（右）定影cryosectioning酵母社区的典型过程的流程。
图2。
图3。代表荧光图像的垂直横截面的代表licate在相同的条件下生长的酵母社区（顶部）和（底部）甲醇 - 定影所示。该社区由两个原养型菌株mCherry和yEGFP荧光蛋白标记的酿酒酵母。不固定，细胞结合在一起，可能会飘走或重新安排在切片。甲醇固定在一起，保持社会的细胞，但导致收缩率观察社会的高度（平均）之间的差异。
图4代表明视场（顶部）和显示图像的荧光（底部）的垂直横截面的酵母社区。社区由两个原养型菌株与红色荧光蛋白和YFP荧光蛋白标记的酿酒酵母。
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Discussion
这里介绍的过程提供了一种方法来检查的内部结构的酵母社区。甲醇定影步骤使得酵母菌落刚性8并保留的菌落的完整性，但是，它也导致收缩8，应考虑在解释结果。我们通常会看到30％左右的收缩高的酵母菌菌落，菌落直接嵌入到OCT无固定9。
为了避免收缩为cryosectioning，另一种方法是直接嵌入在华侨城社区，并冻结他们。荧光是保存在方法基于直接嵌入，但其缺点是，在每个部分中的细胞不结合在一起。其结果是，在边缘部分浮动，距离和部分的一些细胞的更有可能遭受干扰在切片过程中（ 图4）。虽然不是专注于他重，亮场图像酵母社区的横截面也可以让我们对国家有用的信息社会的细胞内9。无论是或不是的财产利益受到影响的固定步骤必须在逐案基础研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢在弗雷德哈钦森癌症研究中心的乔纳森·库珀实验室的许可使用低温恒温器。这项工作是由美国国立卫生研究院和WM凯克基金会的支持。 BM是一个戈登和贝蒂·摩尔的生命科学研究基金会的研究员。我们非常感谢丹尼尔Gottschling，与我们分享他的固定协议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
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