Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zum Einfrieren und Kryoschneiden Hefe Gemeinden internen Muster der fluoreszierenden Zellen zu beobachten. Die Methode beruht auf Methanol-Fixierung und OCT-Einbettung, um die räumliche Verteilung der Zellen ohne Inaktivierung fluoreszierende Proteine innerhalb einer Gemeinschaft bewahren.
Abstract
Mikroben leben typischerweise in den Gemeinden. Die räumliche Organisation von Zellen innerhalb einer Gemeinschaft wird angenommen, dass das Überleben und die Funktion der Reisenden 1 auswirken. Optische Schnitte Techniken, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, haben sich bewährt zur Beobachtung räumlichen Organisation von Bakterien und Archaeen Gemeinden 2,3. Eine Kombination von konfokale Bildgebung und physikalische Schnitte von Hefe-Kolonien hat interne Organisation von Zellen 4 enthüllt. Allerdings hat direkte optische Schnitte mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie war nur in der Lage, ein paar Zellschichten tief in Hefe-Kolonien zu erreichen. Diese Einschränkung ist aufgrund der starken Streuung des Lichts aus Hefezellen 4 wahrscheinlich.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Festsetzung und Kryoschneiden die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen in Saccharomyces cerevisiae Gemeinden zu basieren. Wir verwenden Methanol als Fixiermittelum die räumliche Verteilung der Zellen zu erhalten. Feste Gemeinden sind mit OCT-Verbindung, gefroren und kryogeschnitten in einem Kryostaten infiltriert. Fluoreszenz-Bildgebung der Abschnitte zeigt die interne Organisation der fluoreszierenden Zellen innerhalb der Gemeinschaft.
Beispiele von Hefe Communities bestehend aus Stämmen exprimierenden rot und grün fluoreszierende Proteine zeigen die Potentiale des Kryoschneiden Methode, um die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen sowie die der Genexpression innerhalb Hefekolonien 2,3 offenbaren. Obwohl unsere Fokussierung auf Saccharomyces cerevisiae Gemeinden gewesen ist, kann das gleiche Verfahren angewandt potentiell zu anderen mikrobiellen untersuchen.
Protocol
Ein. Befestigung Hefe Gemeinschaften
- Wachsen Hefe Gemeinden auf einem Membranfilter (zB Millipore MF Membranfilter; 2A). Dieses Protokoll entspricht einer typischen Gemeinschaft von weniger als 2x10 8 Zellen auf einer 6 mm-Durchmesser-Membranfilter.
- Mit einem Stück Whatman 541 Filterpapier, um den Boden eines 1 cm Durchmesser und (2B) abzudecken. Diese Whatman Papier als Träger, um die Gemeinschaft in späteren Stadien übertragen werden. 1 ml 100% Methanol zum Brunnen, und lassen Sie das auch in -20 ° C für die Temperatur ins Gleichgewicht.
- Legen flüssigem N 2 in einem Dewar. Frieren Gemeinde in flüssigem Stickstoff durch Eintauchen der Gemeinde für mindestens 15 sec in flüssigem N 2 mit einer Pinzette (Abbildung 2C).
- Übertragen gefrorenen Gemeinschaft zum Wohl von -20 ° C Methanol (2D). Stellen Sie sicher, dass die Gemeinde gehalten wird horizontal, wenn Eintauchen in Methanol.Warten Sie 20 min. Der MF Membranfilter beginnt in Methanol zerfallen.
- Transfergemeinschaft Verwendung des Trägers Whatman 541 Filterpapier aus dem Methanol auch zu einer kalten Petrischale bei -20 ° C für Methanol Verdampfung (2E) gehalten. Bei der Übertragung, halten die Gemeinschaft auf der Oberseite des Trägers Whatman-Filter und wegziehen zusätzliche Tropfen Methanol mit einem anderen Stück dickes Whatman-Papier, bevor sie in der kalten Petrischale. Dadurch wird sichergestellt, dass die Verdampfung Zeitablauf konsistent von Probe zu Probe.
- Warten 4-6 Stunden für die Verdampfung, bis der Träger Whatman-Filter sieht trocken. Unzureichende Verdunstung hinterlässt restliches Methanol, das mit Schneiden stört. Over-Trocknung Ursachen Risse und Verformungen in den Gemeinden.
- Nehmen Sie die Probe aus -20 ° C Gefrierschrank. Schneiden Sie Whatman 541 Filterpapier nicht unter das Gemeinschaftsrecht fallen.
- Einen rechteckigen kubisches Aluminiumfolie Behälter, der groß genug ist, so dass die Probe wenigstens 2 mm ~ Marge von hat, istjede Seite (2F). Legen Sie die Gemeinde an der unteren Oberfläche der Aluminium-Folie Container; sofort decken die Probe mit Oktober um 3 bis 4 mm oberhalb Community Höhe. Wenn wichtige, kann die Ausrichtung der Probe in diesem Schritt in Bezug auf die Seiten des Behälters einstellbar ist. Warten Sie 10 min.
- Legen Sie die Oktober-embedded Probe auf einer metallischen Platte auf Trockeneis zu frieren. Bewahren Sie die gefrorenen Gemeinden bei -20 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank.
2. Schnitte Gefrorene Gemeinschaften für Fluoreszenz-Imaging
- Stellen Sie die Temperatur der Kammer Kryoschnitt bis -25 ° C und lassen die Proben in die Kammer, bis ihre Temperatur erreicht die Temperatur der Kammer.
- Montieren Sie die Probe auf einer Kryo-mount nach dem Auftragen einen Rückgang von Oktober auf dem Berg. Oktober gleichmäßig ausgebreitet auf der Seite der Probe mit freiliegenden Whatman Filterpapier (Boden des Behälters) derart, dass die OCT Dicke 2-3 mm. Lassen Oktober freeze im Kryostatkammer bevor sectioning. Sicherstellung eines OCT-Marge von 2-3 mm an allen Seiten der Probe hilft, die Unversehrtheit der Abschnitte zu bewahren.
- Die Seiten des Oktober Probenblock kann verwendet werden, um die Probe auszurichten. Wenn die Probe nicht mit Bezug auf die Klinge ausgerichtet ist, wird Schneidens von einer Ecke oder Seite der Probe beginnen. Anpassen der Halterung zu gewährleisten, dass die Klinge eine perfekt vertikal (oder horizontalen) Fläche des Probenblocks schneidet.
- Typische Bereiche für Hefe-Gemeinden sind ~ 14 Mikrometer dicke. Nach Schneiden eines Abschnitts, mit einem Mikroskop-Objektträger bei Raumtemperatur gehalten, um den Abschnitt zu sammeln, durch langsames Anfahren der Folie in die Schnittfläche. Der Abschnitt wird schmelzen und Transfer zum Objektträger. Bis zu 18 Teile können auf einen Objektträger übertragen werden.
- Bewahren Sie die Folien bei kalten Temperaturen, vorzugsweise -20 ° C, bevor Bildgebung. Signalverlust ist minimal, wenn für eine Woche bei 4 ° C gehalten wird Für maximale Fluoreszenzsignal wird Bildgebung bevorzugt unmittelbar nach Schneiden getan.
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Representative Results
Fluoreszenzbilder von vertikalen Querschnitten von Hefe Communities enthaltenden roten und grün-tagged wettbewerbsfähigen Populationen 6 sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Gemeinschaften bestehen aus zwei prototrophen Hefestämme und deren Wettbewerb für gemeinsam genutzte Ressourcen, einschließlich Raum, führt zu säulenartigen Strukturen 7, wie in ihrer vertikalen Querschnitten dargestellt. Auflösungen bis hinunter zu einer einzigen Zelle kann in Querschnitten gelöst werden. Abbildung 3 vergleicht Querschnitte replicate Gemeinden mit (unten) und ohne (oben) Methanol-Fixierung erhalten, nach den Protokollen in Abbildung 1. Für Kryoschneiden Hefe Gemeinden ohne Fixierung wird das Protokoll folgte ab Schritt 1,8. Das Fluoreszenzsignal wird in Gemeinschaft Abschnitte ohne Befestigung erhalten, aber die Integrität der Gemeinschaft gefährdet ist. Als Ergebnis: (1) einige Zellen davonschwebt um den Rand des Abschnittes, und (2) die allgemeine yield (dh Anteil der Abschnitte nicht gestört durch Artefakte des Schneidens Verfahren) ist im Vergleich zu festen Gemeinschaften.
Abbildung 4 zeigt repräsentative Hellfeld-und Fluoreszenz vertikalen Querschnitten eines Hefe Gemeinschaft. Cells an der Spitze der Gemeinde bilden eine Krone, die sich von anderen Zellen durch stärkere Streuung in Hellfeld-und hellere Fluoreszenz gekennzeichnet erscheint. Diese Muster sind konsistent mit berichteten Muster der Differenzierung in Hefekolonien 4.
Abbildung 1. Flowchart des typischen Verfahren für Kryoschneiden Hefe Gemeinden mit (links) und ohne (rechts) Befestigung.
Abbildung 2.
Abbildung 3. Repräsentative Fluoreszenzbilder von vertikalen Querschnitt von replicate Hefe Gemeinden unter identischen Bedingungen angebaut werden, ohne (oben) und mit (unten) Methanol-Fixierung gezeigt. Die Gemeinde besteht aus zwei prototrophen Stämme von S. cerevisiae mit mCherry und yEGFP fluoreszierende Proteine 7 markiert. Ohne Fixierung werden die Zellen nicht miteinander verbunden und können schwimmen weg oder beim Schneiden anordnen. Methanol-Fixierung hält Community Zellen zusammen, verursacht aber Schrumpfung in der Differenz zwischen Gemeinde Höhen (% im Durchschnitt) beobachtet.
Abbildung 4. Repräsentative Hellfeld-(oben) und Fluoreszenz (unten) Bilder der vertikalen Querschnitt einer Hefe Community gezeigt. Die Gemeinde besteht aus zwei prototrophen Stämme von S. cerevisiae mit dsRed und YFP fluoreszierenden Proteinen 7 markiert.
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Discussion
Das hier vorgestellte Verfahren bietet eine Möglichkeit, die innere Struktur des Hefe-Communities zu inspizieren. Das Methanol Fixierschritt macht die Hefekolonie starren 8 und bewahrt die Integrität der Kolonie, aber es verursacht auch Schrumpfung 8, sollte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Wir in der Regel sehen rund 30% Schrumpfung in Höhe von Hefe-Kolonien im Vergleich zu Kolonien direkt in OCT ohne Befestigungsmaterial 9 eingebettet.
Schrumpfung zu vermeiden, ist ein alternativer Ansatz zur Kryoschneiden die direkte Einbettung der Gemeinschaften, in Oktober und frieren sie. Fluoreszenz wird bei dem Verfahren auf der Grundlage direkte Einbettung erhalten, aber der Nachteil ist, dass die Zellen innerhalb der einzelnen Abschnitte nicht miteinander verknüpft sind. Als Ergebnis sind einige der Zellen an den Rändern des Profils Schwimmer weg, und die Abschnitte mit größerer Wahrscheinlichkeit zu Störungen im Schneidevorgang (Abbildung 4) leiden. Obwohl nicht auf konzentrierte er sichre, kann Hellfeld-Bilder von Querschnitten von Hefe Gemeinden geben uns auch nützliche Informationen über den Zustand der Zellen innerhalb der Gemeinschaft 9. Ob die interessierende Eigenschaft wird durch die Befestigung Schritt betroffen ist, auf einer Fall-zu-Fall-Basis untersucht werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Jonathan Cooper Lab am Fred Hutchinson Cancer Research Center für die Erlaubnis, ihre Kryostat verwenden danken. Diese Arbeit wurde vom NIH und der WM Keck Foundation unterstützt. BM ist ein Gordon und Betty Moore Fellow Life Science Research Foundation. Wir sind dankbar, dass Daniel Gottschling für die gemeinsame Nutzung seiner Befestigung Protokoll mit uns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
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