Summary
Vi presentiamo un protocollo per congelare e criosezionamento comunità di lievito per osservare i modelli interni di cellule fluorescenti. Il metodo si basa su di fissaggio e metanolo-OCT-incorporamento per preservare la distribuzione spaziale di celle senza inattivare proteine fluorescenti all'interno di una comunità.
Abstract
I microbi in genere vivono in comunità. L'organizzazione spaziale delle cellule all'interno di una comunità si crede di influenzare la sopravvivenza e la funzione della comunità 1. Tecniche ottiche di sezionamento, tra cui la microscopia confocale e due fotoni, si sono dimostrati utili per osservare l'organizzazione spaziale delle comunità batteriche e archaeal 2,3. Una combinazione di imaging confocale e sezionamento fisico di colonie di lievito ha rivelato organizzazione interna delle cellule 4. Tuttavia, diretto sezionamento ottico usando la microscopia confocale a due fotoni o è stato solo in grado di raggiungere un paio di strati di cellule in profondità in colonie di lievito. Questa limitazione è probabilmente a causa della dispersione di luce intensa da cellule di lievito 4.
Qui vi presentiamo un metodo basato sulla determinazione e criosezionamento per ottenere la distribuzione spaziale delle cellule fluorescenti all'interno delle comunità di Saccharomyces cerevisiae. Usiamo metanolo come agente fissativoda mantenere la distribuzione spaziale delle cellule. Comunità fissi sono infiltrati con OCT, congelati, e cryosectioned in un criostato. Imaging di fluorescenza delle sezioni rivela come l'organizzazione interna delle cellule fluorescenti all'interno della comunità.
Esempi di comunità costituite ceppi di lievito che esprimono proteine fluorescenti rosse e verdi dimostrare le potenzialità del metodo criosezionamento per rivelare la distribuzione spaziale delle cellule fluorescenti così come quella di espressione genica all'interno colonie di lievito 2,3. Anche se la nostra attenzione si è concentrata sulle comunità di Saccharomyces cerevisiae, lo stesso metodo può potenzialmente essere applicato a esaminare altre comunità microbiche.
Protocol
1. Fissaggio Comunità lievito
- Crescono comunità lievito su un filtro a membrana (ad esempio, Millipore MF membrana filtrante; Figura 2A). Questo protocollo corrisponde ad una tipica comunità inferiore a 2x10 8 celle di un millimetro di diametro 6 filtro a membrana.
- Utilizzare un pezzo di carta da filtro Whatman 541 per coprire il fondo di un diametro di 1 cm-ben (Figura 2B). Questa carta Whatman sarà utilizzato come vettore per trasferire la comunità in fasi successive. Aggiungere 1 ml di metanolo 100% al pozzo, e lasciare il pozzo a -20 ° C per la temperatura di equilibrarsi.
- N 2 liquido messo in un dewar. Congelare comunità in azoto liquido per immersione della comunità per almeno 15 secondi in un liquido N 2 utilizzando una pinzetta (Figura 2C).
- Trasferire comunità congelato al pozzo di -20 ° C metanolo (Figura 2D). Assicurarsi che la comunità sia tenuta in orizzontale quando si immerge nel metanolo.Attendere 20 min. Il filtro a membrana MF inizia a disintegrarsi in metanolo.
- Trasferire comunità utilizzando il vettore 541 carta da filtro Whatman dal metanolo bene ad un piatto freddo Petri tenuta a -20 ° C per evaporazione metanolo (Figura 2E). Durante il trasferimento, tenere la comunità sulla parte superiore del supporto filtro Whatman e pareggio ospiti gocce in più di metanolo con un altro pezzo di spessa carta Whatman prima di mettere nel piatto freddo Petri. Ciò farà sì che il tempo di evaporazione è coerente da campione a campione.
- Attendere 4-6 ore per l'evaporazione finché il supporto del filtro Whatman sembra asciutto. Evaporazione insufficiente lascia metanolo residuo che interferisce con sezionamento. Oltre ad asciugatura crepe cause e deformazioni nelle comunità.
- Prelevare il campione di congelatore a -20 ° C. Tagliare Whatman 541 carta da filtro non coperti dalla comunità.
- Fare un cubo rettangolare pellicola di alluminio contenitore che è abbastanza grande in modo tale che il campione ha almeno ~ 2 mm dal margineciascun lato (Figura 2F). Posizionare la comunità sulla superficie inferiore della pellicola di alluminio contenitore, coprire immediatamente il campione con Office per 3 ~ 4 mm al di sopra dell'altezza della comunità. Se importante, l'orientamento del campione può essere regolata in questa fase in relazione ai lati del contenitore. Attendere 10 min.
- Posizionare il PTOM-embedded campione su una piastra metallica in ghiaccio secco per congelare. Conservare le comunità congelati a -20 ° C o -80 ° C congelatore.
2. Sezionamento Comunità congelati per fluorescenza Imaging
- Impostare la temperatura della camera di cryosection a -25 ° C e lasciare i campioni nella camera finché la sua temperatura raggiunge la temperatura della camera.
- Montare il campione su un crio-mount dopo l'applicazione di una goccia di ottobre sul monte. Diffondere ottobre uniformemente sul lato del campione esposto con carta da filtro Whatman (fondo del contenitore) in modo che lo spessore ottobre è 2-3 mm. Lasciate congelare ottobre all'interno della camera di criostato prima sezionamento. Garantire un margine ottobre di 2-3 mm su tutti i lati del campione contribuisce a preservare l'integrità delle sezioni.
- I lati del blocco campioni ottobre può essere utilizzato per allineare il campione. Se il campione non è allineato rispetto alla lama, sezionamento inizia da un angolo o lato del campione. Regolare il montaggio in modo che la lama taglia perfettamente verticale (o orizzontale) faccia del blocco campione.
- Sezioni tipiche per le comunità di lievito sono ~ 14 micron di spessore. Dopo il taglio di una sezione, utilizzare un vetrino conservato a temperatura ambiente per raccogliere sezione, lentamente avvicinando la slitta nella sezione di taglio. La sezione si scioglierà e trasferimento al vetrino da microscopio. Fino a 18 sezioni possono essere trasferiti su una diapositiva.
- Conservare i vetrini a basse temperature, preferibilmente -20 ° C, prima di imaging. Perdita di segnale è minimo quando conservata per una settimana a 4 ° C. Per il massimo segnale di fluorescenza, l'imaging è preferibilmente effettuata subito dopo il sezionamento.
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Representative Results
Immagini di fluorescenza di sezioni verticali delle comunità lievito contenenti rosso o verde etichettato popolazioni competitivi 6 sono mostrati nella Figura 3. Queste comunità sono costituiti da due ceppi di lievito e prototrofici loro competizione per risorse condivise, incluso lo spazio, porta a colonnare modelli 7, come mostrato nelle sezioni verticali. Risoluzioni fino a una singola cellula può essere risolto in sezioni. Figura 3 confronta sezioni delle comunità replicati ottenuta con (in basso) e senza (top) metanolo-fissaggio, seguendo i protocolli in Figura 1. Per criosezionamento comunità lievito senza fissare, che il protocollo è seguito a partire dal punto 1.8. Il segnale di fluorescenza è conservato nelle sezioni della comunità senza fissare, ma l'integrità della comunità è compromessa. Come risultato: (1) alcune cellule fluttuare attorno al bordo della sezione, e (2) il complesso yiELD (vale a dire, frazione di sezioni non turbato da artefatti della procedura di sezionamento) è più bassa rispetto alle comunità fisse.
La figura 4 mostra rappresentativi in campo chiaro e fluorescenza verticali sezioni trasversali di una comunità lievito. Le cellule sulla parte superiore del modulo di comunità una corona che appare distinto da altre cellule caratterizzate da forte dispersione della fluorescenza in campo chiaro e luminoso. Questi modelli sono coerenti con i modelli riportati di differenziazione nelle colonie di lievito 4.
Figura 1. Diagramma di flusso della procedura tipica per criosezionamento comunità con lievito (sinistra) e senza (destra) di fissaggio.
Figura 2.
Figura 3. Immagini rappresentative di fluorescenza di sezione verticale di replicate comunità lievito cresciute in condizioni identiche sono indicati senza (in alto) e con (in basso) metanolo-fissaggio. La comunità è composto da due ceppi di S. cerevisiae prototrofici con etichetta mCherry e yEGFP proteine fluorescenti 7. Senza fissaggio, le cellule non sono legati tra loro e possono volare via o riorganizzare durante il sezionamento. Metanolo di fissazione permette alle cellule di comunità insieme, ma provoca una riduzione osservata nella differenza tra la comunità altezze (media%).
Figura 4. Rappresentativa in campo chiaro (superiore) e di fluorescenza (basso) immagini di sezione verticale di una comunità lievito sono mostrati. La comunità è composto da due ceppi di S. cerevisiae prototrofici con etichetta proteine fluorescenti DsRed e YFP 7.
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Discussion
La procedura qui presentata offre un modo per controllare la struttura interna delle comunità lievito. La fase di fissaggio metanolo rende la colonia di lievito rigido 8 e preserva l'integrità della colonia, tuttavia, causa anche restringimento 8 che deve essere preso in considerazione nell'interpretazione dei risultati. Noi di solito vedere circa il 30% in altezza ritiro delle colonie di lievito, rispetto alle colonie direttamente incorporati nei PTOM senza fissare 9.
Per evitare il restringimento, un approccio alternativo per criosezionamento è di incorporare direttamente le comunità PTOM e congelarli. Fluorescenza è conservato nel metodo basato sulla costruzione diretta, ma lo svantaggio è che le cellule all'interno di ogni sezione non sono legate insieme. Come risultato, alcune delle celle ai bordi della sezione galleggiante di distanza, e le sezioni sono più probabilità di soffrire disturbi nel processo di sezionamento (Figura 4). Sebbene non si concentra sullare, in campo chiaro immagini di sezioni trasversali delle comunità lievito può anche fornire informazioni utili sullo stato di cellule all'interno della comunità 9. Se la proprietà di interesse è influenzata dal passaggio di fissaggio deve essere esaminata caso per caso.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Jonathan Cooper Lab Research Fred Hutchinson Cancer Centro per il permesso di usare il loro criostato. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH e il WM Keck Foundation. BM è un collega Gordon and Betty Moore Foundation di Life Science Research. Siamo grati a Daniel Gottschling per aver condiviso il suo protocollo di fissaggio con noi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
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