Summary
Vi presenterer en protokoll for frysing og cryosectioning gjær samfunn for å observere interne mønstre av fluorescerende celler. Metoden baserer seg på metanol-innfesting og OCT-innebygging for å bevare den romlige fordelingen av celler uten å inaktivere fluorescerende proteiner i et fellesskap.
Abstract
Mikrober vanligvis lever i lokalsamfunn. Den romlige organisering av celler innenfor et fellesskap antas å påvirke overlevelse og funksjon av fellesskap 1. Optiske seksjonering teknikker, inkludert confocal og to-foton mikroskopi, har vist seg nyttig for å observere romlige organiseringen av bakterie-og archaeal samfunn 2,3. En kombinasjon av confocal avbildning og fysisk seksjonering av gjær kolonier har avdekket interne organiseringen av celler 4. Imidlertid har direkte optisk seksjonering hjelp confocal eller to-foton mikroskopi vært bare i stand til å nå et par cellelagene dypt inn gjær koloniene. Denne begrensningen er sannsynlig på grunn av sterk spredning av lys fra gjærceller 4.
Her presenterer vi en metode basert på å fikse og cryosectioning å få romlige fordelingen av fluorescerende celler innenfor Saccharomyces cerevisiae lokalsamfunn. Vi bruker metanol som fiksativ middelå bevare den romlige fordelingen av celler. Faste samfunn er infiltrert med oktober sammensatte, frossen, og cryosectioned i en kryostaten. Fluorescens avbildning av seksjonene avslører den interne organiseringen av fluorescerende celler i samfunnet.
Eksempler på gjær samfunn bestående av stammer som uttrykker røde og grønne fluorescerende proteiner demonstrere mulighetene til cryosectioning metode for å avsløre den romlige fordelingen av fluorescerende celler samt at av genuttrykk i gjær koloniene 2,3. Selv om vårt fokus har vært på Saccharomyces cerevisiae lokalsamfunn, kan samme metode potensielt brukes til å undersøke andre mikrobielle samfunn.
Protocol
1. Fixing Gjær Communities
- Grow gjær samfunn på et membranfilter (f.eks Millipore MF membranfilter, figur 2A). Denne protokollen tilsvarer en typisk fellesskap av mindre enn 2x10 8 celler i et 6 mm-diameter membranfilter.
- Bruk et stykke Whatman 541 filterpapir til å dekke bunnen av en 1 cm diameter brønn (figur 2B). Dette Whatman papir vil bli brukt som en bærer for å overføre fellesskapet i senere faser. Tilsett 1 ml 100% metanol til brønnen, og la brønnen i -20 ° C for at temperaturen skal stabilisere.
- Put væske N 2 i en Dewar. Frys fellesskap i flytende nitrogen ved å dyppe fellesskapet i minst 15 sek i flytende N 2 ved hjelp av en pinsett (figur 2C).
- Overfør frossen fellesskap til brønnen på -20 ° C metanol (figur 2D). Sørg for at samfunnet blir holdt vannrett når submerging den i metanol.Vent 20 min. MF membranfilter begynner å gå i oppløsning i metanol.
- Overfør fellesskap hjelp bæreren Whatman 541 filterpapir fra metanol godt til en kald petriskål holdt ved -20 ° C i metanol fordampning (figur 2E). Ved overføring, holde samfunnet på toppen av transportør Whatman filter og trekke bort ekstra dråper metanol med en annen stykke tykt Whatman papir før du setter i kulden petriskål. Dette vil sikre at fordampning tid er forenlig fra prøve til prøve.
- Vente 4-6 timer for fordampning inntil bæreren Whatman filteret ser tørr. Utilstrekkelig fordampning etterlater rester metanol som forstyrrer snitting. Over-tørking årsaker sprekker og deformasjoner i lokalsamfunn.
- Ta prøven ut av -20 ° C fryser. Skjær bort Whatman 541 filterpapir ikke dekkes av fellesskapet.
- Lag en rektangulær kubisk aluminiums-folie beholder som er stor nok slik at prøven har minst ~ 2 mm marg frahver side (figur 2F). Plasser samfunnet på bunnflaten av aluminium-folie beholder, dekk straks prøven med oktober til 3 ~ 4 mm over fellesskap høyde. Dersom viktig, kan orienteringen av prøven justeres i dette trinnet med hensyn til sidene av beholderen. Vent 10 min.
- Plasser OCT-embedded prøven på en metallisk plate på tørris til å fryse. Oppbevar frosne miljøene ved -20 ° C eller -80 ° C fryser.
2. Seksjonering Frosne Communities for Fluorescence Imaging
- Sette temperaturen cryosection kammer til -25 ° C og la prøvene i kammeret inntil dens temperatur når temperaturen av kammeret.
- Monter prøven på en Cryo-mount etter at en dråpe av OCT på fjellet. Spre oktober jevnt på siden av prøven med eksponert Whatman filterpapir (bunnen av beholderen), slik at oktober tykkelse er 2-3 mm. La oktober fryse inne i kryostaten kammeret før sectioning. Sikre en OCT-margin på 2-3 mm på alle sider av prøven bidrar til å bevare integriteten til seksjoner.
- Sidene av oktober prøven blokken kan brukes til å justere prøven. Hvis prøven ikke er på linje med hensyn til bladet, vil snitting starter fra et hjørne eller side av prøven. Juster mount å sikre at bladet skjærer en aldeles vertikal (eller horisontal) flate av prøven blokken.
- Typiske seksjoner for gjær samfunn er ~ 14 mikrometer tykt. Etter kutting en seksjon, bruker et objektglass holdt ved romtemperatur for å samle den delen, ved langsomt nærmer lysbildet til skillepunktet. Seksjonen vil smelte og overføre til objektglass. Opptil 18 seksjoner kan overføres til ett lysbilde.
- Oppbevar lysbilder ved lave temperaturer, fortrinnsvis -20 ° C, før bildebehandling. Tap av signal er minimal da holdt for en uke ved 4 ° C. For maksimal fluorescens signal, er bildebehandling fortrinnsvis gjøres umiddelbart etter snitting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens bilder av vertikale tverrsnitt av gjær lokalsamfunn inneholdende rød-og grønn-tagget konkurransedyktige populasjoner 6 er vist i figur 3. Disse gruppene består av to prototrofe stammer av gjær og deres konkurranse for delte ressurser, inkludert plass, fører til søyleformede 7 mønstre, som vist i deres vertikale tverrsnitt. Oppløsninger ned til en enkelt celle kan løses i tverrsnitt. Figur 3 sammenligner tverrsnitt av gjentatte samfunn oppnådd med (nederst) og uten (øverst) metanol-innfesting, etter protokollene i Figur 1. For cryosectioning gjær samfunn uten festing, er protokollen følges fra trinn 1.8. Fluorescens signalet er bevart i samfunnet seksjoner uten feste, men integriteten i samfunnet er kompromittert. Som et resultat: (1) enkelte celler flyte bort rundt kanten av delen, og (2) det samlede yield (dvs. brøkdel av deler ikke opprørt av gjenstander av seksjonering prosedyren) er lavere i forhold til faste lokalsamfunn.
Figur 4 viser representative lyse felt og fluorescens vertikale tverrsnitt av en gjær fellesskap. Celler på toppen av samfunnet skjemaet en krone som vises forskjellig fra andre celler preget av sterkere spredning i lyse-feltet og lysere fluorescens. Disse mønstrene er i samsvar med rapporterte mønstre av differensiering i gjær koloniene 4.
Figur 1. Flytskjema for den vanlige prosedyren for cryosectioning gjær lokalsamfunn med (til venstre) og uten (høyre) feste.
Figur 2.
Figur 3. Representative fluorescens bilder av vertikalt tverrsnitt av replicate gjær samfunn dyrket under identiske forhold er vist uten (øverst) og med (nederst) metanol-feste. Samfunnet består av to prototrofe stammer av S. cerevisiae merket med mCherry og yEGFP fluoriserende proteiner 7. Uten feste, er cellene som ikke er bundet sammen og kan flyte bort eller omorganisere under snitting. Metanol-innfesting holder samfunnet cellene sammen, men fører krymping som observert i forskjellen mellom samfunnet høyder (% gjennomsnitt).
Figur 4. Representative lyse-feltet (øverst) og fluorescens (nederst) bilder av vertikalt tverrsnitt av en gjær fellesskap vises. Samfunnet består av to prototrofe stammer av S. cerevisiae merket med dsRed og YFP fluoriserende proteiner 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyren som presenteres her tilbyr en måte å inspisere den interne strukturen av gjær lokalsamfunn. Metanolen fikse trinnet gjør gjær kolonien stive 8 og bevarer integriteten av kolonien, men det fører også til krymping 8 som bør tas hensyn til i å tolke resultatene. Vi vanligvis ser rundt 30% svinn i høyden av gjær kolonier, sammenlignet med kolonier direkte innebygd i OCT uten å rette 9.
For å unngå svinn, er en alternativ tilnærming for cryosectioning å direkte legge samfunnene i oktober og fryse dem. Fluorescens er bevart i metoden basert på direkte embedding, men ulempen er at cellene i hver enkelt seksjon er ikke bundet sammen. Som et resultat, noen av cellene langs kantene av delen flyte bort, og delene er mer sannsynlig at lider forstyrrelser i snitting prosessen (figur 4). Selv om det ikke fokusert på hanre, kan lyse-feltet bilder av tverrsnitt av gjær lokalsamfunn også gi oss nyttig informasjon om tilstanden av celler i samfunnet ni. Hvorvidt eiendommen av interesse påvirkes av feste steg må bli undersøkt på en sak-til-sak basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Jonathan Cooper Lab ved Fred Hutchinson Cancer Research Center for tillatelse til å bruke deres kryostaten. Dette arbeidet ble støttet av NIH og WM Keck Foundation. BM er en Gordon og Betty Moore stipendiat of Life Science Research Foundation. Vi er takknemlige for Daniel Gottschling for å dele sin festing protokollen med oss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
