Summary
Biz floresan hücrelerin iç kalıplarını gözlemlemek maya topluluklar donma ve cryosectioning için bir protokol mevcut. Yöntem metanol-sabitleme dayalıdır ve bir topluluk içinde floresan proteinleri inaktive olmadan hücrelerinin mekansal dağılımını korumak için OCT-katıştırma.
Abstract
Mikroplar genellikle topluluklar yaşıyor. Bir topluluk içinde hücrelerin mekansal organizasyon topluluğu 1 hayatta kalma ve fonksiyon etkisi olduğuna inanılmaktadır. Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Optik kesit teknikleri, bakteri ve arke topluluklarının 2,3 mekansal organizasyon gözlemlemek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Konfokal görüntüleme ve maya kolonileri fiziksel kesit kombinasyonu hücreleri 4 iç organizasyonu ortaya koymuştur. Ancak, konfokal veya iki foton mikroskopi kullanılarak doğrudan optik kesit maya kolonileri içine derin bir kaç hücre tabakaları ulaşmak için sadece mümkün olmuştur. Bu sınırlama nedeniyle maya hücreleri 4 ışık güçlü saçılma muhtemeldir.
Burada, sabitleme ve Saccharomyces cerevisiae topluluklar içinde floresan hücrelerin mekansal dağılımını elde etmek için cryosectioning dayalı bir yöntem sunuyoruz. Biz sabitleştirici ajan olarak metanol kullanımıhücrelerinin mekansal dağılımını korumak. Sabit topluluklar Kriyostaz OCT bileşiği, dondurulmuş ve cryosectioned ile infiltre edilir. Bölümlerin Floresans görüntüleme toplum içinde floresan hücrelerin iç organizasyonunu ortaya koymaktadır.
Kırmızı ve yeşil floresan protein eksprese eden maya suşu oluşan toplulukların örnekleri de mantar kolonileri 2.3 içinde gen ekspresyonunun bu gibi floresan hücrelerinin uzaysal dağılımının ortaya çıkarmak için cryosectioning yöntem potansiyellerini göstermek. Bizim odak Saccharomyces cerevisiae topluluklar olmuştur rağmen, aynı yöntem potansiyel olarak diğer mikrobiyal topluluklar incelemek için uygulanabilir.
Protocol
1. Maya Topluluklar Tespit
- Bir membran filtreden (; Şekil 2A, örneğin Millipore MF membran filtre) mayaya topluluklar büyütün. Bu protokol, bir 6 mm çapındaki membran filtre üzerinde daha az 2x10 8 hücrelerin, tipik bir topluluk karşılık gelir.
- Iyi bir 1 cm çaplı (Şekil 2B) alt kapak 541 Whatman filtre kağıdı parçası kullanın. Bu whatman kağıt sonraki aşamalarda topluluk aktarmak için bir taşıyıcı olarak kullanılacaktır. De 1 ml% 100 metanol ekleyin ve dengelemek için sıcaklık -20 ° C de bırakın.
- Bir Dewar sıvı N 2 koyun. Sıvı içinde en az 15 saniye boyunca topluluk daldırma N 2 bir cımbız (Şekil 2C) kullanılarak sıvı azot içinde topluluk dondurun.
- -20 ° C metanol (Şekil 2B) ve de dondurulmuş topluluk aktarın. Metanol içinde batış zaman toplumun yatay tutulur emin olun.20 dakika bekleyin. MF Membran filtre metanol içinde parçalanmaya başlar.
- De metanol buharlaşma (Şekil 2E) için -20 ° C'de muhafaza soğuk bir Petri kabı metanol topluluk taşıyıcı kullanılarak Whatman 541 filtre kağıdı aktarın. Aktarırken, taşıyıcı whatman filtrenin üstüne topluluk tutmak ve soğuk Petri kabı koymadan önce kalın whatman kağıt başka bir parça kullanılarak metanol ilave damla uzaklaştıracağım. Bu buharlaşma süresi numuneden numuneye tutarlı olmasını sağlayacaktır.
- Taşıyıcı whatman filtre kuru görünüyor kadar buharlaşma için 4-6 saat bekleyin. Yetersiz buharlaşma kesit engelleyen kalıntı metanol bırakır. Topluluklarda nedenler çatlak ve deformasyon üzerinde kuruyan.
- -20 ° C dondurucu örnek çıkarın. Toplum tarafından kapsanmayan whatman 541 filtre kağıdı kesip.
- Numune en az ~ 2 mm kenar var böyle büyüklükte bir dikdörtgen küp alüminyum folyo konteyner Yapher iki tarafında (Şekil 2F). Alüminyum folyo konteyner alt yüzeyinde topluluk yerleştirin; hemen 3 OCT ile örnek ~ topluluk yüksekliği yukarıda 4 mm kapsamaktadır. Önemli ise, örnek yönünü kabın yanlarına ile ilgili olarak, bu adımda ayarlanabilir. 10 dakika bekleyin.
- Dondurmak için kuru buz üzerinde metal bir plaka üzerinde OCT-gömülü örneği yerleştirin. -20 ° C veya -80 ° C derin dondurucu da donmuş topluluklar saklayın.
2. Floresans Görüntüleme için Dondurulmuş Toplulukları Kesit
- -25 ° C ila cryosection odasının sıcaklığı ayarlanır ve sıcaklık odasının bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar oda içinde örnekleri bırakın.
- Montaj üzerine OCT bir damla uygulandıktan sonra kriyo-montaj üzerine numune monte edin. Ekim kalınlığı 2-3 mm olacak şekilde maruz Whatman filtre kağıdı (konteynerin alt) ile numune yan tarafında eşit Ekim yayılır. Se önce kriyostat odacıkta Ekim donma edelimctioning. Örneğin her iki tarafta 2-3 mm olan bir OCT kenar bölümleri sağlanması bütünlüğünü korumaya yardımcı olur.
- OCT örnek bloğun iki numune hizalamak için kullanılabilir. Örnek bıçağı ile ilgili olarak hizalı değilse, kesit örnek bir köşesine veya yan başlayacaktır. Bıçak örnek blok bir mükemmel dikey (veya yatay) yüz keser emin olmak için montaj ayarlayın.
- Maya topluluklar için tipik bölümler ~ 14 mikron kalınlığında vardır. Bir bölüm kestikten sonra, yavaş yavaş kesik bölümüne slaydı yaklaşarak, bölüm toplamak için oda sıcaklığında bir mikroskop slaydı kullanır. Bölümü eritmek ve mikroskop lamı transfer olacak. Dakikada 18 bölüm, bir slayttan aktarılabilir.
- Tercihen -20 soğuğa, ° C, görüntüleme önce de slaytlar saklayın. 4 ° C'de bir hafta tutulduğunda sinyal kaybı minimal Maksimum floresans sinyali için, görüntüleme tercihen kesit hemen sonra yapılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kırmızı-yeşil-etiketli rakip popülasyonları 6 içeren bira mayası toplulukların dikey kesit görüntüleri floresans Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu topluluklar, maya ve uzay gibi paylaşılan kaynaklar, onların rekabet iki Prototrofik suşlarının oluşur olarak düşey kesitleri gösterilir kolumnar desenleri 7, yol açar. Tek bir hücreye Kararları aşağı kesitlerde çözülebilir. Şekil 3 Şekil 1'de protokolleri takip ederek (alt) ve (üst) metanol-sabitleme olmadan elde çoğaltmak toplulukların kesitleri karşılaştırır. Sabitleme olmaksızın maya topluluklar cryosectioning için protokol adım 1,8 başlangıç takip edilir. Floresans sinyali düzeltmeden topluluk bölümlerde korunmuş, ancak toplumun bütünlüğünü tehlikeye. Sonuç olarak: (1) bazı hücrelere kesit kenarı boyunca uzakta yüzer, ve (2) genel olarak yisaha (yani, bölme fraksiyonu kesit prosedür eserler ile tedirgin değil) sabit toplumlara kıyasla daha düşüktür.
Şekil 4 bir maya topluluğun temsilcisi parlak alan ve floresans dikey kesitleri göstermektedir. Topluluk formu parlak alan ve parlak floresan güçlenerek saçılma ile karakterize diğer hücrelerden farklı görünen bir taç üstüne Hücreler. Bu modeller maya kolonileri 4 farklılaşma bildirilen desenleri ile tutarlıdır.
Şekil 1. Ile (solda) ve (sağda) sabitleme mayada topluluklar cryosectioning için tipik prosedür Akış Şeması.
Şekil 2.
Rep dikey kesiti Şekil 3 '. Örnek floresan görüntüleriolmadan (üstte) ve (alt) metanol-sabitleme ile gösterilir aynı koşullar altında yetiştirilen mantar topluluklar licate. Topluluk mCherry ve yEGFP floresan ile etiketlenmiş proteinleri 7 S. cerevisiae'nin iki Prototrofik suşları oluşur. Sabitleme olmadan, hücrelerin birbirine bağlı değildir ve kesit boyunca akıp veya yeniden düzenlemek olabilir. Metanol-sabitleme birlikte topluluk hücreleri tutar, ancak toplum yükseklikleri (ortalama%) arasındaki fark görüldüğü gibi büzülme neden olur.
Şekil 4,. Örnek parlak saha (üst) ve bir maya topluluğu dikey kesitinin flöresanlı (alt) görüntüleri gösterilir. Topluluk DsRed ve YFP floresan ile etiketlenmiş proteinleri 7 S. cerevisiae'nin iki Prototrofik suşları oluşur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan prosedür maya toplulukların iç yapısını incelemek için bir yol sunar. Metanol sabitleme adım 8 maya kolonisi sertleştirir ve koloninin bütünlüğünü korur, ancak aynı zamanda sonuçların yorumlanmasında dikkate alınması gerektiğini büzülme 8 neden olur. Biz genellikle, doğrudan 9 düzeltmeden OCT gömülü koloniler göre maya kolonilerinin yüksekliği yaklaşık% 30 daralma, bkz.
Çekmeyi önlemek için, cryosectioning için alternatif bir yaklaşım doğrudan OCT topluluklar katıştırmak ve bunları dondurmak için. Flüoresans doğrudan gömme göre yöntem içinde muhafaza edilmiş, ancak dezavantajı, her bölüm içindeki hücrelerin birbirine bağlı olmamasıdır edilir. Sonuç olarak, uzak bölüm şamandıra, ve bölümlerin kenarlarında bazı hücreler kesit işlem bozuklukları (Şekil 4) çekmek için daha fazladır. O odaklı olmamakla birliktere, maya toplulukların kesitleri parlak alan görüntüleri de bize topluluk 9 içindeki hücrelerin durumu hakkında yararlı bilgiler verebilir. Ilgi özelliğini sabitleme adım etkilenen olsun ya da olmasın bir vaka tarafından ayrı ayrı incelenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz onların kriyostat kullanma izni için Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi'nde Jonathan Cooper Lab teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH ve WM Keck Vakfı tarafından desteklenmiştir. BM Yaşam Bilim Araştırma Vakfı, Gordon ve Betty Moore akademisyendir. Biz bize yaptığı tespit protokolü paylaşmak için Daniel Gottschling minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
