Summary
효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.
Abstract
포유류의 고환은 체세포 고환 세포와 생식 세포의 여러 단계를 포함하여 30 개 이상의 서로 다른 세포 유형을 포함 매우 복잡한 기관이다. 이 이질성은 정자 발달의 특정 단계에서 순수한 농축 세포 인구는 대부분의 분자 분석 1 필요에 따라, 포유류의 정자의 기초 연구에 관한 중요한 단점이다.
같은 Staput 2,3, 원심 elutriation 1 및 유동 세포 계측법 등 다양한 전략 (FC) 4,5는 차동 유전자 발현 연구를 활성화하기 위해 농축 또는 정제 고환 세포 인구를 얻기 위해 사용되어왔다.
이것은 세포가 가장 농축 / 정제 방법에 대한 정학 것을 요구된다. 이상적으로, 세포 현탁액은 원래의 조직을 대표하고, 가능한 세포와 몇 multinucleates의 비중이 높은 때문에 -의 형성 경향이그리고 부족한 세포 대단히 짧은 시간 1 - 정액 상피 6,7의 세포 융합 성격. 이전 보고서는 독점적 기계적 방법에 의해 제조 고환 세포 현탁액은 트립신 사람 1보다 더 쉽게 응집 것을 입증했다. RNAses 및 / 또는 트립신 및 특정 스트림 애플리케이션에 바람직하지 않은 특정 고분자 분해에 콜라 리드와 같은 분해하는 효소 반면에, 효소 처리. 이상적인 프로세스는 mRNA가 같은 관심 고분자의 좋은 보존을 달성하기 위하여 가능한 한 짧아야하며 최소한의 조작을 포함해야한다. 단단한 조직에서 세포 현탁액의 준비를위한 현재 프로토콜은 일반적으로 시간이 걸리는 매우 연산자에 의존하고, 선택적으로 특정 세포 유형에게 1,8가 손상 될 수 있습니다.
여기에 제시 프로토콜과 높은 재현성 매우 간단한 기계 세분화의 이점을 결합유세포 분석 및 정렬 4 및 꿍꿍이 유전자 발현 연구 9에 사용할 수있는 좋은 품질의 세포 현탁액을 선도하는 효소 치료의 bsence.
Protocol
1. 세포 현탁액의 준비
- 이러한 IACUC 또는 동급으로 전문위원회의 권고에 따라 사용할 시편을 희생 (우루과이, 국가위원회의 동물 실험에 대한 [CNEA]). 우리의 경우, 펜 토바 비탈의 과량이 투여되었다.
- 표준 승인 절차에 따라 고환을 해부하고 얼음처럼 차가운 DMEM 10 ML을 포함, 얼음 96mm 유리 페트리 접시에 배치 10 % 소 태아 혈청과 보충.
- 투 니카 albuginea을 제거하고 2 사각형 조각으로 캡슐화가 고환을 잘라 - 양쪽에 3mm.
- 그 조각은 다음 Medimachine, 조직이 뚫린 스테인리스 스크린과 금속 회 전자를 포함하는 일회용 기기 내부에 세분화 된 자동 기계 분쇄기로 처리됩니다. 50 μm의 일회용 단위 disaggregator에 스위치 및 프로세스에서 이러한 조각 중 1 - 5 이렇게하려면, 감기의 장소 1 ML은 DMEM 4를 보충 제조업체의 간단한 지침에 따라 50 초합니다.
- 바늘없이 5 ML의 주사기 - 3을 사용하여 세분화 장치에서 결과 세포 현탁액을 복구 할 수 있습니다.
- 0.5 밀리리터 DMEM을 보충와 이전에 담가 50 μm의 나일론 메쉬를 통해 필터링합니다.
- 젖은 25 μm의 나일론 메쉬, 얼음에 장소를 사용하여 다시 현탁액을 필터링합니다.
- 네우 바우 챔버에서 셀을 1로 세포 농도를 조정 - 2 × 10 7 세포 / ML DMEM 배지로. 적어도 4 X 10 7 세포 / 고환 물질의 그램은 일반적으로 얻을 수 있습니다.
- 마지막으로, 세포 응집을 방지하기 위해 0.2 %의 최종 농도 (2 - 나프톨 -6,8 - 디 술폰산, 칼륨 염) NDA를 추가합니다.
- 선택 사항 : 제조업체의 지침에 따라, 동물 세포 시중에서 생존 키트와 함께 고환 세포 현탁액의 세포 생존을 확인합니다.
2. 유세포 분석
ve_content "> 우리의 propidium 요오드의 높은 농도 (PI)로 염색 세포의 분석을 위해 488 nm에서 방출하는 조정 일관된 아르곤 이온 레이저를 장착 한 벡톤 - 디킨슨 FACSVantage 흐름 cytometer에를 사용했습니다. (고정되지 않은에 PI 입구의 문제 스트레스 세포) 다른 9,10 해결되었습니다.- PI 염색을위한 50 세포 현탁액에 μg / ML의 최종 농도에서 형광을 추가하고, 0시 10 분 ° 어둠 속에서 C에 대해 품어.
- 레이저 전력은 100 mW의 및 26분의 575 밴드 패스 필터가 FL2에서 PI-방출 형광을 수집하는 데 사용됩니다로 설정됩니다.
- 우리는 70 μm의 노즐 FC 측정을 수행합니다. spermatocyte 인구를 정렬, 봉투로 3 분류 방울을 사용하여 일반-R 또는 Normal-C 모드에서 정렬을 설정합니다. 3시 샘플 및 수집 튜브를 유지 - 4 ° C에 냉동 장치를 사용하여. 초당 1,500 ~ 500의 속도로 세포를 분석 할 시료 차이를 조정합니다.
- 분석하는 CellQuest 소프트웨어 (BD)를 사용하여다음 매개 변수 : 앞으로 분산 형 (FSC-H), 측면 산란 (SSC-H), 총 방출 형광 또는 펄스 면적 (FL2-A) 및 형광 방출 또는 펄스 폭 (FL2-W)의 기간.
또한, 우리는 5 μg / ML의 최종 농도에 중요한 염료 훽스트 33342을 고용하고 37 10 분 ° 어둠 속에서 C 동안 배양했다. 세포 분석은 MoFlo cytometer에 (DakoCytomation)를 통해 25 mW의에서 UV 여기 파장 레이저 운영을 탑재 해, 70 μm의 노즐을 사용하여 수행 하였다. 데이터 조작은 정상 V4.3 소프트웨어 (DakoCytomation)로 수행 하였다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜을 준비 쥐의 고환에서 잘 분해 된 세포 현탁액의 예는 그림 1에 표시됩니다.
효소 치료 6,8에 이전에 설명한 기계 세분화 방법 2에 비해, 여기에 제시 한 (특히 다른 기계에 비해 훨씬 빠릅니다 적은 처리를 포함, (NOT 연산자에 의존) 쉽게 재현하고 부족한 세포 파편을 렌더링 방법)과 거의 multinucleates (광범위한 조직 조작 1,2의 결과로 형성하는 기술되었다)입니다. 또한, 효소 처리에 반대하는, 그것은 거대 분자에게 분해를 선호 할 수 RNAses, 트립신 및 콜라게나 제의 사용을 피한다.
반면에, 비록 이전의 보고서는 독점적 기계적 방법에 의해 제조 고환 세포 현탁액에 트립신보다 더 쉽게 응집 것을 입증했다에스 1, 본 발명의 방법의 응용 프로그램은 그림 1에서 볼 수 있듯이 아주 작은, 세포 현탁액의 응집 렌더링합니다. 그런 의미에서, 우리는 세포의 응집을 방지하고, 이후의 흐름 공부하는 동안 막힘 노즐을 피하는 NDA의 포함은 매우 효율적인 발견했다. 그림 1은 또한 그림 2 FC 히스토그램도 분명 세포 파편의 부족을 보여준다.
게다가,이 방법으로 제조 세포 현탁액은 다른 고환 세포 유형의 적절한 표현을 보여줍니다. 이 정액을 운반하는 tubules에의 단면에서 세포 수에서보고 데이터를 여기에 제시된 방법에 의해 제조 고환 세포 현탁액의 세포 구성을 비교하여 결론 세포 현탁액과뿐만 아니라 다른 방법 (표 1)를 사용하여 제조 하였다.
FC 히스토그램은 prese에 의해 제조 정지 얻어NT 프로토콜과 훽스트 33342 (그림 2A) 또는 PI (그림 2B)와 하나 염색은 실질적으로도 절차가 선택적으로 특정 세포 유형을 손상하지 않는 가정을 지원, 이전에보고 된 것들 8 다르지 않다.
| DNA 내용에 따라 고환 세포 유형 | 그대로 고환 (%) | Medimachine - 준비된 현탁액 B (%) | (%) 트립신 정지 |
| A) 뮤스 musculus | |||
| C | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ TD> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| 기타 | - | - | 4.6 |
| B) 텐지 쿠 네즈 미 porcellus | |||
| C | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| 세포 수는 현미경 관찰에 의해 평가되었다. B 세포 계수는 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다. | |||
표 1. 마우스 - - 마우스 (A)와 그대로 고환과 비교하여 이에 제시된 방법에 의해 제조 기니 돼지 (B)에서 세포 현탁액에 대한 자신의 DNA 함량이 다른 성인 고환 세포 인구의 상대적 비율 t(Geisinger의와 로드리게스 - Casuriaga, Cytogenet에서 수정되었습니다. 게놈 학회지. 128, 46 (2010)) ㅇ 트립신 준비된 현탁액. DNA 내용은 다음과 같습니다 C (라운드와 길게하는 spermatids, 정자), 2C (고환 체세포, 정조 세포, 정모 세포 보조) 및 4C (주 정모 세포와 G2 단계에서 몇 증식 정조 세포).
그림 1. 본 프로토콜에 의해 준비 위상 콘트라스트 현미경으로 시각 성인 쥐의 고환에서 세포 현탁액의 부분보기. 볼 수 있듯이, 세포의 세포질이 잘 보존됩니다. 바는 25 μm의에 해당합니다. 로드리게스-Casuriaga, 외., BIOL에서 재생. Proced. 온라인. 11, 184 (2009).
그림 2. 성인 쥐, 쥐, 기니피그, 및 중요한 염료 훽스트 33342 (A) 또는 PI와 (B)로 염색 이십일일 게시물 출산 (DPP) 쥐 새끼에서의 고환 세포 현탁액의 FC DNA 함량 분석. 모든 경우 C, 2C 및 4C 세포 인구는 쉽게 두 염료뿐만 아니라, C 인구의 왼쪽에 분명히 하위 반수체 피크 얻은 히스토그램에 공개 할 수 있습니다. 이 후자의 피크들은 응축 된 염색질 상태 12에 따라 별도의 작은 스테인드 모집단으로 표시 정자를 포함하는 입증되었습니다. 모든 그래픽 파편의 부족을 확인합니다. 이 spermatids과 정자 부족 21 DPP (청소년 표본) 프로파일에서 특히 분명하다. Geisinger의와 로드리게스 - Casuriaga, Cytogenet에서 수정. 게놈 학회지. 128, 46 (2010). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 4C 세포 인구는 성인 쥐의 고환 세포 현탁액의 분류. 정렬 세포는 깨끗한 폴리-L-라이신 처리 슬라이드에 입금하고 Giemsa 염색 (B) 후 위상차 현미경 (A) 또는 시야에서 관찰되었다. 바 = 20 μm의. Geisinger의와 로드리게스 - Casuriaga, Cytogenet에서 재생. 게놈 학회지. 128, 46 (2010).
tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg "/>
. 프로토콜을 준비 성인 기니 돼지 고환 세포 현탁액의 그림 4) FC 분석은 여기에 설명 (A), 히스토그램,. (B), 도트 플롯. 4C 세포 인구에서 두 개의 모집단을합니다. 분류 4C의 R3의 세포 (A, B)와 R4 ( 'B') 지역의 B) 분석. (A, A ')의 epifluorescence에 현미경 이미지 PI 염색 세포 . R3 지역에서 핵이 비교적 작다합니다. 바 : 10 μm의 (B, B '), Sycp3에 대한 항체를 사용하여 스프레드 세포에 대한 면역 세포 반응의 레이저 공 초점 현미경 (Synaptonemal 복잡한 [SC] 단백질 3, 측면 요소 요소).. R4는 pachytene meiocytes을 포함하는 동안 그림은 COM에, R3 부분은 간단한 축과 SC의 짧은 펼쳐진 볼 수있는 초기 (lepto / 접합기에 이어지는시기로) meiocytes에 해당하는 결론을 수완전히 SC의 조립. 로드리게스-Casuriaga, 외., 세포 계측법에서 수정. 79, 625 (2011). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 정자 흐름 분류 세포 분획 2C, R3와 R4 (두 번째 분획에 대한 설명은 그림 4에있다)에서 추출한 총 RNA를의) 아가로 오스 겔 전기 영동. 세포 현탁액은 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 제조 하였다. 변성의 B) Autoradiogram은 키트 프라이머 조합 중 하나, "mRNA의 차이 표시"방법 (GenHunter 공사, 내슈빌, 테네시 RNAimage)에 의해 얻어진 미분의 cDNA 밴드를 보여주는 폴리 아크릴 아미드 전기 영동 젤. 에서와 같은 세 가지 세포 집단에서의 mRNA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 최적화 방법은 효소 세제 치료를 피하고 좋은 세포 무결성 및 유형 비율을 유지, 매우 빠르고 재현성 방식으로 쥐 고환 조직에서 세포 현탁액의 준비를 할 수 있습니다. 절차 (15 분 스팬 고환 해부, 조직의 절단 및 가공 포함), 관련 최소한의 처리 및 효소 치료의 부재의 간결함은 주요 장점 중 일부입니다. 이러한 모든 원래의 세포 인구에 존재하는 물질의 대표 샘플이 필요할 때 중요한 짧은 인생 고분자의 좋은 보존을 차지한다.
PI 또는 훽스트 33342 하나의 사용에 관하여, 우리는 하나 또는 다른 염료의 고용과 고환 세포 현탁액의 유세포 분석 결과 프로파일에는 분명 차이를 관찰했다. 염료의 선택이 아니라 사용자의 기본 설정와 availabilities에 따라, 그리고 것계획 추가 사용합니다. 한 측면에서, PI는 저렴하고 광범위한 응용 프로그램의 같은 흐름 cytometers 및 UV 레이저를 갖는 분류기의 사용을 요구하지 않습니다. 다른 한편으로, 우리는 성공적으로 낮은 세포 독성 수준 숨은 정렬 및 차동 유전자 발현 연구 (그림 4), 훽스트 33342 또는 다른 중요한 염료 PI 염색 세포를 사용하고 있지만, 전체 세포 생존 능력이 요구되는 애플리케이션을위한 바람직한 선택이 될 수 배아 세포 배양 및 / 또는 이식 4 등.
우리는 심지어 같은 DNA 함량하지만 서로 다른 염색질의 응축 수준 (그림 4)와 모집단에 대해 서로 다른 DNA 함량 4 (그림 3)을 선택한 고환 집단을 위해 또는 95 % 이상의 순도를 달성 특정 세포 집단을 분류 할 수 있었다. 관심 모집단은 유세포 프로필에 개별화 할 수있는 후자는 PA는 오랫동안 수행 할 수 있습니다rticularly 도트 플롯합니다. 예를 들어, 지금까지 우리는 기니피그 meiocytes I 9의 여러 단계를 정렬 할 수 있었지만, 단순히 DNA를 염색 2C 인구 내에서 모집단을 구별하고 정렬 할 수 없습니다. 정렬 세포는 하류 차동 유전자 발현 분석 9 (그림 5)을 허용, 좋은 품질의 RNA를 렌더링했다.
프로토콜의 설명에서 볼 수 있듯이, 그것은 쉽게 재현 매우 간단하고, 특히 숙련 된 인력을 필요로하지 않습니다. 우리는 그것이 유동 세포 계측법 여부를 포함한 다양한 애플리케이션에 채택 할 수 있습니다 좋습니다. 정자 사전의 신속한 검사를위한 간단한 고환 내용 분석에서 분취 다른 사람에 전 범위는 여기에 표시된대로, 같은 불순한 분자 연구를위한 특정 세포 집단의 흐름을 정화로 목표로하고있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 CSIC (I + D 프로젝트 C022)와 PEDECIBA에 의해 지원되었다. 저자는 조심스럽게이 프로젝트에 사용되는 모든 기니 돼지 표본을 제공하기 위해 MoFlo 셀 분류기, 그리고 메리 - 몬테비데오에 관한 그들의 관대 한 협업 세포 생물학 장치 (파스퇴르 연구소 드 몬테 비디오)에서 마리엘라 Bollati와 발렌 포로 감사드립니다. 그림 1 그림 2와 3, S. Karger AG, 바젤의 권한 표 1; BioMed 본부의 허가를 재현하고 그림 4와 5는 존 와일리 & 선즈, Inc의 (에 의해 소유 저작권 허가를 복제하거나 적응했다 와일리 - 블랙웰, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
