Summary
लार्वा zebrafish अग्रमस्तिष्क में बाह्य क्षेत्र क्षमता रिकॉर्ड के लिए एक सरल विधि का वर्णन है. विधि एक मजबूत प्रदान करता है
Protocol
1. अंडा उत्पादन और संग्रह
- Zebrafish कृषिकर्म मानक पहले 8 वर्णित प्रक्रियाओं का अनुसरण करता है. संक्षेप में, वयस्क zebrafish जगह में डिवाइडर के साथ टैंक के प्रजनन में स्थापित कर रहे हैं. जब कमरे में रोशनी निम्नलिखित सुबह पर आते हैं, डिवाइडर प्रजनन टैंक और मछली undisturbed संभोग के समय के लगभग 20 से 60 मिनट की अनुमति दी जाती है से हटा रहे हैं.
- प्रजनन टैंक से अंडे एक झरनी में एकत्र कर रहे हैं और अंडे पानी से rinsed. अंडे तो अंडे पानी के साथ एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. हस्तांतरण विंदुक का उपयोग unfertilized अंडे और मलबे को हटा रहे हैं.
- प्लेस पेट्री डिश एक मशीन में एकत्र अंडे (28-32 डिग्री सेल्सियस) से युक्त है. बाद अंडे पोस्ट निषेचन (DPF) दो दिनों के चारों ओर पक्षियों के बच्चे, एक हस्तांतरण विंदुक के साथ गर्भवष्ट और किसी भी अन्य मलबे को हटा दें.
- वांछित दिन पर पोस्ट निषेचन (3 8 DPF) पेट्री डिश युक्त आज़ादी तैराकी लार्वा और कमरे के तापमान पर प्रयोगशाला बेंच पर जगह हटा दें.
- एक micropipette डांड़ी का प्रयोग खींच, एक 1.2 मिमी आयुध डिपो borosilicate ग्लास मूर्ख पोटीन रैंप पर बिछाने के दो और सुइयों की दुकान में एक 150 मिमी पेट्री डिश या खाली विंदुक बॉक्स में केशिका. सुई अग्रिम में खींचा जा सकता है. विभिन्न आयुध डिपो कांच capillaries प्रवर्धक उपलब्ध headstage के प्रकार पर निर्भर करता है इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कोशिकी रिकॉर्डिंग (2 एम NaCl) समाधान एक Nalgene सिरिंज (4 मिमी) फिल्टर और MICROFIL रेशा (वार्नर प्रेसिजन उपकरण) संलग्न के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर के साथ Backload microelectrode. शेक या सुई टिप की ओर सांस नल जब तक वहाँ कुछ या कोई शेष बुलबुले हैं.
3. अग्रवाल में स्थिरीकरण
- 1.2% अंडे पानी में कम पिघलने बिंदु अगर एक ताजा समाधान तैयार. एक पानी स्नान सेट में ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेस अगर समाधान
- रिकॉर्डिंग कक्ष और फ्रीजर में जगह (5-10 मिनट) के साथ एक coverslip तैयार. रिकॉर्डिंग कक्ष matc चाहिएज कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग पर प्रयोग किया जाता है. हम वार्नर उपकरण (मॉडल RC-26GLP) से एक कम प्रोफ़ाइल खुला हीरा स्नान इमेजिंग कक्ष का उपयोग.
- पाश्चर या हस्तांतरण विंदुक, जगह एक अंडा पानी की एक साफ पेट्री डिश प्लेट में एक छोटे से छोटी बूंद लार्वा zebrafish का उपयोग. इस छोटी बूंद के लिए, (0.02% tricaine) संवेदनाहारी और paralyzing एजेंट (1 मिलीग्राम / एमएल α bungarotoxin) युक्त समाधान की एक छोटी बूंद जोड़ने.
- आंदोलन के नुकसान (5 से 10 मिनट) के लिए zebrafish मॉनिटर.
- Coverslip / फ्रीजर से रिकॉर्डिंग कक्ष निकालें. एक stereomicroscope के मंच पर चैम्बर रखें. एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, छोटी बूंद और स्थानांतरण कक्ष / coverslip रिकॉर्डिंग समाधान (मछली के साथ) के साथ 1.2% कम पिघलने बिंदु agarose के कई मिलीलीटर मिश्रण.
- एक विंदुक टिप या ठीक कुंद सुई, इतना है कि मछली के पृष्ठीय पहलू agarose जेल सतह से अवगत कराया है stereomicroscope तहत स्थिति लार्वा का उपयोग. कठोर (5-10 मिनट) agarose की अनुमति दें, तो एक फ्लैट रंग हस्तांतरण अगर ख का उपयोगएक रिकॉर्डिंग एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग पर स्थापित चैम्बर के लिए ताला.
3. कोशिकी क्षेत्र रिकॉर्डिंग
- रिकॉर्डिंग कक्ष zebrafish रिकॉर्डिंग मीडिया के 2-5 मिलीलीटर जोड़ें. अगर दवा में परिवर्तन के लिए आवश्यक है, लगभग 1 मिलीग्राम / मिनट की दर पर रिकॉर्डिंग समाधान के साथ छिड़कना कक्ष हैं. रिकॉर्डिंग समाधान का कोई oxygenation आवश्यक है.
- एम्पलीफायर एक तीन आयामी micromanipulator पर घुड़सवार headstage में एक microelectrode (लगभग 1 सुक्ष्ममापी टिप व्यास, MΩ 2-7) डालें. जाँच करें कि micromanipulator एक उचित आंदोलन और समायोजन की एक श्रृंखला के लिए अनुमति देने की स्थिति में है. Microelectrode टिप माइक्रोस्कोप के देखने के विमान, मंच से अधिक है, और मोटे समायोजन का उपयोग करने के लिए एक बस ऊपर और थोड़ा zebrafish की सिर के सामने बात करने के लिए कम में लाओ.
- "वर्तमान दबाना" शून्य मोड इलेक्ट्रोड में एम्पलीफायर के साथ.
- मोटे समायोजन कम इलेक्ट्रोड टिप का उपयोग इतना है कि यह सिर्फ छू लेती हैअग्रमस्तिष्क के सामने थोड़ा zebrafish की urface.
- ठीक समायोजन कदम का उपयोग इलेक्ट्रोड टिप अग्रिम जब तक यह zebrafish की त्वचा punctures. व्यवस्थित करने और उसके बाद इलेक्ट्रोड अग्रिम अग्रमस्तिष्क में microns कई की अनुमति दें.
- वर्तमान दबाना Axoscope सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मोड में बिजली की गतिविधि रिकार्ड. डेटा kHz 10 का एक नमूना दर पर हासिल कर रहे हैं.
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Representative Results
Electrographic जब्ती की तरह एक अग्रवाल एम्बेडेड zebrafish लार्वा की अग्रमस्तिष्क में दर्ज निर्वहन के उदाहरण चित्र 1 में दिखाया जाता है. या 1 मिमी picrotoxin (बी में, 8 DPF), बड़े आयाम बहु कील इन नमूनों में फट मुक्ति एक आक्षेपक दवा के स्नान के लिए आवेदन पत्र, 40 मिमी pilocarpine (6 DPF में) द्वारा पैदा किया गया था. इन रिकॉर्डिंग में स्थिर है, और अगर एम्बेडेड zebrafish लगातार 90 मिनट तक के लिए निगरानी कर रहे हैं. मछली इन रिकॉर्डिंग की शर्तों के तहत 24 घंटे तक के लिए व्यवहार्य रहते हैं. ड्रग्स स्नान मध्यम और सामान्य रूप से करने के लिए 30 से 45 मिनट के भीतर लार्वा zebrafish अग्रमस्तिष्क में गतिविधि बटोर अगर में फैलाना जोड़ रहे हैं. इस विधि लार्वा के रूप में दवा समाधान की अपेक्षाकृत छोटी मात्रा में (2-5 मिलीलीटर) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है निरंतर छिड़काव की आवश्यकता नहीं है और यदि आवश्यक हो तो एक स्थिर स्नान विन्यास में दर्ज किया जा सकता है. पैनल सी में एक सहज फट निर्वहन 3 DPF में आनुवंशिक रूप से संशोधित zebrafish के लिए दिखाया गया है, रिकॉर्डिंग zebrafish में बनाया गया थारिकॉर्डिंग मीडिया. Morpholino 1-2 सेल स्तर पर oligonucleotide इंजेक्शन tuberous काठिन्य (tsc1a) परिसर, मिर्गी के एक बाल रूप बरामदगी और आत्मकेंद्रित के साथ जुड़े के लिए एक जीन की पछाड़ना अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया था. कोशिकी रिकॉर्डिंग भी ऑप्टिक tectum से प्राप्त किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, Baraban एट अल (2005) 9 या Baraban एट अल. (2007) 10. जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, बिजली घटनाओं तरंग और कार्रवाई के तंत्र जब्ती गतिविधि को प्रकाश में लाना करने के लिए प्रयोग किया जाता है पर निर्भर करता है अवधि में भिन्न हो सकते हैं.
चित्रा 1. असामान्य फट निर्वहन गतिविधि के बाह्य क्षेत्र रिकॉर्डिंग immobilized और अगर एम्बेडेड zebrafish लार्वा के अग्रमस्तिष्क में दर्ज की गई. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दृश्य के तहत तैनात हैंएक ओलिंप BX50 ईमानदार माइक्रोस्कोप अवलोकन. में रिकॉर्डिंग (ए) और (बी) को नशीली दवाओं के आवेदन के बाद लगभग 40 से 45 मिनट के शुरू किए गए. (ए) बहु कील pilocarpine में दर्ज की मुक्ति, एक मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर प्रतिपक्षी. (बी) फट के निर्वहन picrotoxin में दर्ज की गई, एक GABA एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी. (सी) एक भी फट बहु कील 3 DPF zebrafish लार्वा से दर्ज निर्वहन tsc1a खिलाफ एक morpholino साथ इंजेक्शन.
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Discussion
कोशिकी रिकॉर्डिंग यहाँ प्रस्तुत पद्धति मस्तिष्क गतिविधि का एक बहुत ही संवेदनशील और तेजी से विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. इन रिकॉर्डिंग electroencephalographic (ईईजी) सामान्यतः 11 मिर्गी और 12 रोगियों के कृंतक मॉडल में असामान्य विद्युत निर्वहन (यानी, जब्ती) की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल की निगरानी के लिए अनुरूप हैं. कोशिकी रिकॉर्डिंग औषधीय जोड़तोड़ के साथ जोड़ा जा सकता है, के रूप में यहाँ दिखाया गया. रिकॉर्डिंग के इन प्रकार भी आनुवंशिक रूप से संशोधित zebrafish में संभावित मिरगी phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्परिवर्ती zebrafish सामान्यतः कई जीन ENU mutagenesis (देखें Zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र, स्क्रीन में पहचान परिवर्तन के लिए उपलब्ध हैं http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) या उभरते Tol2 7 ट्रांसजेनिक और जस्ता उंगली nucleotide 13 तकनीकों के माध्यम से. जैसा कि यहाँ का प्रदर्शन, तेजी से जीन का उपयोग कर पछाड़नाmorpholino 3 DPF के रूप में जल्दी के रूप में electrophysiological निगरानी द्वारा पीछा oligonucleotides जब्ती उत्प्रेरण जीन दोष का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त विधि प्रदान करता है. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड आसानी ऑप्टिक tectum या सेरिबैलम सहित किसी भी zebrafish संरचना में रखा जाना है, और एकाधिक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड इस्तेमाल किया जा सकता है अगर जरूरत है. इन रिकॉर्डिंग की एक सीमा है कि यह रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड विशिष्ट मस्तिष्क नाभिक के सापेक्ष टिप का सटीक स्थान का आकलन करना मुश्किल है. विशिष्ट नाभिक या प्रकार की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से ले जाने zebrafish की उपलब्धता इस सीमा को कम करेगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक उनके जल्दी करने के लिए प्रयोगशाला में zebrafish स्थापित करने के प्रयासों के लिए पीटर कास्त्रो और मैथ्यू Dinday धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम स्वास्थ्य यूरेका अनुदान (# R01NS079214-01) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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