Summary
Um método simples para gravar os potenciais de campo extracelulares no larval do peixe-zebra é descrita prosencéfalo. O método proporciona um forte
Abstract
A epilepsia afeta cerca de 3 milhões de pessoas nos Estados Unidos e até 50 milhões de pessoas em todo o mundo. Definido como a ocorrência de convulsões espontâneas não provocados, a epilepsia pode ser adquirido como resultado de um insulto ao cérebro ou a uma mutação genética. Os esforços para convulsões modelo em animais têm utilizado principalmente adquiridos insultos (fármacos convulsivos, estimulação ou lesão cerebral) e manipulações genéticas (knockdown antisense, a recombinação homóloga ou transgénese) em roedores. Zebrafish é um sistema modelo de vertebrados 1-3 que poderia fornecer uma alternativa valiosa para roedor pesquisa baseada em epilepsia. Peixe-zebra são amplamente utilizados no estudo da genética de vertebrados ou de desenvolvimento, exibem um elevado grau de semelhança genética para os mamíferos e expressam homólogos de ~ 85% de humanos conhecidos mutações de um único gene de epilepsia. Devido ao seu tamanho pequeno (4-6 mm de comprimento), larvas de peixe-zebra pode ser mantida em volumes de fluidos tão baixo como 100 ul durante o desenvolvimento inicial e arraYED em multi-poços. Os reagentes podem ser adicionados directamente à solução em que os embriões se desenvolvem, o que simplifica a administração do fármaco e permitindo uma rápida no rastreio in vivo de compostos de teste 4. Os oligonucleótidos sintéticos (morpholinos), mutagénese, dedo de zinco nuclease e abordagens transgénicas podem ser utilizadas para gerar rapidamente knockdown gene ou mutação no peixe-zebra 5-7. Estas propriedades pagar estudos zebrafish uma vantagem sem precedentes análise estatística poder sobre roedores para o estudo de distúrbios neurológicos como a epilepsia. Porque o "padrão ouro" para a pesquisa a epilepsia é monitorar e analisar as descargas elétricas anormais que se originam em uma estrutura cerebral central (isto é, convulsões), um método eficiente para registrar a atividade cerebral em larvas do peixe-zebra é descrito aqui. Este método é uma adaptação de técnicas convencionais de gravação extracelular e permite a monitorização a longo prazo estável de actividade do cérebro em larvas do peixe intacta. Sgravações amplas são mostrados para convulsões agudas induzidas pela aplicação de banho de drogas convulsivas e apreensões espontâneas gravadas em um peixe geneticamente modificado.
Protocol
1. Produção de ovos e Cobrança
- Zebrafish criação segue procedimento padrão descrito anteriormente 8. Resumidamente, zebrafish adultos são criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Quando as luzes da sala de vir na manhã seguinte, divisórias são removidas de reprodução tanques e os peixes são permitidos aproximadamente 20 a 60 minutos de tempo de acasalamento imperturbável.
- Ovos de tanques de criação são coletados em uma peneira e lavadas com água de ovo. Os ovos são então transferidos para uma placa de Petri com água de ovo. Ovos não fertilizados e detritos são removidos utilizando uma pipeta de transferência.
- Prato lugar Petri contendo os ovos recolhidos numa incubadora (28-32 ° C). Após eclosão dos ovos, cerca de dois dias após a fertilização (dpf), remova córion e qualquer outros detritos com uma pipeta de transferência.
- No dia desejado pós-fertilização (3-8 dpf) remover uma placa de Petri contendo larvas livremente natação e lugar na bancada do laboratório à temperatura ambiente.
- Usando um extrator micropipeta, puxe de 1,2 mm de diâmetro externo de borosilicato capilar de vidro em duas agulhas e armazenar em uma placa de Petri 150 mm ou caixa de pipeta vazio que coloca sobre rampas bolinha de borracha. As agulhas podem ser puxado com antecedência. Diferente OD capilares de vidro podem ser usados, dependendo do tipo de andar de entrada do amplificador disponível.
- Microeléctrodo protelar o com solução de gravação extracelular (2 M NaCl) utilizando uma seringa de 1 ml com uma seringa de filtro Nalgene (4 mm) e de filamentos Microfil (Warner Instruments Precision) ligado. Agite ou o bolo em direção à ponta da agulha até que haja algumas bolhas ou nenhuma restantes.
3. Imobilização em Agar
- Prepara-se uma solução fresca de 1,2% de agar baixo ponto de fusão em água ovo. Solução de agar em lugar de um conjunto banho de água a ~ 37 ° C.
- Prepare uma lamela com câmara de gravação e coloque no freezer (5-10 min). A câmara de gravação deve MatCh que é utilizado na plataforma de electrofisiologia. Nós usamos um baixo perfil aberto diamante câmara de banho de imagem da Warner Instruments (modelo RC-26GLP).
- Utilizando uma pipeta de Pasteur ou transferência, um peixe-zebra lugar larval em uma pequena gota de água ovo em uma placa de Petri limpa. Para esta gotícula, adicionar uma gota de uma solução contendo um anestésico (0,02% tricaina) e agente paralisante (1 mg / ml α-bungarotoxina).
- Monitorar zebrafish para perda de movimento (5 a 10 min).
- Retirar as lamelas / câmara de gravação do freezer. Coloque câmara no palco de um estereomicroscópio. Utilizando uma pipeta de transferência, misturar de alguns ml de 1,2% de agarose de ponto de fusão baixo com gota e solução de transferência (com peixe) para a câmara de lamela / gravação.
- Utilizando uma ponta de pipeta ou agulha romba fina, larvas de posição sob o estereomicroscópio, de modo que o dorso do peixe é exposto à superfície do gel de agarose. Permitir agarose para endurecer (5-10 min), em seguida, utilizando uma espátula plana a transferência b agarbloquear a uma câmara de gravação criado em uma plataforma de eletrofisiologia.
3. Gravação de campo extracelular
- Adicionar 2-5 ml de meio de registo para o peixe-zebra câmara de gravação. Se as mudanças de droga são de câmara, necessário perfundir com solução de gravação a uma velocidade de aproximadamente 1 ml / min. Não oxigenação da solução de gravação é necessária.
- Inserir um microeléctrodo (aproximadamente 1 diâmetro de ponta um, 2-7 MQ) no andar de entrada do amplificador montado num micromanipulador tridimensional. Verificar se o micromanipulador está numa posição apropriada para permitir uma amplitude de movimento e ajustamento. Coloque a extremidade do microeléctrodo para dentro do plano de vista do microscópio, elevado para fora do palco, e utilizando o ajuste grosseiro inferior a um ponto imediatamente acima e ligeiramente à frente da cabeça do peixe-zebra.
- Com o amplificador em "grampo-atual" modo de zero, o eletrodo.
- Usando ajuste grosso inferior ponta do eletrodo para que ele só toca o surface do peixe-zebra, ligeiramente à frente da parte anterior do cérebro.
- Usando etapas de ajuste fino avançar a ponta do eléctrodo até que perfura a pele do peixe-zebra. Deixar depositar e depois avançar o eletrodo vários microns em prosencéfalo.
- Registrar a atividade elétrica no grampo de modo atual usando o software Axoscope. Os dados são adquiridos a uma taxa de amostragem de 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exemplos de descarga do tipo convulsivas electrográfico gravado no cérebro anterior de um agar-embedded larvas do peixe são mostrados na Figura 1. De grande amplitude de descarga explosão multi-pico nas amostras foi evocado por aplicação de banho de um fármaco convulsivo, 40 mM de pilocarpina (em A, 6 dpf) ou 1 mM de picrotoxina (em B, 8 dpf). Nestes registos, imobilizado e de ágar-embedded zebrafish são monitorados continuamente durante até 90 min. Peixe permanecem viáveis nestas condições de gravação de até 24 horas. Os fármacos são adicionados ao meio de banho e normalmente difusa sobre o agar para obter a actividade no cérebro anterior larval zebrafish dentro de 30 a 45 min. Este método pode ser usado com volumes relativamente pequenos de solução de fármaco (2-5 ml) como larvas não necessitam de perfusão contínua e pode ser gravada com uma configuração de banho estático, se necessário. No painel C, uma descarga espontânea de ruptura é mostrado para um zebrafish geneticamente modificado em 3 dpf; gravação foi feita no peixe-zebramídia de gravação. Morfolino injeção oligonucleotídeo na fase 1-2 celular foi usado para knockdown expressão de um gene para Complexo Esclerose Tuberosa (tsc1a), uma forma de epilepsia pediátrica associada com convulsões e autismo. Gravações extracelulares também pode ser obtido a partir do tecto óptico. Para exemplos, ver Baraban et al. (2005) 9 ou Baraban et al. (2007) 10. Como mostrado aqui, os sinais eléctricos podem variar de forma de onda e da duração dependendo do mecanismo de acção utilizado para eliciar a actividade convulsiva.
Figura 1. Gravações de campo extracelulares da actividade anormal explosão de descarga registados no prosencéfalo de imobilizado e agar-embedded larvas de peixe zebra. Eletrodos de registro são colocados sob visuaisobservação num microscópio Olympus BX50 vertical. As gravações em (A) e (B) foram iniciadas aproximadamente 40 a 45 min após a aplicação do fármaco. (A) de descarga multi-pico registadas na pilocarpina, um antagonista do receptor muscarínico da acetilcolina. (B) as descargas de ruptura registrado em picrotoxina, um GABA-A antagonista do receptor. (C) A descarga única explosão multi-pico gravada a partir de um peixe-zebra 3 dpf larvas injectadas com um morfolino contra tsc1a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método de gravação extracelular aqui apresentada permite uma análise muito sensível e rápido de atividade cerebral. Estas gravações são análogos a monitorização (EEG) eletroencefalográficos vulgarmente usado para avaliar a presença de descarga eléctrica anormal (isto é, convulsões) em modelos de roedores de epilepsia e 11 pacientes 12. Gravações extracelulares podem ser combinadas com as manipulações farmacológicas, como mostrado aqui. Estes tipos de gravações podem também ser usados para avaliar potenciais fenótipos epilépticos em zebrafish geneticamente modificado. Zebrafish mutantes são comumente disponíveis para mutações do gene muitas identificados nas telas de mutagênese ENU (ver Zebrafish Centro Internacional de Recursos, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) ou através emergente Tol2 transgênico 7 e dedo de zinco nucleotídeos 13 técnicas. Como demonstrado aqui, knockdown gene rápida usandooligonucleidos morfolino seguido por monitorização eletrofisiológica tão cedo quanto 3 dpf fornece um método adicional para avaliar defeitos de apreensão de indução de genes. O eléctrodo de registo pode ser facilmente colocado em qualquer estrutura de peixe-zebra, incluindo o tecto óptico ou cerebelo, e múltiplos eléctrodos de registo pode ser usado se necessário. Uma limitação de tais gravações é que é difícil de avaliar a localização exacta da ponta do eléctrodo de registo em relação ao núcleo específica do cérebro. A disponibilidade de zebrafish transportando repórteres fluorescentes em núcleos específicos ou tipos de células irá atenuar esta limitação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O autor gostaria de agradecer a Peter Castro e Mateus Dinday por seus esforços iniciais para estabelecer zebrafish em laboratório. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde EUREKA concessão (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
