Summary
Larva zebrafish önbeyin ekstrasellüler alanın potansiyellerini kaydetmek için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem, bir sağlam içerir
Abstract
Epilepsi Amerika Birleşik Devletleri yaklaşık 3 milyon kişi kadar ve 50 milyon kişi dünya çapında etkiler. Spontan nöbetlerle oluşumu olarak tanımlanan, epilepsi beyin ya da genetik bir mutasyon bir hakaret sonucunda elde edilebilir. Hayvanlarda modeli nöbet çabaları öncelikle kullanılan kemirgenlerde hakaret (konvülsan ilaçlar, uyarılma ya da beyin hasarı) ve genetik manipülasyonlar (antisens demonte, homolog rekombinasyon veya transgenesis) almış. Zebra balığı kemirgen tabanlı epilepsi araştırma için değerli bir alternatif sunabilecek bir omurgalı model sistem 1-3 vardır. Zebra balığı omurgalı genetik veya geliştirme çalışmalarında yaygın olarak kullanılan, memeliler için genetik benzerlik yüksek dereceli ve bilinen insan tek gen epilepsi mutasyonların ~% 85 homologları ifade. Çünkü onların küçük boyutlu (4-6 mm uzunlukta) arasında zebrafish larva erken gelişim ve arra sırasında 100 ul gibi düşük sıvı hacmi muhafaza edilebilirçok oyuklu plakalar içinde yapabilirler. Reaktifler embriyolar ilaç uygulaması basitleştirilmesi ve test bileşiklerinin in vivo 4 tarama hızlı sağlayan, geliştiği çözeltiye doğrudan ilave edilebilir. Sentetik oligonükleotidler (morpholinos), mutagenez, çinko parmak nükleaz ve transgenik yaklaşımlar hızla 5-7 zebrafish gen devirme veya mutasyon oluşturmak için de kullanılabilir. Bu özellikler zebrafish çalışmalarda epilepsi gibi nörolojik hastalıkların çalışmada kemirgenler üzerinde görülmemiş bir istatistiksel güç analizi avantajı göze. Epilepsi araştırma için "altın standart" merkezi bir beyin yapısı (yani, nöbetler), verimli larva zebrafish beyin aktivitesini kaydetmek için bir yöntem menşeli anormal elektrik deşarjı izlemek ve analiz etmek için burada tanımlanmıştır. Bu yöntem geleneksel ekstraselüler kayıt teknikleri bir uyarlamasıdır ve sağlam zebrafish larvaları beyin aktivitesinin istikrarlı, uzun vadeli izleme için izin verir. Sbol kayıtları bir genetiği değiştirilmiş balık kaydedilen konvülsan ilaçlar ve spontan nöbetlerin banyo uygulaması ile oluşturulan akut nöbetler için gösterilmiştir.
Protocol
1. Yumurta Üretim ve Toplama
- Zebra balığı yetiştiriciliği daha önce 8 açıklanan standart prosedürleri izler. Kısaca, yetişkin zebrafish yerde bölücüler ile tanklar üreme kurulur. Oda ışıkları ertesi sabah geldiğinde, bölücüler tank ve balık rahatsız çiftleşme zamanı yaklaşık 20 ila 60 dakika izin üreme kaldırılır.
- Yetiştirme tanklarından Yumurta bir süzgeç toplanır ve yumurta su ile durulanır. Yumurta sonra yumurta su ile bir Petri kabı aktarılır. Döllenmemiş yumurtalar ve enkaz bir transfer pipet kullanarak kaldırılır.
- Küvözde toplanan yumurtalar (28-32 ° C) içeren Sıra Petri. Yumurta iki gün sonrası fertilizasyon (DPF) etrafında, yumurtadan sonra, bir transfer pipet ile koryon ve diğer pislikleri temizleyin.
- İstediğiniz gün sonrası fertilizasyon (3 ila 8 DPF) oda sıcaklığında laboratuarlarında serbestçe yüzme larva ve yeri içeren Petri çıkarın.
- Bir mikropipet çektirmenin kullanarak, 1.2 mm OD borosilikat cam aptalca macun rampalarda koyarak bir 150 mm Petri kabında ya da boş pipet kutusunda iki iğne ve mağaza içine kılcal çekin. İğneler önceden çekilebilir. Farklı OD cam kılcal mevcut amplifikatör headstage türüne bağlı olarak kullanılabilir.
- Nalgene bir şırınga filtresi (4-mm) ve Mikrofil filaman (Warner Precision Instruments) takılı olan bir 1 ml şırınga kullanarak hücre dışı kayıt solüsyonu (2 M NaCl) ile Backload mikroelektrot. Kalan az veya hiç kabarcığı kalmayıncaya kadar iğne ucuna doğru bolus çalkalayın ya dokunun.
3. Agar İmmobilizasyon
- Yumurta suda% 1.2 düşük erime noktası agar taze bir çözüm hazırlayın. ~ 37 ° C'de bir su banyosunda grubu içinde yer agar çözeltisi
- Dondurucuya kayıt odasına ve yeri (5-10 dk) ile bir lamel hazırlayın. Kayıt odasına Matc gerekirh bu elektrofizyoloji teçhizat kullanılır. Biz Warner Instruments (Model RC-26GLP) bir düşük profilli açık elmas hamamı görüntüleme odası kullanın.
- Pasteur veya transfer pipet, temiz bir Petri plaka yumurta su küçük bir damlacık yer biri larva zebrafish kullanma. Bu damlacık için, bir anestetik (% 0.02 tricaine) ve felç edici ajan (1 mg / ml α-bungarotoxin) ihtiva eden bir çözelti damla ilave edin.
- Hareket kaybı (5-10 dk) için zebrafish izler.
- Dondurucu lamel / kayıt odasına çıkarın. Stereomikroskopta evresine odasına yerleştirin. Bir transfer pipet kullanarak, damlacık ve lamel / kayıt odasına aktarım çözümü (balık) ile% 1.2 düşük erime noktası agaroz birkaç ml karıştırın.
- Bir pipet veya ince künt iğne, balık dorsalinde agaroz jel yüzeyine maruz böylece stereomikroskop altında pozisyon larva kullanma. Sonra düz bir spatula transferi agar b kullanarak, sertleşmeye (5-10 dk) agaroz İzinBir elektrofizyoloji kulesi kurmak bir kayıt odasına kilitleyin.
3. Ekstrasellüler Alan Kaydı
- Kayıt odasına zebrafish kayıt ortamı 2-5 ml ekleyin. Ilaç değişiklikler yaklaşık 1 ml / dak 'lık bir hızla kayıt solüsyonu ile gerektiğinde, perfuse bölme ise. Kayıt çözelti No oksijen gereklidir.
- , Üç boyutlu bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş olan amplifikatör headstage içine bir mikroelektrot (yaklaşık 1 mikron uç çapı, MΩ 2-7) takın. Mikromanipülatör hareketi ve ayar bir dizi için izin vermek için uygun bir konumda olup olmadığını kontrol edin. Sahneden yüksek mikroskop görünümü düzlem, ve sadece yukarıda ve biraz zebrafish kafası önünde bir noktaya daha düşük kaba ayarı kullanarak içine mikroelektrot ucu getir.
- "Akım-kelepçe" modunda sıfır elektrodunda amplifikatör ile.
- Sadece s dokunacak şekilde kaba ayarı düşük elektrot ucu kullanarakhafifçe ön beyin önünde zebrafish urface.
- Bu zebrafish cildi delen, kadar ince ayar adımları kullanarak elektrot ucu ilerlemek. Önbeyin içine birkaç mikron yerleşmek ve sonra elektrot ilerlemek için izin ver.
- Axoscope yazılımını kullanarak akım-klemp modunda elektriksel aktivite kaydedin. Veri 10 kHz örnekleme hızında elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir agar-gömülü zebrafish larvalarının ön beyin kaydedilen elektrografik nöbet gibi deşarj örnekleri Şekil 1 'de gösterilmiştir. Veya 1 mM picrotoxin (B; 8 dpf); bu örneklerdeki Büyük genlikli çoklu başak patlama boşalma konvülsan ilacın banyo uygulaması, 40 mM pilokarpin (6 dpf'e A) tarafından uyarılmış oldu. Bu kayıtlar içinde, immobilize ve agar-gömülü zebrafish sürekli 90 dk kadar izlenir. Balık kadar 24 saat için bu kayıt koşullarında canlı kalır. İlaçlar banyo ortamı ve 30-45 dakika içinde larva zebrafish ön beyin aktivite ortaya çıkarmak için agar içine normal olarak yaygın olarak eklenir. Bu yöntem, larvaları gibi ilaç çözeltisinin nispeten küçük hacimde (2-5 ml) ile birlikte kullanılabilir sürekli perfüzyon gerekmez ve bir statik banyo konfigürasyonu gerekirse de kaydedilebilir. Panelinde C, kendiliğinden bir patlama tahliye 3 dpf'e bir genetiği değiştirilmiş zebrafish için gösterilir; kayıt zebrafish yapıldıkayıt ortamı. 1-2 hücreli aşamasında Morfolino oligonükleotid enjeksiyon Tuberous Sclerosis Complex (tsc1a), nöbet ve otizm ile ilişkili epilepsi pediatrik form için bir gen demonte ifadesi kullanıldı. Hücre dışı kayıtlar aynı zamanda optik tectum elde edilebilir. Örnekler için, Baraban vd. (2005), 9 ya da Baraban ve diğ. (2007) 10. Burada gösterildiği gibi, elektrik etkinlik dalga formu ve nöbet aktivitesine ortaya çıkarmak için kullanılan aksiyon mekanizmasına bağlı süre içinde değişebilir.
Anormal patlama deşarj faaliyet Şekil 1. Ekstrasellüler alan kayıtlar immobilize ve agar-gömülü zebrafish larvaların önbeyin kaydedildi. Kayıt elektrotlar görsel altına yerleştirilmiştirOlympus BX50 dik mikroskop gözlem. Kayıtlar (A) ve (B) ilaç uygulamasından sonra yaklaşık olarak 40 ila 45 dakika başlatılmıştır. Pilokarpin kaydedilen (A) Çoklu-başak deşarj, muskarinik asetilkolin reseptör antagonisti. (B) Burst deşarjları, picrotoxin bir GABA-A reseptör antagonisti kaydedildi. (C) bir 3 dpf zebrafish larva kaydedilen tek bir çok sivri uç burst deşarj tsc1a karşı bir morfolino enjekte edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan ekstraselüler kayıt yöntemi, beyin aktivitesinde çok hassas ve hızlı analizine olanak sağlar. Bu kayıtlar genellikle epilepsi 11 ve hastaların 12 kemirgen modellerinde anormal elektriksel deşarj (yani, nöbet) varlığını değerlendirmek için kullanılan elektroensefalografi (EEG) izleme ile benzerdir. Burada gösterildiği gibi ekstraselüler kayıtları, farmakolojik manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Kayıtları Bu tip de genetik olarak modifiye edilmiş zebrafish potansiyel epileptik fenotiplerinin değerlendirilmesi için de kullanılabilir. Mutant zebrafish TRK mutagenez ekranlar (Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi, bkz tanımlanan birçok gen mutasyonları için yaygın olarak mevcuttur http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) ya da ortaya çıkan Tol2 transgenik 7 ve çinko parmak nükleotid 13 teknikleri ile. Kullanılarak burada gösterildiği gibi, hızlı bir gen demonte3 dpf'e gibi erken elektrofizyolojik izleme takip morfolino oligonükleotidler nöbet indükleyici gen defektleri değerlendirmek için ek bir yöntem sağlıyor. Kayıt elektrot kolayca optik tectum veya beyincik dahil olmak üzere herhangi zebrafish yapı yerleştirilebilir, ve gerektiğinde birden fazla kayıt elektrodlar da kullanılabilir. Bu kayıtların bir kısıtı da belirli beyin çekirdekleri göreli kayıt elektrot ucu hassas konum değerlendirmek zor olmasıdır. Belirli çekirdekler veya hücre tiplerinde floresan gazetecilere taşıyan zebrafish durumu bu sınırlama azaltmak olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazar laboratuarda zebrafish kurmak onların erken çabalarına Peter Castro ve Matthew Dinday teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık EUREKA hibe (# R01NS079214-01) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
