Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Summary

Werkwijze volwassen Drosophila associatief geheugen meten wordt beschreven. De assay is gebaseerd op het vermogen van de vlieg een geur gepresenteerd met een negatieve bekrachtiger (elektrische schok) koppelen en vervolgens oproepen deze informatie op een later tijdstip, waarbij het geheugen te meten.

Abstract

Drosophila zijn gebruikt in klassieke conditionering experimenten meer dan 40 jaar, dus sterk ons begrip van het geheugen te bevorderen, met inbegrip van de opheldering van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij cognitieve aandoeningen ^1-7. Leren en geheugen kunnen worden getest in larven het effect van neurologische genen ^8-10 bestuderen en vliegt de bijdrage van volwassen plasticiteit genen ^1-7 meten. Bovendien, de korte levensduur van Drosophila vergemakkelijkt de analyse van genen mediëren leeftijd gerelateerde geheugenstoornis ^5,11-13. De beschikbaarheid van verschillende induceerbare promoters die het Drosophila zenuwstelsel verdelen maakt het mogelijk om te bepalen wanneer een gen van belang wordt vereist voor normaal geheugen en relay verschillende aspecten van de versterkingssignaal ^3,4,14,16.

Studeren geheugen bij volwassen Drosophila zorgt voor een gedetailleerde analyse van degedrag en circuits betrokken en een meting van lange-termijngeheugen ^{15 -17.} De lengte van het volwassen stadium geschikt genetische, gedrags-, dieet en farmacologische manipulaties geheugen langere termijn, naast bepalen van het effect van veroudering en neurodegeneratieve ziekten geheugen ^{3-6,11-13,15-21.}

Klassieke conditionering wordt veroorzaakt door de gelijktijdige presentatie van een neutrale geur cue (geconditioneerde stimulus, CS ⁺⁾ en een versterking stimulus, bijvoorbeeld., Een elektrische schok of sucrose, (ongeconditioneerde stimulus, VS), die geassocieerd worden met elkaar door het dier ^1,16. Een tweede geconditioneerde stimulus (CS ^-) wordt vervolgens weergegeven zonder de VS. Tijdens de testfase, worden Drosophila gelijktijdig gepresenteerd met CS + en CS-geuren. Nadat de Drosophila worden voorzien tijd om te kiezen tussen de geuren, is de verdeling van de dieren geregistreerd. Deze procedure aldieptepunten associatieve aversieve of appetitief conditionering betrouwbare wijze te meten zonder vertekening die door de aangeboren voorkeur voor een van de geconditioneerde stimuli. Verschillende controle-experimenten worden ook uitgevoerd om te testen of alle genotypen reageren normaal op geur en wapening alleen.

Introduction

De hier gepresenteerde methode is beschreven door Tully en Quinn met enkele kleine aanpassingen ^1. Het experiment werd uitgevoerd in twee fasen: de vliegen getraind in de eerste fase en de getrainde vliegen worden getest in de tweede fase. Tijdens de training, zijn een groep van vliegen tegelijkertijd blootgesteld aan geur 1 (CS ⁺⁾ en een elektrische schok (US) in een training buis. De vliegen dan ontvangt geur 2 (CS ^-) zonder een elektrische schok. Deze single koppeling van een bepaalde geur met een schok wordt genoemd 1-cyclus opleidingen, en de geuren die het meest worden gebruikt zijn 4-methylcyclohexanol (MCH) en 3-octanol (OCT).

Een cyclus training leidt tot de vorming van een labiele fase geheugen dat kan worden gedetecteerd tot 7 uur; echter, wordt het geheugen meestal onmiddellijk getest om te bepalen wat wordt genoemd het leren, de verwerving of 2 min geheugen. Geheugen gemeten bij 30 min of 1 uur is bedoeld als korte-termijn geheugen, terwijl3 hr geheugen wordt aangeduid als tussentijdse geheugen. De blootstelling van vliegen om repetitieve training cycli met openingen tussen de opleiding cycli (gespreid opleiding) leidt tot een geconsolideerde vorm van lange-termijn geheugen, dat is CREB transcriptie afhankelijk en duurt maximaal een week. Training zonder gaten (massale training) leidt tot de vorming van anesthesie-resistente geheugen (ARM), die vergelijkbaar langetermijngeheugen wordt meestal gemeten 24 uur na 5 cycli van training ^{7,13,15-17,20,21.}

Met deze benadering kan het effect van verschillende genmutaties op deze verschillende fasen van het geheugen worden bepaald. De promotor gedreven uitdrukking van licht-of temperatuurgevoelige transgenen te activeren of blokkeren van de neurale activiteit van specifieke neuronen maakt het mogelijk om te onderzoeken welke neuronen nodig zijn voor het geheugen acquisitie, consolidatie en retrieval ^{3,4,11,15,16,20, 22-24.} Geheugen op 1 uur wordt meestal gemeten bij het bestuderen van leeftijd gerelateerde geheugenverlies, omdat deze form van het geheugen lijkt bijzonder kwetsbaar voor de gevolgen van de vergrijzing ^11-13. Een reeks gedrags-en genetische Controles die met geheugen experimenten, bijvoorbeeld, te bepalen of een prestatie defect is door een centraal geheugen defect of perifere sensorische gebrek dat de vlieg voorkomt waarnemen van de schok of olfactorische cue ^{5 -7, 1 7, 25,26.}

Protocol

1 Fly Voorbereiding

1. Outcross alle mutanten, Gal4 / UAS en andere lijnen met een wildtype stam, zoals CSw-, ten minste zes generaties vóór de gedragsexperimenten te controleren voor genetische achtergrond ^26.
2. Kweek vliegen op een standaard maïsmeel, gist en melasse dieet onder een 00:12 uur licht-donker cyclus bij 25 ° C tenzij specifieke manipulaties vereisen een andere temperatuur.
   1. Om de effecten van transgene expressie bepalen: Gebruik 18 ° C om de expressie van transgenen in Gal4 GAL80 ^ts (TARGET-systeem) door middel van ontwikkeling te voorkomen en vervolgens naar de vliegen tot een 30 ° C incubator 1-2 dagen voor de gedrags-experiment. Uitvoeren van het experiment bij 30 ° C om de effecten van transgene expressie ^3,4,6,7,14 bepalen.
   2. Voor experimenten met warm geactiveerde TRPA1 kanalen neuronen stimuleert Til de vliegen bij 23 ° C, hetgeen een temperatuur bekendeen inactieve kanaal behouden en vervolgens verschuiven naar een gedrag kamer bij 30 ° C om de TRPA1 expressie neuronen activeren.
   3. Voor experimenten met Shibire ^{temperatuur gevoelig} voor synaptische uitgang ^{11, 14,24} blokkeren: Achter de vliegen bij 18 ° C en uit te voeren testen bij 30 ° C.
3. Verzamel de vliegen 1-2 dagen voor het experiment en tel ze in groepen van ongeveer 25 onder lichte CO ₂ anesthesie. Bewaar de vliegen tenminste O / N in levensmiddelen flacons (zonder gist) bij 25 ° C (tenzij er specifieke manipulaties vereist een andere temperatuur) en 70% relatieve vochtigheid in een milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte met 00:12 uur licht: donker totdat de tijd van het experiment.
   Opmerking: Deze opslag laat de vliegen om te acclimatiseren aan het verder leren-test uitgevoerd in de milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte, die de optimale omstandigheden voor Drosophila leren had en, belangrijker nog, verwijdert alle dagelijkse ENVIronmental variaties die de gedragsfenotype zou hebben beïnvloed.

2 Voorbereiding voor het experiment

1. Voer de experimenten in een maat Perspex T-doolhof (figuur 1).
2. Controleer regelmatig de buis aanbrengen om ervoor te zorgen dat een luchtdichte afdichting wordt verkregen tijdens het experiment. Wijzig indien nodig de O-ringen die de compartimenten van de T-doolhof te dichten.
3. Plaats op maat gemaakte koperen roosters in de training buizen. Controleer en reinig deze netten regelmatig en vervang deze indien geoxideerd. Bevestig de koperen roosters draden via krokodillebekken die lopen een schakelkast verbonden met een elektrische stimulator. Gebruik een voltmeter om te waarborgen dat de inrichting de verlangde shock.
4. Gebruik G-klemmen om het doolhof stevig vasthouden om de lucht lekkage te voorkomen.
5. Bevestig de T-doolhof aan buizen die loopt op een luchtpomp, zodat geuren over de vliegen aan te trekken en vervolgens van de T-doolhof verwijderd. Onderhouden milde luchtvloei bij ~ 2 L / min

3 Geur verdunningen

1. Gebruik twee verschillende geuren in concentraties zodanig dat de vliegen tonen een gelijke voorkeur beide geuren. Gebruik 4-methylcyclohexanol (1:67) en 3-octanol (1: 100) verdund in minerale olie ^7,13.
   Let op: bepaal zorgvuldig deze concentraties, die verschillen per laboratorium. Bijvoorbeeld anderen gebruiken 01:10 beide geuren ^24. Andere veel gebruikte geuren omvatten ethylacetaat en iso-amyl acetaat.
2. Pipetteer 30 ul van de verdunde geur een maat geur cup geplaatst in een geur blok onder een plastic buis met een geperforeerde top waarmee lucht via geur in de beker te trekken, waardoor de vliegen blootstellen aan een geur pluim.

4 Training Protocol (figuren 1 en 2)

1. Voor volwassen olfactorische shock conditionering, presteren alle experimenten onder een gedimd rood licht (dwz., Rode LED), die het mogelijk maakt de onderzoeker om te zien, maar voorkomt dat de fly van het zien, waardoor de vliegen te concentreren op reukzin tegenover visuele inputs.
2. Introduceren de vliegen in de opleiding buis en dan hechten aan de T-doolhof en hen in staat stellen zich aan te passen aan de buis en de luchtstroom gedurende 90 sec.
3. Presenteer de eerste geur (4-methylcyclohexanol, MCH) met een 60-V shock (bestaande uit twaalf 1.25 sec pulsen met 3.75 sec inter-puls interval) voor een totale duur van 60 sec.
4. Volg de schok met een 30 seconden rustperiode zonder geur of shock.
5. Presenteer de tweede geur (3-octanol, oktober) gedurende 60 seconden zonder een schok.
6. Volg de schok met een 30 seconden rustperiode zonder geur of shock.
7. Beweeg de vliegen van de training kamer in de centrale kamer van het T-doolhof door de T-doolhof op zijn kant en voorzichtig slaande de onderkant van het T-doolhof op een zachte ondergrond zoals een oude muis mat. Handhaaf de vliegen in de centrale kamer voor 90 sec.
8. Bevestig de keuze buizen in de bottom van de inrichting op de T-labyrint vormen.
9. Om het leren te meten, verplaatsen de vliegen om de keuze van het T-doolhof, waar ze tegelijkertijd werden blootgesteld aan zowel de geuren en de stap naar een. Voer een testperiode van 120 sec.
10. Trap de vliegen in de keuze buizen door omhoog schuiven van de centrale kamer waardoor het blokkeren van de uiteinden van de buizen keuze. Verzamel de vliegen in elke arm van het T-doolhof en in het centrale compartiment in voedsel flesjes en tellen.
11. Om het geheugen te meten, verzamelen de vliegen na de training (4,6) en over te brengen van de T-doolhof om voedsel flacons zonder gist. WINKEL vliegt in het donker bij 25 ° C en 70% vochtigheid gedurende de resterende tijd die nodig is om het geheugen fase plaats bepalen (zie inleiding). Opnieuw de vliegen de T-doolhof als in stap 4.7.
12. Voor de lange-termijn geheugen, gebruik dan een op maat gebouwde doolhof die het mogelijk maakt verschillende batches van vliegen tegelijk worden opgeleid. Dien 5 cycli van de opleiding met een 15 min inter-cyclus interval (spaCED) of zonder een inter-cyclus interval (massale). Handhaaf de vliegen bij 18 ° C en 70% vochtigheid in het donker totdat de tests. Voorafgaand aan het testen, bewegen de vliegen tot 25 ° C en laat ze acclimatiseren voor minstens 1 uur. Beoordelen op lange termijn geheugen 24 uur na de training.
13. Na de gedragsexperimenten, het reinigen van de geur kopjes met heet water en reukloos wasmiddel. Na het drogen, de vacht van de cups met 10 ul Sigmacote. Droog de Sigmacote door verwarmen in een magnetron. Af en toe reinigen van de T-doolhof perspex buizen en geur blokken met warm water en reukloos wasmiddel.

5 Berekening van de Performance Index: een maatstaf voor Memory the Flies '

1. Bereken de-index (PI) voor elke conditie als het aantal vliegen vermijden van de shock-gepaarde geur (CS ^-) minus het aantal vliegen de keuze-shock gepaarde geur (CS ⁺⁾ gedeeld door het totale aantal vliegen (CS ^- + CS ^{+) 1.}
   Performance index (PI) = (# CS ^- vliegt - # CS ⁺ vliegt) / (# totaal vliegen)
2. Bereken de laatste PI van het experiment door het middelen van de PI van het experiment waarin MCH was-shock gepaard geur en een waarin oktober was-shock gepaard geur. Dit verwijdert alle vooringenomenheid van de vliegen met een grotere voorkeur voor een geur.

6 Sensomotorische Controls

1. Voeren geur scherpte door de invoering van ~ 40-50 vliegen in de T-doolhof ^6,7,17.
2. Na 90 sec, bewegen de vliegen om de keuze punt, en laat ze 2 minuten om te kiezen tussen pure geuren en lucht.
3. Verzamelen en tel de vliegen. Bereken het percentage vermijden door het totaal aantal vliegen die de geur gekozen door degenen die aan de test.
4. Voor shock reactiviteit ^6,7,17, introduceren de vliegen in de shock kamer.
5. Na 90 seconden rust, bestuurt een 60 V DC elektrische schok, waarvan de vliegen kan ontsnappen naar een soortgelijkebuisje zonder een schok.
6. Laat 2 min voor de vliegen om uit te kiezen; verzamelen en tel de vliegen. Bereken het percentage shock voorkomen door het aantal vliegen die de schok voorkomen door te ontsnappen aan de schokbuis door het totale aantal vliegen in het experiment verdelen. Neem de vliegen die nog in de centrale kamer van het totaal van die elektrische schok ontsnapt.

Representative Results

De prestatie-index (PI) dient als een maat van het geheugen. Tabel 1 illustreert een representatieve berekening van PI.

MCH gepaard met shock	3-oktober gepaard met shock
Vliegen vermijden MCH (in oktober buis) = 80 Vliegen liever MCH (in MCH buis) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6	Vliegen vermijden oktober (in MCH buis) = 75 Vliegen liever oktober (in oktober buis) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0.5
PI van het experiment = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tabel 1: Een vertegenwoordiger berekening van de prestatie-index met illustratieve gegevens. Prestatie-indices voor de verschillende experimenten is te vergelijken met het geheugen effecten op te helderen. Zodra dezevergelijking wordt getoond in figuur 3, waarin het resultaat van een reeks experimenten uitgevoerd met wildtype Canton S volwassen vliegen (WT) en dunce leren mutant volwassen vliegen ¹ bevat. Het gemiddelde van 10 PI's is voorzien, met fout bars die de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Deze resultaten demonstreren dat dunce vliegen tonen een vermindering leren opzichte van wildtype.

Figuur 1 De volwassen experimentele opstelling. De vliegen worden getraind en getest in een T-doolhof. De training behelst opname van een geur Een elektrische schok gevolgd door een tweede geur B zonder elektrische schok. Na een rustperiode in de middelste kamer de vliegen worden met zowel de geuren tegelijk. De vliegen worden gevangenin de twee buizen en verzameld en geteld om te leren / geheugen scores te verkrijgen.

Figuur 2 De volwassen training protocol. De vliegen zijn opleiding in twee stappen. De eerste stap waar vliegen krijgen een geur (CS +) gekoppeld aan een elektrische schok (US) voor 60 sec. In de volgende stap vliegen ontvangt een tweede geur (CS) zonder elektrische schok. De vliegen worden dan met rust gelaten gedurende 90 seconden waarna ze getest op hun keuze tussen CS + en CS.

Figuur 3 Een vertegenwoordiger grafiek die domkop en wildtype leren bij volwassen Drosophila. dunce vliegen werden getest na een sessie van training. Dunce vliegen tonen een vermindering leerproces in vergelijking met de WT (n = 10).

Discussion

De Drosophila volwassen olfactorische shock leren test hier gepresenteerde maakt een analyse van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de verschillende fasen van het geheugen, inclusief lange-termijn geheugen ^15-17. Evenals de bepaling van het effect van de circadiane ritmes ^18, slapen ^19, dieet ^20,21, veroudering ^11-13, neurodegeneratieve ziekte ⁵ en medicamenteuze behandelingen ^5,6,19 op het geheugen.

Vele krachtige benaderingen zijn recent ontwikkeld voor de functionele beeldvorming van de neurale circuits die olfactorische geheugen vliegen ^{3,4,7,11,16,27} mediëren. Deze optogenetische technieken gebruik maken van de enorme repertoire van de verschillende promotors beschikbaar in Drosophila ^14,16. Deze promoters worden gebruikt om genetisch gecodeerde calcium en cAMP reporters in het geheugen neuronen ^16,27 drukken om het effect van specifieke genmutaties studie over herinneringssporen.

The gebruik van voorwaardelijke promoters en mutaties bij volwassenen maakt het onderzoek mogelijk van de postontwikkelingsonderzoek rol van een genproduct in geheugen ^{3,4,6,7,13,14.} Visualisatie gedragsbenaderingen te combineren met lichte en warmte geactiveerde kanalen stimuleren of remmen verschillende neuronen in de geheugenschakeling ^{11,14,16,22-24} hun functie verder te onderzoeken. Bovendien paddestoel lichaam geheugen neuronen zijn toegankelijk voor whole-cell patch clamp opnamen ^28, en wiskundige en computationele technieken worden gebruikt voor het model Drosophila olfactorische geheugen ^29.

Deze experimentele vooruitgang, in combinatie met de verschillende vormen van associatief geheugen protocollen here ingevoerd, zodat Drosophila worden gebruikt om de moleculair-en circuit-level veranderingen in associatief geheugen die optreden als gevolg van beloning, straf, motivatie, verslaving modelleren, veroudering en ziekte ^{5,6,11-13,16,30-31.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Octanol	Sigma	218405
4-Methyl cyclohexanol	Sigma	15309-5
Benzaldehyde	Sigma	418099
Mineral oil	Fluka	BP2629-1
Hexyl acetate	Sigma	108154
Fructose	Sigma	F0127
Agarose	Bioline	BIO-41025