Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Summary

Metoden for å måle voksen Drosophila assosiativ hukommelse, er beskrevet. Analysen er basert på evnen av fly for å knytte en lukt presentert med en negativ forsterker (elektrisk sjokk), og deretter hente informasjonen på et senere tidspunkt, slik at hukommelsen som skal måles.

Abstract

Drosophila har blitt brukt i klassisk betinging eksperimenter i over 40 år, og dermed i stor grad legge til rette for vår forståelse av minne, herunder klarlegging av de molekylære mekanismene som er involvert i kognitive sykdommer ^1-7. Læring og hukommelse kan bli analysert i larver for å studere effekten av nevrologiske gener ^8-10 og i fluer for å måle bidraget av voksne plastisitet gener ^1-7. Videre er den korte levetid av Drosophila forenkler analysen av gener som medierer aldersrelatert hukommelsessvikt ^5,11-13. Tilgjengeligheten av mange induserbare promotorer som igjen deler Drosophila nervesystem gjør det mulig å fastslå når og hvor et gen av interesse er nødvendig for normal hukommelse, så vel som relé av forskjellige aspekter av forsterkningssignalet ^3,4,14,16.

Studerer minne i voksen Drosophila muliggjør en detaljert analyse avatferd og kretser involvert og en måling av langtidshukommelsen ^{15 -17.} Lengden av den voksne stadium rommer mer langsiktige genetiske, atferds, kosttilskudd og farmakologiske manipulasjoner av hukommelse, i tillegg til å bestemme effekten av aldring og nevrodegenerative sykdommer på hukommelse ^{3-6,11-13,15-21.}

Klassiske kondisjone er indusert av den samtidige presentasjon av en nøytral lukt signalet (betinget stimulus, CS ⁺⁾ og en forsterkning stimulans, f.eks., Et elektrisk støt eller sukrose, (ubetinget stimulus, USA), som blir forbundet med hverandre ved hjelp av dyret ^1,16. Et annet betinget stimulus (CS ^-) blir deretter presentert uten USA. I løpet av testfasen, er Drosophila samtidig presenteres med CS + og CS- lukt. Etter Drosophila er gitt tid til å velge mellom de lukt, er fordelingen av dyrene registrert. Denne prosedyren allows assosiativ motvilje eller appetitive condition for å måles pålitelig uten en skjevhet introdusert av medfødt preferanse for noen av de betingede stimuli. Ulike kontrolleksperimenter er også utført for å teste om alle genotyper responderer normalt på lukt og forsterkning alene.

Introduction

Metoden som er presentert her er som beskrevet av Tully og Quinn med noen små modifikasjoner ^1. Forsøket er utført i to faser: fluene er opplært i den første fasen, og de trente fluer er testet i andre fase. Under trening, er en gruppe av fluer samtidig utsatt for lukt 1 (CS ⁺⁾ og en elektrisk sjokk (US) i en trenings tube. Fluene da motta lukt 2 (CS ^-) uten et elektrisk støt. Dette enkelt sammenkobling av en bestemt lukt med et sjokk kalles en syklus trening, og lukt som er mest brukt er 4-metylcykloheksanol (MCH) og 3-oktanol (OCT).

En-syklus opplæring fører til dannelse av et labilt fase av minne som kan detekteres i opptil 7 timer; imidlertid minne vanligvis testet umiddelbart for å avgjøre hva som er betegnet læring, oppkjøp eller 2 min hukommelse. Minne målt til 30 minutter eller en time er referert til som korttidshukommelsen, mens3 t-minne blir referert til som mid-hukommelse. Eksponeringen av fluer til repeterende treningssykluser med mellomrom mellom trening sykluser (linjeavstand opplæring) fører til en konsolidert form av langsiktige minne som er CREB transkripsjon avhengig og varer i opptil en uke. Trening uten hull (massed opplæring) fører til dannelse av anestesi-resistente minne (ARM), som ligner på langtidshukommelsen, er vanligvis målt 24 timer etter 5 sykluser med trening ^{7,13,15-17,20,21.}

Med denne tilnærming, kan effekten av ulike genmutasjoner på disse forskjellige faser av minne bestemmes. Promoter drevet uttrykk for lys-eller temperaturfølsomme transgener for å aktivere eller blokkere nevrale aktiviteten til bestemte nerveceller gjør det interessant å undersøke hvilke nevroner er nødvendig for hukommelse oppkjøp, konsolidering og uthenting ^{3,4,11,15,16,20, 22-24.} Minne på 1 time er vanligvis målt når studere aldersrelatert hukommelsessvikt fordi dette form av minne vises spesielt sårbare for virkningene av aldring ^11-13. Et bredt spekter av atferdsmessige og genetiske kontroller utføres med minne eksperimenter, for eksempel, for å avgjøre om en forestilling feil er på grunn av en sentral minne defekt eller en perifer sensorisk defekt som hindrer fly fra sensing støt eller lukte cue ^{5 -7, 1 7, 25,26.}

Protocol

1. Fly Forberedelse

1. Parre alle mutanter, Gal4 / UAS og andre linjer med en villtype belastning, for eksempel CSw-, i minst seks generasjoner før de atferdsmessige eksperimenter for å kontrollere for genetiske bakgrunn ^26.
2. Dyrk fluer på en vanlig maismel, gjær og melasse mat diett under en 12:12 timers lys-mørke-syklus ved 25 ° C med mindre spesielle manipulasjoner krever en annen temperatur.
   1. Å fastslå effekten av transgene uttrykk: Bruk 18 ° C for å unngå uttrykket av transgener i Gal4 Gal80 ^ts (TARGET system) gjennom utvikling og deretter flytte fluene til en 30 ° C inkubator 1-2 dager før atferds eksperiment. Gjennomføre forsøket ved 30 ° C for å fastslå effekten av transgen ekspresjon ^3,4,6,7,14.
   2. For eksperimenter med varmeaktivert TRPA1 kanaler for å stimulere nerveceller: Hev fluene ved 23 ° C, noe som er en temperatur kjentfor å opprettholde en uvirksom kanal, og deretter skifte til en atferd rom ved 30 ° C for å aktivere TRPA1 uttrykker neuroner.
   3. For eksperimenter med Shibire ^{temperaturfølsom} å blokkere synaptiske utgang ^{11, 14,24:} Bakre fluene ved 18 ° C og foreta testing ved 30 ° C.
3. Samle fluene 1-2 dager før forsøket og telle dem i grupper på ca 25 under lett CO ₂ anestesi. Oppbevar fluene minst O / N i matvare ampuller (uten gjær) ved 25 ° C (med mindre spesielle manipulasjoner som kreves forskjellig temperatur) og 70% relativ fuktighet i et miljømessig kontrollert rom med 12:12 timers lys: mørke forhold til tiden av eksperimentet.
   Merk: Denne lagrings tillater fluene til å akklimatisere til den påfølgende læring test utført i miljømessig kontrollert rommet, som hadde de optimale forhold for Drosophila læring og, viktigere, fjerner daglig omgivsige variasjoner som kan ha påvirket atferds fenotype.

2. Klargjøring før forsøket

1. Utføre eksperimentene i en skreddersydd pleksiglass T-labyrint (Figur 1).
2. Kontroller regelmessig røret montering for å sikre at en lufttett tetning er oppnådd under forsøket. Hvis det er nødvendig, endrer O-ringene som tetter innsiden avdelinger av T-labyrint.
3. Plasser skreddersydde kobbernett innenfor opplærings rør. Sjekk og rengjør disse nett regelmessig, og skift ut om oksidert. Fest kobbernett til ledninger via krokodilleklemmer som kjører en switch-boks koblet til en elektrisk stimulator. Bruk et voltmeter for å sikre at anordningen er å levere den nødvendige støt.
4. Bruk G-klemmer til å holde labyrinten tett for å unngå luftlekkasje.
5. Fest T-labyrinten til rør som går til en luftpumpe, for å tillate lukt til å bli trukket på tvers av fluer og senere fjernet fra T-labyrint. Oppretthold mild luftflyte på ~ 2 L / min

3. Lukt fortynninger

1. Bruk to forskjellige lukt ved konsentrasjoner slik at fluene en lik preferanse for både lukt. Bruk 4-metylcykloheksanol (1:67) og 3-oktanol (1: 100) fortynnet i mineralolje ^7,13.
   Merk: Nøye bestemme disse konsentrasjoner, som vil variere etter laboratorium. For eksempel andre bruker 01:10 for både lukt ^24. Andre vanlig brukte lukt omfatter etylacetat og iso-amyl acetat.
2. Pipetter 30 pl av den fortynnede lukt i en skreddersydd lukt koppen plasseres i en lukt blokk dekket av et plastrør med en perforert topp som tillater luft å bli trukket over lukt i koppen, og dermed utsette fluene til en lukt plume.

4. Trenings Protocol (figur 1 og 2)

1. For voksen lukte sjokk condition, utføre alle eksperimenter under a svakt rødt lys (ie., Rød LED), som tillater forskeren å se, men hindrer fly fra å se, og dermed gir fluene til å konsentrere seg om luktesans i motsetning til visuelle innganger.
2. Introduser fluene i trenings røret og deretter legge til T-labyrint og tillate dem å tilpasse seg røret og luftstrøm for 90 sek.
3. Presentere den første lukt (4-metylcykloheksanol, MCH) med en 60-V sjokk (som består av tolv 1,25 sek pulser med 3,75 sek inter-puls intervaller) for en samlet varighet på 60 sek.
4. Følg sjokk med en 30 sek hvileperiode uten lukt eller støt.
5. Presenter den andre lukt (3-oktanol, OCT) for 60 sek uten et sjokk.
6. Følg sjokk med en 30 sek hvileperiode uten lukt eller støt.
7. Beveg fluene fra trenings kammer inn i det sentrale kammer i T-labyrinten ved å slå T-labyrint på høykant og forsiktig banking på bunnen av T-labyrint på et mykt underlag, for eksempel en gamle musematte. Opprettholde flyr i det sentrale kammer for 90 sek.
8. Monter valg rør inn i bottom av anordningen til å danne T-labyrint.
9. For å måle læring, beveger fluene til valg punktet for T-labyrint, hvor de ble samtidig utsatt for både lukt og bevege seg mot en. Gjennomføre en testperiode for 120 sek.
10. Trap fluene i valg rør ved å bevege den sentrale kammer opp dermed blokkerer endene av valget rør. Samle fluene i hver arm av T-labyrint og i den sentrale rommet i mat ampuller og teller.
11. For å måle hukommelse, samle fluene etter trening (4,6) og overføre dem fra T-labyrint til mat ampuller uten gjær. Lagres flyr i mørke ved 25 ° C og 70% fuktighet for den resterende tid som er nødvendig for å bestemme minnefasen av interesse (se innledning). Gjeninnføre fluene til T-labyrint som i stadium 4.7.
12. For langtidshukommelsen, bruke en tilpasset bygget labyrint som gjør at flere grupper av fluer å bli trent samtidig. Administrer 5 sykluser med trening med en 15 min inter-syklus intervall (spaCED) eller uten en inter-syklusintervall (massed). Opprettholde fluene ved 18 ° C og 70% luftfuktighet i mørket før testing. Før testing, bevege fluene til 25 ° C og tillate dem å akklimatisere seg i minst 1 time. Vurdere langtidshukommelsen 24 timer etter trening.
13. Etter de atferdsmessige eksperimenter, rense lukt kopper med varmt vann og luktfri vaskemiddel. Etter tørking frakk koppene med 10 mL sigmacote. Tørk sigmacote ved oppvarming i en mikrobølgeovn. Bør rengjøre den T-labyrint perspex rør og lukt blokker med varmt vann og luktfri vaskemiddel.

5. Beregning av Performance Index: Et mål på Fluer 'minne

1. Beregn Performance Index (PI) for hver tilstand som antall fluer unngå støt-paret lukt (CS ^-) minus antall fluer som velger sjokk-paret lukt (CS ⁺⁾ delt på totalt antall fluer (CS ^- + CS ^{+) 1.}
   Performance indeks (PI) = (# CS ^- flyr - # CS ⁺ flyr) / (# Total fluer)
2. Beregn den endelige PI av eksperimentet ved gjennomsnitt PI av forsøket der MCH var sjokk-parede lukt og en der oktober var sjokk-parede lukt. Dette fjerner eventuelle skjevheter av fluene som har en høyere preferanse for en lukt.

6. sensorimotor Controls

1. Utfør lukt skarphet ved å innføre ~ 40-50 fluer i T-labyrint ^6,7,17.
2. Etter 90 sek, flytte fluene til valg punktet, og tillate dem 2 min å velge mellom rene lukt og luft.
3. Samle og telle fluene. Beregn unngåelse prosent ved å dividere det totale antall fluer som valgte lukt av de som deltok i testen.
4. For sjokk reaktivitet ^6,7,17, introdusere fluene inn i sjokk kammeret.
5. Etter 90 sekunders hvile, administrerer en 60 V DC elektrisk støt, der fluene kan unnslippe til et tilsvarrør uten støt.
6. Tillat 2 min for fluene å velge; samle og telle fluene. Beregn sjokk unngåelse prosenten ved å dele antall fluer som unngikk sjokket ved å slippe unna sjokkrør av det totale antall fluer i forsøket. Inkludere fluene som forblir i det sentrale kammer i alt de som unnslapp elektrisk støt.

Representative Results

Ytelsen indeks (PI) tjener som et mål på hukommelse. Tabell 1 viser en representativ beregning av PI.

MCH paret med sjokk	3-Oct paret med sjokk
Fluer unngå MCH (i oktober tube) = 80 Fluer foretrakk MCH (i MCH tube) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0.6	Fluer unngå OCT (i MCH tube) = 75 Fluer foretrakk OCT (i oktober tube) = 25 PI = 2 (75-25) / (75 + 25) = 0.5
PI av forsøket = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tabell 1. En representativ beregning av ytelsesindeksen ved hjelp av illustrerende data. Ytelsesindekser for forskjellige eksperimenter kan sammenlignes med klarhukommelseseffekter. Når en sliksammenligningen er vist i figur 3, som inneholder resultatene fra en serie forsøk utført med Canton S villtype voksne fluer (WT) og mutant dunce lære voksne fluer ^1. Gjennomsnittet av 10 PI er gitt, med feilfelt som representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Disse resultater viser at narre fluer viser en reduksjon i å lære i forhold til villtype.

Figur 1. Den voksne eksperimentelle oppsettet. Fluene er trent og testet i en T labyrint. Treningen innebærer å presentere en lukt A med elektrisk støt etterfulgt av en annen lukt B uten elektrisk støt. Etter en hvileperiode i midten kammer fluene presenteres med både lukt samtidig. Fluene er fangeti de to rørene og samles og telles for å oppnå læring / minne score.

Figur 2. Den voksne opplæring protokollen. Blir Fluene trening i to trinn. Det første trinnet der fluer får en lukt (CS +) paret med elektrisk støt (US) for 60 sek. I neste trinn fluer mottar et nytt lukt (CS-) uten elektrisk støt. Fluer er da lov til å hvile i 90 sek etter at de er testet for deres valg mellom CS + og CS-.

Figur 3. En representant graf som viser dunce og villtype læring i voksen Drosophila. dunce fluer ble testet etter en økt med trening. Dunce fluer viser en reduksjon i å lære i forhold til WT (n = 10).

Discussion

Drosophila voksen lukte sjokk læring analysen som presenteres her tillater analyse av de molekylære mekanismene bak ulike faser av minne, inkludert langtidsminnet ^15-17. I tillegg til bestemmelse av effekten av cirkadianske rytmer ^18, søvn ^19, diett ^20,21, senescence ^11-13, nevrodegenerativ sykdom ⁵ og medikamentbehandlinger ^5,6,19 på hukommelse.

Mange kraftige tilnærminger har nylig blitt utviklet for den funksjonelle avbildning av de nevrale kretser som formidler olfactory minne i fluer ^{3,4,7,11,16,27.} Disse optogenetic teknikker bruker enormt repertoar av ulike arrangører tilgjengelig i Drosophila ^14,16. Disse arrangører er vant til å uttrykke genetisk kodet kalsium og cAMP reportere i minnet nevroner ^16,27 for å studere effekten av spesifikke genfeil på minne spor.

The bruk av betingede arrangører og mutasjoner hos voksne tillater studie av post-utviklings rollen et genprodukt i minnet ^{3,4,6,7,13,14.} Avbildning og atferdsmessige metoder kan kombineres med lys-og varme-aktiverte kanalene for å stimulere eller inhibere forskjellige nerveceller i minnekretsen ^{11,14,16,22-24} for ytterligere å klargjøre deres funksjon. Videre sopp kroppen minne nevroner er tilgjengelige for hel-celle patch clamp opptak ^28, og matematiske og beregningsorientert teknikker blir brukt til å modellere Drosophila lukte minne ^29.

Disse eksperimentelle fremskritt, kombinert med ulike former for assosiativ hukommelse protokoller introdusert her, la Drosophila som skal brukes til å modellere molekylær- og krets-nivå endringer i assosiativ hukommelse som oppstår i respons til belønning, straff, motivasjon, avhengighet, aldring og sykdom ^{5,6,11-13,16,30-31.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Octanol	Sigma	218405
4-Methyl cyclohexanol	Sigma	15309-5
Benzaldehyde	Sigma	418099
Mineral oil	Fluka	BP2629-1
Hexyl acetate	Sigma	108154
Fructose	Sigma	F0127
Agarose	Bioline	BIO-41025