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Neuroscience

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Published: August 7, 2014 doi: 10.3791/50107
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1, 1
1Physiology and Pharmacology, University of Bristol

Summary

Die Methode, die erwachsenen Drosophila Assoziativspeicher messen beschrieben. Der Test basiert auf der Fähigkeit der Fliege, einen Geruch mit einem negativen Verstärker (elektrischer Schlag) vorgestellt verbinden und dann erinnern diese Informationen zu einem späteren Zeitpunkt, so dass Speicher gemessen werden kann.

Abstract

Drosophila in klassischen Konditionierung Experimente über 40 Jahren verwendet worden, so stark erleichtert das Verständnis des Speichers, einschließlich der Aufklärung der molekularen Mechanismen der kognitiven Erkrankungen 1-7 beteiligt. Lernen und Gedächtnis in Larven, die Wirkung von Neuroentwicklungsgene 8-10 studieren und in Fliegen untersucht werden, um den Beitrag der Erwachsenen Plastizität Gene 1-7 messen. Darüber hinaus ist die kurze Lebensdauer von Drosophila erleichtert die Analyse von Genen der Vermittlung altersbedingten Gedächtnisstörungen 5,11-13. Die Verfügbarkeit von vielen Promotoren, die das Nervensystem zu unterteilen Drosophila macht es möglich zu bestimmen, wann und wo ein Gen von Interesse für normale Speicher sowie Relais verschiedener Aspekte des Verstärkungssignals 3,4,14,16 erforderlich.

Studieren Speicher bei erwachsenen Drosophila ermöglicht eine detaillierte Analyse derVerhalten und Komponenten bestehen und eine Messung des Langzeitspeichers 15 -17. Die Länge der erwachsenen Stadium beherbergt längerfristigen genetischen, Verhaltens-, Ernährungs-und pharmakologische Manipulationen des Gedächtnisses, zusätzlich zur Bestimmung der Wirkung des Alterns und neurodegenerativer Erkrankungen auf der Speicher 3-6,11-13,15-21.

Klassische Konditionierung wird durch die gleichzeitige Präsentation einer geruchsneutral Cue (bedingten Reiz, CS +) und einer Verstärkung Stimulus, wie zB., Einem elektrischen Schlag oder Saccharose, (unbedingter Reiz, USA), die miteinander durch das Tier assoziiert werden induziert 1,16. Eine zweite bedingten Reiz (CS -) wird anschließend ohne die USA vorgestellt. Während der Testphase werden Drosophila gleichzeitig mit CS + und CS-Gerüche präsentiert. Nachdem die Drosophila Zeit zwischen den Gerüchen wählen vorgesehen, ist die Verteilung der Tiere aufgezeichnet. Dieses Verfahren alTiefs assoziativ aversiven oder appetitive Anlage zuverlässig ohne Vorspannung, die durch die angeborene Vorliebe für eine der beiden Reize konditioniert eingeführt gemessen werden. Verschiedene Kontrollexperimente werden auch durchgeführt, um zu testen, ob alle Genotypen reagieren normalerweise auf Geruch und Verstärkung allein.

Introduction

Die hier vorgestellte Methode ist, dass durch Tully und Quinn mit einigen kleinen Modifikationen 1 beschrieben. Der Versuch wird in zwei Phasen durchgeführt: die Fliegen in der ersten Phase ausgebildet und die ausgebildeten Fliegen werden in der zweiten Phase getestet. Während der Ausbildung sind eine Gruppe von Fliegen gleichzeitig Geruch ausgesetzt 1 (CS +) und einen elektrischen Schlag (US) in einem Trainings Röhre. Die Fliegen erhalten dann Geruch 2 (CS -) ohne einen elektrischen Schlag. Diese einzige Paarung von einem bestimmten Geruch mit einem Schock wird als 1-Zyklus-Ausbildung, und die Gerüche, die am häufigsten verwendet werden, sind 4-methylcyclohexanol (MCH) und 3-Octanol (OCT).

Ein-Zyklus-Training führt zur Bildung eines labilen Phase des Speichers, der für bis zu 7 Stunden nachgewiesen werden kann; jedoch ist der Speicher in der Regel sofort getestet, um festzustellen, was bezeichnet Lernen, Erwerb oder 2 min Speicher. Speicher gemessen bei 30 min oder 1 h wird als Kurzzeitgedächtnis bezeichnet, während3 Stunden Speicher wird als Halbzeit-Speicher bezeichnet. Die Belichtung von Fliegen zu wiederholende Trainingszyklen mit Lücken zwischen den Trainingszyklen (Abstand Training) führt zu einer konsolidierten Form von Langzeitgedächtnis, das CREB-Transkriptions abhängig ist und dauert bis zu einer Woche. Training ohne Lücken (massierten Ausbildung) führt zur Bildung von Anästhesie-resistenten Speicher (ARM), die ähnlich wie das Langzeitgedächtnis, wird typischerweise nach 5 Zyklen Ausbildung 7,13,15-17,20,21 gemessen 24 Stunden.

Mit diesem Ansatz kann die Wirkung verschiedener Gen-Mutationen in diesen verschiedenen Phasen des Speichers bestimmt. Der Promotor getriebene Expression von licht oder temperaturempfindlichen Transgene zu aktivieren oder blockieren die neuronale Aktivität bestimmter Nervenzellen erlaubt es, zu untersuchen, welche Nervenzellen für Speicher Akquisition, Konsolidierung und Wieder 3,4,11,15,16,20 erforderlich sind, 22-24. Speicher bei 1 h wird in der Regel gemessen, wenn das Studium altersbedingten Gedächtnisstörungen, da diese form von Speicher scheint besonders anfällig für die Auswirkungen der Alterung 11-13. Eine vollständige Palette von Verhaltens-und genetischen Kontrollen mit Memory-Experimente durchgeführt, um beispielsweise festzustellen, ob eine Leistung, Mangel wegen eines zentralen Speicher-Defekt oder eine periphere sensorische Defekt, der die Fliege verhindert Erfassung der Schlag oder olfaktorische Stimmung 5 -7, 1 7, 25,26.

Protocol

1. Fly Vorbereitung

  1. Auskreuzung alle Mutanten, Gal4 / Fachhochschulen und anderen Strecken mit einer Wildtyp-Stamm, wie CSW-, für mindestens sechs Generationen vor den Verhaltensexperimente für genetische Hintergrund 26 steuern.
  2. Wachsen Fliegen auf einem Standard-Maismehl, Hefe und Melasse Ernährung unter einem 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus bei 25 ° C, wenn nicht gezielte Manipulationen erfordern eine andere Temperatur.
    1. Um zu bestimmen, die Auswirkungen der transgenen Expression: Verwenden Sie 18 ° C, um die Expression von Transgenen in Gal4 Gal80 ts (TARGET-System) durch Entwicklung zu verhindern und bewegen Sie dann die Fliegen zu einer 30 ° C-Inkubator 1-2 Tage vor dem Verhaltensexperiment. Führen das Experiment bei 30 ° C, um die Auswirkungen der Expression des Transgens 3,4,6,7,14 bestimmen.
    2. Für Experimente unter Verwendung von wärmeaktivierten TRPA1 Kanäle Neuronen stimulieren Hebe die Fliegen bei 23 ° C, was eine Temperatur bekannt ist,einen inaktiven Kanal zu halten und dann zu einem Verhalten Zimmer verlagern bei 30 ° C, um die TRPA1 exprimieren Neuronen zu aktivieren.
    3. Für Experimente mit temperaturempfindlichen shibire synaptische Ausgabe 11, 14,24 blockieren: Hinten die Fliegen bei 18 ° C und führen Tests bei 30 ° C.
  3. Sammeln die Fliegen 1-2 Tage vor dem Experiment und zählen sie in Gruppen von etwa 25 unter Licht CO 2 Anästhesie. Speichern die Fliegen mindestens O / N in der Lebensmittelgefäße (ohne Hefe) bei 25 ° C (wenn nicht gezielte Manipulationen erforderlich eine andere Temperatur) und 70% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Klimaraum mit 12.12 h Licht: Dunkelheit, bis die Zeit des Experiments.
    Hinweis: Diese Lagerung ermöglicht die Fliegen an der anschließenden Lerntest im Klimaraum, die die optimalen Bedingungen für Lernen Drosophila durchgeführt hatte akklimatisieren und, besonders wichtig, entfernt alle täglich ENVIwelt Variationen, die die Verhaltens Phänotyp beeinflusst haben könnten.

2. Vorbereitung vor dem Experiment

  1. Führen Sie die Experimente in einem maßgeschneiderten Plexiglas T-Labyrinth (Abbildung 1).
  2. Überprüfen Sie regelmäßig die Rohrverbindung, um sicherzustellen, dass eine luftdichte Abdichtung während des Experiments erhalten. Falls nötig, ändern Sie die O-Ringe, die die Innenfächer der T-Labyrinth zu versiegeln.
  3. Zeigen maßgeschneiderte Kupfergitter im Inneren der Rohre Ausbildung. Kontrollieren und reinigen Sie diese Netze regelmäßig, und wenn oxidiert ersetzen. Befestigen Sie die Kupfergitter, Drähte über Krokodilklemmen, die an einem Schalter-Kasten mit einer elektrischen Stimulator verbunden laufen. Mit einem Voltmeter, um sicherzustellen, dass das Gerät liefert die erforderliche Schock.
  4. G-Klemmen, um das Labyrinth fest zu halten, um die Luft Auslaufen zu verhindern.
  5. Befestigen Sie die T-Labyrinth zu Schlauch, der mit einer Luftpumpe läuft, damit Gerüche, über die Fliegen ausgelost und anschließend von der T-Labyrinth entfernt. Pflegen milde Luftfließen bei ~ 2 L / min

3. Geruch Verdünnungen

  1. Verwenden Sie zwei verschiedene Gerüche in Konzentrationen, so dass die Fliegen zeigen eine gleiche Vorliebe für beide Gerüche. Verwenden Sie 4-methylcyclohexanol (1:67) und 3-Octanol (1: 100) in Mineralöl 7,13 verdünnt.
    Hinweis: Diese Konzentrationen, die durch Labor variieren werden sorgfältig zu bestimmen. Zum Beispiel andere verwenden 1.10 für beide Gerüche 24. Andere üblicherweise verwendete Gerüche umfassen Ethylacetat und iso-Amylacetat.
  2. Pipette 30 ul der verdünnten Geruch in einem maßgeschneiderten Geruch in einer Tasse mit einem Kunststoffrohr mit einem perforierten Oberseite, die Luft über den Geruch in der Tasse gezogen werden können abgedeckt Geruch Block platziert, setzt dadurch die Fliegen zu einer Geruchswolke.

4. Training Protocol (Abbildungen 1 und 2)

  1. Für erwachsene olfaktorischen Schock Anlage, führen alle Versuche unter einem schwachen Rotlicht (dh., Rote LED), die der Forscher zu sehen, können aber verhindert, dass die fly vom Sehen, so dass die Fliegen auf den Geruchssinn konzentrieren, im Gegensatz zu visuellen Eingänge.
  2. Einführung der Fliegen in die Ausbildung Rohr und dann dem T-Labyrinth zu befestigen und ihnen zu ermöglichen, um die Röhre und der Luftstrom 90 s anzupassen.
  3. Präsentieren die erste Geruch (4-methylcyclohexanol, MCH) mit einem 60-V-Schock (bestehend aus zwölf 1,25 sec Pulse mit 3,75 sec Zwischenimpulsintervalle) für eine Gesamtdauer von 60 Sekunden.
  4. Folgen Sie den Schock mit einem 30 sec Ruhezeit ohne Geruch oder Schock.
  5. Präsentieren den zweiten Geruch (3-Octanol, OCT) für 60 Sekunden ohne eine Schock.
  6. Folgen Sie den Schock mit einem 30 sec Ruhezeit ohne Geruch oder Schock.
  7. Bewegen Sie die Fliegen aus dem Trainingsraum in der zentralen Kammer des T-Labyrinth durch Drehen des T-Labyrinth auf die Seite und schlug sanft die Unterseite der T-Labyrinth auf einer weichen Oberfläche wie einem alten Mäusematte. Pflegen Sie die Fliegen in der zentralen Kammer für 90 Sekunden.
  8. Montieren Sie die Wahl Rohre in den bottom der Vorrichtung, um das T-Labyrinth bilden.
  9. Lernen zu messen, zu bewegen, die Fliegen auf die Wahl Punkt der T-Labyrinth, wo sie gleichzeitig an beide Gerüche ausgesetzt und bewegen sich in Richtung eines. Führen Sie eine Testphase für 120 Sekunden.
  10. Falle die Fliegen in den Röhren Wahl, indem Sie die zentrale Kammer bis blockieren dadurch die Enden der Rohre Wahl. Sammeln Sie die Fliegen in jedem Arm der T-Labyrinth und in der zentralen Kammer in Essen Fläschchen und Zahl.
  11. Um Speicher zu messen, sammeln die Fliegen nach dem Training (4.6) und übertragen Sie sie von der T-Labyrinth, um Nahrung Fläschchen ohne Hefe. Shop fliegt im Dunkeln bei 25 ° C und 70% Luftfeuchte für die verbleibende Zeit notwendig, um die Speicherphase von Interesse zu bestimmen (siehe Einleitung). Wieder einführen, die Fliegen an der T-Labyrinth wie in Stufe 4.7.
  12. Für das Langzeitgedächtnis, verwenden Sie eine benutzerdefinierte gebaut Labyrinth, die mehrere Chargen von Fliegen, gleichzeitig trainiert werden können. Verwalten 5 Zyklen der Ausbildung mit 15 min inter-Zyklusintervall (spaCED) oder ohne inter-Zyklusintervall (massiert). Halten die Fliegen bei 18 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit in der Dunkelheit bis zur Prüfung. Vor der Prüfung zu bewegen, die Fliegen bis 25 ° C und es ihnen ermöglichen, für mindestens 1 Stunde akklimatisieren. Beurteilen Langzeitgedächtnis 24 Stunden nach dem Training.
  13. Nach den Verhaltensexperimenten, reinigen Sie die Geruchs Tassen mit heißem Wasser und Reinigungsmittel geruchlos. Nach dem Trocknen Mantel die Tassen mit 10 ul Sigmacote. Trockne die Sigmacote durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen. Gelegentlich reinigen Sie den T-Labyrinth Plexiglasröhren und Geruch Blöcke mit heißem Wasser und Reinigungsmittel geruchlos.

5. Die Berechnung der Performance-Index: ein Maß für die Fliegen 'Memory

  1. Berechnung des Leistungsindex (PI) für jede Bedingung wie die Anzahl der Fliegen Vermeidung der Schock-gekoppelten Geruch (CS -) minus die Anzahl der Fliegen Wahl der Stoß gepaart Geruch (CS +), geteilt durch die Gesamtzahl der Fliegen (CS - + + CS) 1.
    Performance Index (PI) = (# CS - fliegt - # CS + fliegt) / (# Gesamtlinie)
  2. Berechnen Sie die letzte PI des Experiments durch Mittelung der PI der Versuch, bei dem MCH war der Schock gepaarten Geruch und eine, in der Oktober war der Schock gepaarten Geruch. Dies entfernt jegliche Vorspannung der Fliegen, die eine höhere Präferenz für einen Geruch.

6. Sensomotorische Kontrollen

  1. Führen Geruchsschärfe durch die Einführung von ~ 40-50 Fliegen in der T-Labyrinth 6,7,17.
  2. Nach 90 sec, bewegen die Fliegen auf die Wahl Punkt, und es ihnen ermöglichen 2 min zwischen reinen Gerüche und Luft wählen.
  3. Sammeln und zählen Sie die Fliegen. Berechnen der Vermeidung Prozentsatz durch Dividieren der Gesamtzahl der Fliegen, die den Geruch von denen, die in dem Test teilgenommen gewählt.
  4. Schock für Reaktivität 6,7,17, stellen die Fliegen in den Schockraum.
  5. Nach 90 Sekunden der Ruhe, zu verwalten eine 60-V-DC-Stromschlag, von dem die Fliegen können zu einem ähnlichen entkommenRohr ohne ein Schock.
  6. Lassen Sie 2 min für die Fliegen zu wählen; sammeln und zählen die Fliegen. Berechnen der Stoßvermeidungsprozent, indem die Anzahl der Fliegen, die den Schock vermieden durch die Flucht des Stoßwellenrohrs mit der Gesamtzahl der in dem Experiment entfernt. Sind die Fliegen, die in der zentralen Kammer in der Gesamt von denen, die den Elektroschock entgangen sein.

Representative Results

Der Leistungsindex (PI) dient als Maß für die Speicher. Tabelle 1 stellt eine repräsentative Berechnung PI.

MCH gepaart mit Schock 3-OCT gepaart mit Schock
Fliegen vermeiden MCH (in OCT-Rohr) = 80
Fliegen lieber MCH (MCH in Rohr) = 20
PI 1 - (80-20) / 80 + 20)
= 0,6 		Fliegen vermeiden OCT (MCH in Rohr) = 75
Fliegen lieber OCT (OCT Rohr) = 25
PI 2 = (75-25) / (75 + 25)
= 0,5
PI des Experiments = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tabelle 1. Ein Vertreter Berechnung des Performance-Index mit anschaulichen Daten. Leistungsindizes für verschiedene Experimente können verglichen werden, um Memory-Effekte aufzuklären. Sobald solchVergleich ist in Figur 3, die die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten mit Canton S erwachsenen Fliegen Wildtyp (WT) und mutierten dunce Lern erwachsenen Fliegen 1 ausgeführt enthält gezeigt. Der Mittelwert von 10 PIs vorgesehen ist, wobei die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert (SEM). Diese Ergebnisse zeigen, dass Narren Fliegen zeigen eine Reduktion in das Lernen im Vergleich zum Wildtyp.

Figur 1
Abbildung 1. Die erwachsenen Versuchsaufbau. Die Fliegen sind geschult und in einem T-Labyrinth getestet. Die Ausbildung beinhaltet die Präsentation einen Geruch A mit elektrischer Schlag, gefolgt von einem zweiten Geruch B ohne elektrischen Schlag. Nach einer Ruhezeit in der mittleren Kammer die Fliegen mit den beiden Gerüche gleichzeitig präsentiert. Die Fliegen sind gefangenin den beiden Röhren und gesammelt und gezählt, um Lernen / Speicherstände zu erhalten.

Figur 2
Abbildung 2. Die Erwachsenenbildung Protokoll. Die Fliegen werden in zwei Schritten trainiert. Der erste Schritt, wo Fliegen erhalten einen Geruch (CS +), gepaart mit Elektroschock (US) für 60 Sekunden. Im nächsten Schritt erhalten fliegt eine zweite Geruch (CS) ohne elektrischen Schlag. Fliegen werden dann für 90 Sekunden, wonach sie für ihre Wahl zwischen CS und CS + getestet ruhen.

Fig. 3
Abbildung 3. Ein Vertreter Graph, der Dummkopf und Wildtyp Lernen in der Erwachsenen Drosophila. Narren Fliegen wurden folgende einer Sitzung der Ausbildung geprüft. Narren Fliegen zeigen eine Reduktion in Learning im Vergleich zum WT (n = 10).

Discussion

Die Drosophila erwachsenen Riech Schock Lern Assay ermöglicht hier vorgestellten Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen verschiedenen Phasen der Erinnerung, einschließlich Langzeitgedächtnis 15-17. Sowie die Bestimmung der Wirkung von circadianen Rhythmen 18, 19 Schlaf, Ernährung 20,21, Seneszenz 11-13, neurodegenerative Erkrankung, 5 und medikamentöse Behandlungen auf 5,6,19 Speicher.

Viele mächtige Ansätze wurden vor kurzem für die funktionelle Bildgebung der neuronalen Schaltkreise, die olfaktorische Gedächtnis in Fliegen 3,4,7,11,16,27 vermitteln entwickelt. Diese optogenetischen Techniken verwenden, die große Repertoire der verschiedenen Promotoren in Drosophila 14,16. Diese Promotoren werden verwendet, um genetisch kodierte Kalzium und cAMP-Reporter in den Speicher Neuronen 16,27 äußern, um die Wirkung von bestimmten Gen-Mutationen auf Erinnerungsspuren zu untersuchen.

The Einsatz von Promotoren und bedingte Mutationen bei Erwachsenen ermöglicht die Untersuchung des postEntwicklungs Rolle eines Genprodukts im Speicher 3,4,6,7,13,14. Bildgebung und Verhaltens Ansätze mit licht-und wärmeaktivierte Kanäle zu stimulieren oder zu hemmen verschiedene Neuronen in der Speicherschaltung 11,14,16,22-24 ihrer Funktion weiter aufzuklären kombiniert werden. Außerdem Pilzkörper Neuronen Speicher zugänglich sind Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen 28 und mathematische und computergestützte Techniken werden eingesetzt, um Drosophila Riech Speicher 29 zu modellieren.

Diese experimentellen Fortschritte, kombiniert mit den verschiedenen Formen der hier vorgestellten Assoziativspeicher Protokolle ermöglichen Drosophila verwendet werden, um die molekular und Schaltungsebene Veränderungen in assoziativen Speicher, die in Reaktion auftreten, zu belohnen, Strafe, Motivation, Sucht-Modell werden, Altern und Krankheit 5,6,11-13,16,30-31.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir erkennen an, Bloomington Lager Zentren für die Fliege Belastung. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendium BBSRC (BB / G008973 / 1) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Octanol Sigma 218405
4-Methyl cyclohexanol Sigma 15309-5
Benzaldehyde Sigma 418099
Mineral oil Fluka BP2629-1
Hexyl acetate Sigma 108154
Fructose Sigma F0127
Agarose Bioline BIO-41025

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