Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Summary

Il metodo per misurare adulti Drosophila memoria associativa è descritta. Il test si basa sulla capacità della mosca per associare un odore presentato con un rinforzo negativo (folgorazione) e poi richiamare queste informazioni in un secondo momento, permettendo di memoria da misurare.

Abstract

Drosophila sono stati utilizzati in esperimenti classici di condizionamento da oltre 40 anni, in tal modo facilitando notevolmente la nostra comprensione della memoria, compreso il chiarimento dei meccanismi molecolari coinvolti in malattie cognitive ^1-7. Apprendimento e memoria possono essere dosati in larve per studiare l'effetto dei geni dello sviluppo neurologico ^8-10 e in mosche per misurare il contributo dei geni plasticità adulti ^1-7. Inoltre, la breve durata della Drosophila facilita l'analisi dei geni che mediano relativo all'età di memoria impairment ^5,11-13. La disponibilità di molti promotori inducibili che suddividono il sistema nervoso Drosophila permette di determinare quando e dove è richiesto un gene di interesse per la memoria normale così come relè di diversi aspetti del segnale di rinforzo ^3,4,14,16.

Memoria Studiare in adulti Drosophila permette una dettagliata analisi delcomportamento e circuiteria interessato e una misurazione di memoria a lungo termine ^{15 -17.} La lunghezza della fase adulta ospita manipolazioni genetiche, comportamentali, dietetiche e farmacologiche a lungo termine della memoria, oltre a determinare l'effetto di invecchiamento e malattie neurodegenerative sulla memoria ^{3-6,11-13,15-21.}

Condizionamento classico è indotta dalla presentazione simultanea di una stecca odore neutro (stimolo condizionato, CS ⁺⁾ ed uno stimolo di rinforzo, ad es., Scosse elettriche o saccarosio, (stimolo incondizionato, USA), che siano associati tra loro con l'animale ^1,16. Uno stimolo seconda condizionato (CS ^-) viene successivamente presentata senza gli Stati Uniti. Durante la fase di test, Drosophila sono contemporaneamente presentati con CS + e CS-odori. Dopo la Drosophila sono fornite tempo di scegliere tra gli odori, la distribuzione degli animali viene registrato. Questa procedura albassi associative condizionata repulsivo o appetitivo per essere attendibilmente valutato senza pregiudizi introdotto dalla preferenza innata per uno degli stimoli condizionati. Vari esperimenti di controllo vengono eseguiti anche per verificare se tutti i genotipi rispondono normalmente odori e rinforzo da solo.

Introduction

Il metodo qui presentato è quello descritto da Tully e Quinn con alcune piccole modifiche ^1. L'esperimento viene eseguito in due fasi: le mosche sono formati nella prima fase, e le mosche addestrati sono testati nella seconda fase. Durante l'allenamento, un gruppo di mosche sono contemporaneamente esposti agli odori 1 (CS ⁺⁾ e una scossa elettrica (US) in un tubo di formazione. Le mosche quindi ricevono odore 2 (CS ^-), senza una scossa elettrica. Questo singolo accoppiamento di un odore particolare con una scossa si chiama formazione 1-ciclo, e gli odori che vengono utilizzati più di frequente sono 4 METILCICLOESANOLO (MCH) e 3-ottanolo (OCT).

Formazione Un ciclo porta alla formazione di una fase labile di memoria che può essere rilevato fino a 7 ore; tuttavia, la memoria è in genere testato immediatamente per determinare ciò che viene definito apprendimento, acquisizione o 2 min di memoria. Memoria misurata a 30 min o 1 ora viene indicato come la memoria a breve termine, mentre3 hr memoria viene definita come memoria intermedia. L'esposizione di mosche per cicli di formazione ripetitivi con spazi tra i cicli di formazione (formazione distanziati) conduce ad una forma consolidata di memoria a lungo termine, che è la trascrizione CREB dipendente e dura fino a una settimana. Formazione senza lacune (formazione concentrati) porta alla formazione di memoria anestesia-resistente (ARM), che simile alla memoria a lungo termine, viene tipicamente misurata 24 ore dopo 5 cicli di formazione ^{7,13,15-17,20,21.}

Con questo approccio, l'effetto di varie mutazioni geniche su queste diverse fasi di memoria può essere determinato. L'espressione promotore-driven di transgeni leggeri o sensibili alla temperatura per attivare o bloccare l'attività neuronale dei neuroni specifici permette di indagare quali i neuroni sono necessari per l'acquisizione della memoria, il consolidamento e il recupero ^{3,4,11,15,16,20, 22-24.} Memoria a 1 ora è in genere misurata quando si studia compromissione della memoria legati all'età, perché questo form di memoria appare particolarmente vulnerabili agli effetti dell'invecchiamento ^11-13. Una gamma completa di controlli comportamentali e genetici vengono eseguiti con esperimenti di memoria, per esempio, per determinare se un difetto prestazione è causa di un difetto di memoria centrale o un difetto sensoriale periferica che impedisce al volo da rilevamento shock o cue olfattiva ^{5 -7, 1 7, 25,26.}

Protocol

1. Fly Preparazione

1. Outcross tutti i mutanti, Gal4 / UAS ed altre linee con un ceppo di tipo selvatico, come CSw-, per almeno sei generazioni prima degli esperimenti comportamentali per il controllo di background genetico ^26.
2. Crescere mosche su una farina di mais, lievito e melassa cibo dieta standard nell'ambito di un ciclo luce-buio 00:12 ore a 25 ° C, a meno manipolazioni specifiche richiedono una temperatura diversa.
   1. Per determinare gli effetti di espressione del transgene: Usa 18 ° C per impedire l'espressione di transgeni in (sistema TARGET) Gal4 Gal80 ^ts attraverso lo sviluppo e quindi spostare le mosche per un incubatore a 30 ° C 1-2 giorni prima che l'esperimento comportamentale. Condurre l'esperimento a 30 ° C per determinare gli effetti di espressione del transgene ^3,4,6,7,14.
   2. Per gli esperimenti che utilizzano i canali TRPA1-attivati ​​dal calore per stimolare i neuroni: Sollevare linea a 23 ° C, che è una temperatura notamantenere un canale inattivo, e poi passare a una camera comportamento a 30 ° C per attivare la TRPA1 esprimendo neuroni.
   3. Per gli esperimenti che utilizzano ^temperature Shibire ^sensibile di bloccare l'uscita sinaptica ^{11, 14,24:} posteriore linea a 18 ° C e condurre test a 30 ° C.
3. Raccogliere le mosche 1-2 giorni prima dell'esperimento e le considero in gruppi di circa 25 sotto la luce di CO ₂ l'anestesia. Conservare le mosche almeno O / N in fiale alimentari (senza lievito) a 25 ° C (a meno manipolazioni specifiche necessarie una temperatura diversa) e umidità relativa del 70% in una stanza con la luce ambiente controllato 00:12 hr: condizioni di buio fino al momento dell'esperimento.
   Nota: Questo deposito consente in linea di raggiungere la prova di apprendimento successivo effettuato nella stanza ambiente controllato, che aveva le condizioni ottimali per l'apprendimento Drosophila e, soprattutto, elimina ogni queto quotidianovariazioni ambien- che potrebbero essere colpiti fenotipo comportamentale.

2 Preparazione prima dell'esperimento

1. Eseguire gli esperimenti in perspex T-labirinto su misura (Figura 1).
2. Controllare regolarmente il raccordo al fine di garantire una chiusura ermetica che si ottiene durante l'esperimento tubo. Se necessario, cambiare gli O-ring che sigillano i compartimenti interni della T-labirinto.
3. Posizionare le griglie di rame su misura all'interno dei tubi di formazione. Controllare e pulire le griglie regolarmente, e sostituire se ossidato. Fissare le griglie di rame a fili con clip a coccodrillo che corrono a uno switch-box collegato ad uno stimolatore elettrico. Utilizzare un voltmetro per assicurarsi che l'apparecchio sta erogando la scossa necessaria.
4. Utilizzare g-morsetti per tenere il labirinto saldamente per evitare perdite di aria.
5. Collegare il T-labirinto di tubi che corre ad una pompa ad aria, per consentire gli odori da trarre attraverso le mosche e successivamente rimossi dal T-labirinto. Mantenere l'aria miteportata a ~ 2 L / min

3. Odore diluizioni

1. Utilizzare due odori differenti a concentrazioni tali che le mosche mostrano una preferenza uguale per entrambi gli odori. Utilizzare 4-METILCICLOESANOLO (1:67) e 3-ottanolo (1: 100) diluito in olio minerale ^7,13.
   Nota: determinare accuratamente queste concentrazioni, che variano da laboratorio. Ad esempio, altri usano 01:10 per entrambi gli odori ^24. Altri odori comunemente usati includono acetato di etile e acetato di iso-amile.
2. Pipettare 30 ml di odore diluito in una tazza odore misura collocato in un blocco odore coperto da un tubo di plastica con una parte superiore forata che permette all'aria di essere disegnato sopra l'odore nella tazza, esponendo così le mosche per un pennacchio odore.

4. Formazione Protocol (figure 1 e 2)

1. Per l'adulto olfattiva scossa condizionata, effettuare tutti gli esperimenti sotto una luce rossa fioca (es., LED rosso), che consente al ricercatore di vedere, ma impedisce la fly da vedere, permettendo così in linea di concentrarsi sul olfatto al contrario di input visivi.
2. Introdurre le mosche nel tubo di formazione e poi allegare alla T-labirinto e consentire loro di adattarsi al tubo e flusso d'aria per 90 secondi.
3. Presentare il primo odore (4-METILCICLOESANOLO, MCH), con una scossa di 60 V (composto da dodici impulsi di 1,25 sec con intervalli tra impulsi 3.75 sec) per una durata complessiva di 60 sec.
4. Seguire lo shock con un periodo di riposo di 30 secondi, senza un odore o scosse.
5. Presentare il secondo odore (3-ottanolo, OCT) per 60 sec senza scosse.
6. Seguire lo shock con un periodo di riposo di 30 secondi, senza un odore o scosse.
7. Spostare linea dalla camera di addestramento nella camera centrale del T-labirinto ruotando il T-labirinto su un lato e delicatamente sbattere fondo del T-labirinto su una superficie morbida come un vecchio tappetino mouse. Mantenere le mosche nella camera centrale per 90 secondi.
8. Montare i tubi di scelta nel bottom dell'apparato per formare il T-labirinto.
9. Per misurare l'apprendimento, spostare le mosche al punto di scelta del T-labirinto, dove sono stati esposti contemporaneamente ad entrambi gli odori e muoversi verso uno. Eseguire un periodo di prova per 120 sec.
10. Trappola linea nei tubi scelta facendo scorrere la camera centrale fino in tal modo bloccando le estremità dei tubi di scelta. Raccogliere le mosche in ogni braccio della T-labirinto e nel vano centrale in fiale alimentari e conteggio.
11. Per misurare la memoria, raccogliere le mosche dopo l'allenamento (4.6) e trasferirli dal T-labirinto per fiale alimentari senza lievito. Conservare vola al buio a 25 ° C e 70% di umidità per il tempo necessario rimanente per determinare la fase memoria di interesse (vedi introduzione). Reintrodurre le mosche al T-labirinto come in fase 4.7.
12. Per la memoria a lungo termine, utilizzare un labirinto costruito su misura che consente a numerosi lotti di mosche per essere formati contemporaneamente. Somministrare 5 cicli di formazione con un 15 min inter-ciclo intervallo (spaced) o senza un intervallo inter-ciclo (ammassate). Mantenere in linea a 18 ° C e 70% di umidità nel buio fino a prova. Prima della prova, spostare le mosche a 25 ° C e consentire loro di acclimatare per almeno 1 ora. Valutare memoria a lungo termine 24 ore dopo l'allenamento.
13. Dopo gli esperimenti comportamentali, pulire le tazze odore con acqua calda e detersivo inodore. Dopo l'essiccazione, cappotto le tazze con 10 microlitri Sigmacote. Essiccare il Sigmacote mediante riscaldamento in un forno a microonde. Di tanto in tanto pulire il T-labirinto in perspex tubi e blocchi odore con acqua calda e detersivo inodore.

5 Calcolo del Performance Index: una misura della Memoria delle mosche "

1. Calcolare il Performance Index (PI) per ogni condizione, come il numero di mosche evitando l'odore shock accoppiati (CS ^-) meno il numero di mosche che scelgono l'odore shock accoppiati (CS ⁺⁾ diviso per il numero totale di mosche (CS ^- + ⁺ CS) ^1.
   PeIndice rformance (PI) = (# CS ^- vola - # CS ⁺ aria) / (# mosche totali)
2. Calcolare il PI finale dell'esperimento la media della PI dell'esperimento in cui MCH era l'odore shock associato e quello in cui ottobre è stato l'odore di shock-accoppiato. Ciò elimina ogni distorsione delle mosche che hanno una maggiore preferenza per un odore.

6. Controlli sensomotoria

1. Eseguire odore acutezza introducendo ~ 40-50 mosche nel T-labirinto ^6,7,17.
2. Dopo 90 sec, spostare le mosche al punto di scelta, e permettere loro 2 min di scegliere tra odori puri e aria.
3. Raccogliere e contare le mosche. Calcolare la percentuale di evasione dividendo il numero totale di mosche che hanno scelto l'odore da parte di coloro che hanno partecipato alla prova.
4. Per urti reattività ^6,7,17, introdurre le mosche nella camera di shock.
5. Dopo 90 secondi di riposo, somministrare una scossa elettrica di 60 V DC, da cui le mosche possono sfuggire a una similetubo senza shock.
6. Lasciare 2 min per le mosche di scegliere; raccogliere e contare le mosche. Calcolare la percentuale di shock evitare dividendo il numero di mosche che evitare lo shock da sfuggire al tubo d'urto per il numero totale di mosche in dell'esperimento. Includere le mosche che rimangono nella camera centrale del totale di coloro che sfuggiva la scossa elettrica.

Representative Results

L'indice di prestazione (PI) serve come misura di memoria. La tabella 1 illustra un calcolo rappresentante di PI.

MCH accoppiato con scossa	3 ottobre accoppiato con scossa
Mosche evitando MCH (in tubo di ottobre) = 80 Le mosche preferiscono MCH (in tubo di MCH) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6	Mosche evitando ottobre (in tubo di MCH) = 75 Le mosche preferiscono ottobre (in tubo di ottobre) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0.5
PI dell'esperimento = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tabella 1 Un calcolo rappresentativo dell'indice di prestazione utilizzando i dati illustrativi. Indici di prestazione per diversi esperimenti può essere paragonato a chiarire gli effetti di memoria. Una volta che taleconfronto è mostrato in Figura 3, che contiene i risultati di una serie di esperimenti effettuati con il Canton S mosche adulte di tipo selvatico (WT) e ignorante di apprendimento mutante adulto vola ^1. La media di 10 PI è fornita, con barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Questi risultati dimostrano che le mosche somaro mostrano una riduzione di apprendimento rispetto al tipo selvatico.

Figura 1 L'adulto set-up sperimentale. Le mosche sono addestrati e testati in un labirinto T. La formazione implica che presenta un odore A con scosse elettriche, seguito da un secondo odore B senza scosse elettriche. Dopo un periodo di riposo nella camera centrale linea sono rappresentati con entrambi gli odori contemporaneamente. Le mosche sono intrappolatinei due tubi e raccolti e contati per ottenere punteggi di apprendimento / memoria.

Figura 2 Il protocollo di formazione degli adulti. Le mosche si allena in due fasi. Il primo passo in cui le mosche ricevono un odore (CS +) in coppia con scosse elettriche (US) per 60 sec. Nella fase successiva mosche ricevono un secondo odore (CS), senza scosse elettriche. Le mosche sono quindi autorizzati a riposare per 90 secondi dopo di che sono stati testati per la loro scelta tra CS + e CS.

Figura 3 Un grafico rappresentativo che mostra somaro e l'apprendimento di tipo selvatico in adulti Drosophila. asino sono stati testati dopo una sessione di allenamento. Mosche somaro mostrano una riduzione di apprendimento rispetto al WT (n = 10).

Discussion

La Drosophila adulto choc olfattivo apprendimento saggio qui presentato consente l'analisi dei meccanismi molecolari alla base diverse fasi di memoria, tra cui memoria a lungo termine ^15-17. Così come la determinazione degli effetti dei ritmi circadiani sonno ^{18, 19, 20,21,} dieta senescenza ^11-13, malattia neurodegenerativa ⁵ e trattamenti farmacologici ^5,6,19 sulla memoria.

Molti approcci potenti sono state recentemente sviluppate per l'imaging funzionale dei circuiti neurali che mediano la memoria olfattiva di mosche ^{3,4,7,11,16,27.} Queste tecniche optogenetic utilizzano il vasto repertorio dei diversi promotori disponibili in Drosophila ^14,16. Questi promotori sono usati per esprimere geneticamente codificati calcio e cAMP giornalisti nei neuroni di memoria ^16,27 per studiare l'effetto di mutazioni geniche specifiche sulle tracce di memoria.

The l'uso di promotori condizionali e mutazioni negli adulti permette lo studio del ruolo post-sviluppo di un prodotto genico nella memoria ^{3,4,6,7,13,14.} Imaging e approcci comportamentali possono essere combinati con canali leggeri e termo-attivo per stimolare o inibire diversi neuroni nel circuito di memoria ^{11,14,16,22-24} per chiarire ulteriormente la loro funzione. Inoltre, i neuroni della memoria del corpo fungo sono accessibili a cellule intere registrazioni di patch clamp ^28, e le tecniche matematiche e computazionali vengono utilizzati per modellare Drosophila memoria olfattiva ^29.

Questi progressi sperimentali, combinati con le diverse forme di protocolli di memoria associativa introdotte qui, consentono di Drosophila da utilizzare per modellare le molecular- ea livello di circuito cambiamenti nella memoria associativa che si verificano in risposta alla ricompensa, punizione, la motivazione, la dipendenza, l'invecchiamento e le malattie ^{5,6,11-13,16,30-31.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Octanol	Sigma	218405
4-Methyl cyclohexanol	Sigma	15309-5
Benzaldehyde	Sigma	418099
Mineral oil	Fluka	BP2629-1
Hexyl acetate	Sigma	108154
Fructose	Sigma	F0127
Agarose	Bioline	BIO-41025