Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء Published: January 2, 2013 doi: 10.3791/50112

Summary

وهناك طريقة لعزل الكريات البيض التهابات الأوعية الدموية الملتصقة من الدماغ من

Abstract

وصفنا طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الالتهابية تمسكا من الأوعية الدموية في الدماغ من P. berghei ANKA المصابين الفئران. إصابة السلالات الحساسة الفأر مع هذه النتائج سلالة الطفيلي في استحثاث الملاريا الدماغية التجريبية، وهي متلازمة عصبية أن يجمل جوانب هامة معينة من الملاريا المنجلية المتصورة بوساطة شديد في 1،2 البشر. أشكال ناضجة من الدم في مرحلة التعبير عن الملاريا الطفيلية البروتينات على سطح كرات الدم الحمراء للمصاب، مما يسمح لهم لربط الخلايا البطانية في الأوعية الدموية. هذه العملية يدفع عوائق في تدفق الدم، مما يؤدي إلى نقص الأكسجة والنزيف 3 و يحفز أيضا تجنيد الكريات البيض الالتهابية إلى موقع تنحية الطفيليات.

على عكس غيره من الأمراض والفيروسات neutrotopic أي 4-6، على حد سواء الملاريا الطفيلي خلايا الدم الحمراء (pRBC) وكذلك يرتبط بها من inflammالكريات البيض atory تبقى المحتبسة داخل الأوعية الدموية بدلا من التسلل لحمة الدماغ. وبالتالي لتجنب التلوث من الكريات البيض مع المنظمات غير المعزول للالتهابات الخلايا المنتشرة، نضح intracardial واسعة من الفئران المصابة قبل استخراج الجهاز ومعالجة الأنسجة هو مطلوب في هذا الإجراء لإزالة الدم المقصورة. بعد نضح، ويتم حصاد العقول وتشريح في قطع صغيرة. وتعطلت كذلك بناء الأنسجة عن طريق العلاج الأنزيمية مع collagenase وI. D الدناز يتم طرد جناسة الدماغ ثم الناتجة عن الانحدار الذي يسمح Percoll الفصل بين الدماغ المعزول الكريات البيض (BSL) من المايلين وغيرها من الحطام الأنسجة. عد الخلايا ثم تغسل المعزولة، وذلك باستخدام عدادة الكريات والملون مع الأجسام المضادة للتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخلوي.

هذا الإجراء يسمح توصيف المظهري شاملة من الكريات البيض الالتهابية الهجرة إلى الدماغ في إعادةاالستجابة للمؤثرات المختلفة، بما في ذلك السكتة الدماغية وكذلك العدوى الفيروسية أو الطفيلية. الأسلوب يوفر أيضا أداة مفيدة لتقييم العلاجات المضادة للالتهابات رواية في النماذج الحيوانية ما قبل السريرية.

Protocol

1. إصابة الفئران مع P. berghei-ANKA

  1. وقسامة من تذويب P. cryopreserved berghei ANKA pRBC.
  2. كبح الدماغيه الملاريا المقاومة للالماوس المانحة BALB / ج (8-12 أسابيع من العمر) باستخدام تقنية ضبط النفس باليدين. حقن الماوس مع 100-200 ميكرولتر من استخدام الأنسولين pRBC 1 مل حقنة (إبرة 28G). بشكل روتيني، يتم حقن الفئران المانحة 1-2.
  3. على بعد 4-5 أيام العدوى (PI) إزالة الماوس المانحة من القفص ووضعه على محطة عمل أو لوحة المتاح العمل.
  4. كبح بلطف الماوس في نهاية الذيل وباستخدام مقص صغير قطع رأس الذيل (حوالي 1 ملم). وبدلا من ذلك، يمكن أن يقوم ثقب صغير الذيل باستخدام إبرة G 25.
  5. وضع قطرة من الدم من الوريد ذيل الماوس بالقرب من نهاية شريحة المجهر بلوري النهائي.
  6. ضع شريحة الثانية (رش) على زاوية 45 درجة ودعمه في قطرة من الدم. مرة واحدة في الدم ينتشر على طول الحافة، ودفع عشية رش الشريحةنلي عبر المجهر الشريحة لجعل مسحة الدم. السماح للتشويه للهواء الجاف.
  7. إصلاح مسحات الدم في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية ثم وصمة عار في بالغيمزا الشرائح الطازجة لمدة 10 دقيقة.
  8. شطف مع مسحة الدم المياه الجارية لمدة 1 دقيقة، السماح ليجف في الهواء وفحص الشريحة تحت المجهر (الغمر النفط 100X،). تعداد الكريات الحمراء pRBC داخل 1000 وحساب تطفلن الدم في المئة. يجب أن تصل إلى مستويات الفئران المانحة تطفلن الدم بين 2،5-5٪ قبل أن يتم نزف للإصابة حيوانات التجارب.
  9. جمع الدم من الجهات المانحة عن طريق الماوس الرجعية المدارية النزيف باستخدام heparinized الدقيقة الهيماتوكريت أنبوب شعري. يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لوالتر وإليزا هول معهد متطلبات الحيوان جنة الأخلاقيات. قد اعتمادا على المتطلبات المحلية الحيوان جنة الأخلاق أن تستخدم الإجراءات الدموية الأخرى. حل الكمية المطلوبة من الدم في المتوسط ​​RPMI في تركيز النهائي من مل 6 pRBC/0.2 1X10. نعتبر أنوالهيماتوكريت الماوس العادي ~ 6x10 9 خلايا الدم الحمراء / 1 مل.
  10. تصيب C57BL التجريبية / 6 الفئران (8-12 أسابيع من العمر) عن طريق حقن الغشاء البريتونى (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 مل.
  11. تطفلن الدم لرصد مستويات من الفئران المصابة اتبع الخطوات من 1،3-1،8. وينبغي أن تحدد كل 2-3 أيام تطفلن الدم بدءا من اليوم 2 أو 3 بي
  12. الطوقية بداية الملاريا الحادة في C57BL / 6 الفئران قد تظهر كما مظهر التقوس والفراء وقليلة النشاط. قد يكون بعض الفئران استرداد في هذه المرحلة، ولكن التقدم إلى فقدان الذات المنعكس التقويمي يشير المرض لا رجعة فيه، ويجب أن يتم التخلص الحيوانات.

2. Intracardial الإرواء من الفئران واستخراج الدماغ

  1. تجميع نضح خطورة دليل النظام من خلال تأمين خزان 500 مل إلى صاحب عمود تعلق على الجزء العلوي من العمود موقفا 60 سم. الاتصال أنابيب بلاستيكية إلى نهاية الجزء السفلي من الخزان وتأمين أنابيب المشبك للتحكم في تدفق العازلة. نعلق أنابيب إلى إبرة G 23. فيلل يصل الخزان مع PBS (C ° الاحتفاظ بها في 22)، افتح المشبك والسماح لتشغيل المخزن المؤقت من خلال أنابيب لإزالة جميع فقاعات الهواء.
  2. الموت ببطء P. berghei ANKA المصابين الماوس عن طريق الاستنشاق 2 CO. تأكيد وفاة بسبب غياب دواسة، المدارية والردود في الجهاز التنفسي.
  3. دبوس الماوس الموت الرحيم من قبل الكفوف هند وأمام ظهريا على لوحة تشريح الستايروفوم الواردة في علبة من البلاستيك. يمكن اعتمادا على تخدير موضعي الأخلاق الحيوانية متطلبات اللجنة أن تدار بدء مسبقة من pefusion intracardial.
  4. مسح الجانب البطني مع الايثانول 70٪.
  5. استخدام مقص وملقط كبير لفتح الجلد على طول خط الوسط لفضح تجويف الصدر. أضعاف، ودبوس الجلد على الجانبين.
  6. عقد القص مع ملقط الغرامة وخفض الحجاب الحاجز وعلى طول جانبي القص قطع الأضلاع. والحرص على عدم إتلاف أي الأوعية الدموية الكبيرة.
  7. دبوس القفص الصدري بواسطة القص المقبل فضفاضة في الرأس.
  8. عقد البطينين الطرافةح ملقط غرامة والأذين الأيمن شق بعناية مع مقص غرامة.
  9. إدراج إبرة 23G تعلق على نظام نضح جاذبية في البطين الأيسر والشريان الأورطي نحو تصاعدي في حين PBS قيد التشغيل. إدراج 0.5 سم فقط من طرف الإبرة.
  10. يروي الماوس لمدة 5 دقائق أو حتى النفايات السائلة واضح.
  11. بفصل الماوس ووضع على البطن. مسح الرأس مع الايثانول 70٪.
  12. باستخدام مقص كبير، وجعل قطع فقط فوق منطقة النخاع الشوكي عنق الرحم.
  13. استخدام مقص غرامة لجعل متوسط ​​الذيلية-منقاري قطع ابتداء من قاعدة الجمجمة وقشر الجلد بعيدا لفضح الجمجمة.
  14. عقد رئيس، ضع شفرات مقص صغير لفي كل جوف الحجاج وتقديم قطع بين المدارات.
  15. جعل خفض طولية على طول الدرز السهمي وقشر بعناية الجمجمة على كل نصف الكرة المخ الخارج.
  16. باستخدام ملعقة، ورفع بلطف الدماغ ووضعه في أنبوب الطرد المركزي 10 مل تحتوي على RPMI المتوسط.

3. عزل الدماغ المعزول الكريات البيضاء (BSL)

  1. العمل في مجلس الوزراء السلامة، والمكان المقطوع حديثا الدماغ على رأس مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ الخلية (40-60 حجم فتحات الشباك) في طبق بتري تحتوي على 3-5 مل من الأنسجة RPMI متوسطة الثقافة.
  2. قطع أنسجة المخ إلى أجزاء صغيرة.
  3. دفع قطع صغيرة من أنسجة المخ من خلال مصفاة الخلية باستخدام المكبس وضوح الشمس.
  4. نقل جناسة الدماغ إلى أنبوب الطرد المركزي 10 مل وعند 250 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. حل بيليه في 3 مل من المتوسط ​​RPMI، تحتوي على 0.05٪ كولاجيناز D و2U/ml I. الدناز
  6. تدوير الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الحطام الخلية عن طريق دفع الخليط من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر النايلون و / أو عن طريق احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  7. وضع جناسة الدماغ على وسادة مل 7 Percoll 30٪ وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج (بلا فرامل) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من الدم الحمراء الخلية تحلل العازلة واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق إلىليز pRBC تمسكا، والتي لا يمكن إزالتها من الدماغ عن طريق نضح intracardial.
  9. أضف 9 مل من المتوسط ​​RPMI، وغسل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
  10. إعادة تعليق BSL التي تحتوي على بيليه في 50-100 ميكرولتر من الخلايا المتوسطة RPMI ونقل إلى أنبوب إيبندورف.
  11. قسامة تخفيف من 5-10 ميكرولتر من العينة خلية باللون الأزرق التريبان 01:02 لتحديد خلايا قابلة للحياة.
  12. عد خلايا قابلة للحياة تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. ابتداء من اليوم بي 6، عندما P. berghei ANKA الفئران المصابة عرض علامات العصبية، يمكن استرداد 20،000-100،000 BSLs.

4. المناعي الظاهري من BSL من قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان

  1. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونضح طاف بيليه و resuspend في 50 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (PBS، 1٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 2 مم EDTA).
  2. إضافة ميكرولتر 1 من تنقية anti-CD16/32 الأجسام المضادة (Fcblock).
  3. احتضان خلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد.
  4. غسل الخلايا مع 1 مل من الاحتياطي تلطيخ. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نضح طاف.
  5. إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على تلطيخ محددة مسبقا التخفيفات الأمثل من الأجسام المضادة المطلوبة الفلورسنت، أي المضادة للCD4، ومكافحة CD8، ومكافحة TCR ومكافحة NK1.1.
  6. احتضان لمدة 1 ساعة على الجليد.
  7. غسل الخلايا مع 1 مل من الاحتياطي تلطيخ. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نضح طاف.
  8. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  9. نقل الخلايا إلى أنبوب تدفق البلاستيك الخلوي.
  10. باستخدام قياس التدفق الخلوي، والحصول على ما لا يقل عن 5،000-10،000 الأحداث. وينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة الخلية غير ملوثين وعينات التعويض ملون تألقي كما هو مطلوب.
  11. تحليل النتائج باستخدام البرمجيات المناسبة التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج في الشكل. عرض النسب المئوية (2) والأعداد المطلقة للسكان BSL مختلفة تعافى من أدمغة الفئران perfused أو unperfused مكافحة الملاريا المصابين والسذاجة. كانت ملطخة معزولة BSL مع PE-المضادة للNK1.1 والأجسام المضادة APC-المضادة للTCR-β كما هو مشار إليه في نص البروتوكول. تتألف خلايا T + αβTCR تتفق مع النتائج السابقة 7-9، نسبة عالية من تجمع BSL في أدمغة الفئران المصابة بالملاريا perfused (يوم 6 بي). ظهرت هذه الفئة من السكان لتكون ممثلة تمثيلا ناقصا بشكل كبير في أدمغة الحيوانات غير perfused (الشكل 2A-B). وارتبط انخفاض واضح من الترددات خلية T في أدمغة غير perfused مع نسبة أعلى بكثير والعدد الكلي للخلايا النفي المزدوج (αβTCR - NK1.1 -) في هذه الحيوانات (الشكل 2A-B). وكانت نسبة عالية والأرقام على الخلايا السلبية مزدوجة في أدمغة unperfused لم يتم الكشف عن الملاريا فقط في الفئران المصابة ولكن أيضا في وحدة دولية NAمل؛ الضوابط هاء، مما يشير إلى أن هذه الخلايا غير قابلة للالتهابات الكريات البيض موجودة في الأوعية الدموية في الدماغ الذي يتم استردادها مع الخلايا الالتهابية إذا لم يتم تنفيذ نضح intracardial.

وترد مثالين المزيد من التحليل BSL في الشكل. (3) والشكل. 4. لفترة وجيزة، أصيب C57BL / 6 الفئران مع P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). وقد أثبتت الجمعيات الزمنية بين تجنيد الكريات البيض إلى الدماغ وظهور الأعراض العصبية (بين 6-8 يوم PI) في P. berghei ANKA إصابة الفئران 7-9. في هذا المثال خاص، والموت الرحيم الملاريا على الفئران المصابة يوم 6 بي، وكانت منقاه BSL كما هو موضح في النص البروتوكول. كانت ملطخة معزولة BSL مع PE-المضادة للNK1.1، APC-المضادة للTCR-β-CD4 FITC المضادة لل، والأجسام المضادة PerCPCy5.5 مضادة للCD8α. تم الحصول على عينات باستخدام تدفق عداد الكريات العلوم البيولوجية دينار بحريني FACSCalibur وتحليل أداء باستخدام البرمجيات ابن عرس 3.0.1. بواسطةكانت الخلايا بلي بوابات من الأمام والجانب مبعثر. النسب المئوية للخلايا NK، T والخلايا الليمفاوية NKT (TCR + + NK1.1 الخلايا) المحتجزين في دماغ الفئران المصابة بالملاريا والسذاجة-(يوم 6 بي) مبينة في لوحات الأعلى (الشكل 3A). لوحات تظهر النسب المئوية للأسفل CD4 + + CD8 والخلايا اللمفية تي NK1.1 بين بوابات - αβTCR + الخلايا (الشكل 3A). التين. 3B يصور مثال الذي تم حساب الأعداد المطلقة للCD4 + + CD8 والدماغ المعزول خلايا T على يوم 6 بي مع P. berghei ANKA. بشكل عام، يمكن استرداد 20،000-100،000 BSL من أدمغة P. berghei الفئران المصابة ANKA. عدة عوامل مثل بي الوقت، قد قابلية للسلالة الماوس أو إدراج العلاجات المضادة للالتهابات تؤثر الانتعاش الخلية. بشكل روتيني، واحدة الدماغ الفردية يوفر خلايا كافية للمجموعة 1 من stainings الأجسام المضادة.

في المثال الوارد في فايز. تم تحليل مستقبلات chemokine 4 استخدام الخلايا الليمفاوية T الدماغ المعزول. أصيب الفئران مع P. تم عزل berghei ANKA وBSL في يوم كانت ملطخة 6 خلايا β-PI مع APC-المضادة للTCR، PE-المضادة للCXCR3 والأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز مضادة للCCR5، تليها الحضانة مع المتقارن-PerCPCy5.5 streptavidin. عينات تم الحصول عليها وتحليلها وفقا للشكل. 3. وتمثل النسب المئوية المدرج الاحصائي من الخلايا + αβTCR بين BSL الكلي في الفئران المصابة مكافحة الملاريا والسذاجة. كفاف قطع الأراضي في وسط وأسفل لوحات تظهر النسب المئوية للCXCR3 + + وCCR5 الخلايا داخل αβTCR بوابات + الخلايا.

الشكل 1
مخطط تدفق الرقم 1. من إجراءات العزل وتحليل BSL من P. berghei ANKA المصابين الفئران. (1) A قسامة cryopreseved من P. ويذوب الثلج berghei ANKA pRBC ويصاب الفئران المانحة 1 أو 2. (2) وتحسب المستويات الأربعة أيام في وقت لاحق من الفئران parsitemia المانحة والفئران المانحة التخفيفات بليد والدم المعدة للإصابة فئران التجارب. ثم يتم تعيين عدوى الملاريا في عام C57BL بالملاريا عرضة شديد / الفئران 6. (3) وفي بي 5-7 أيام، يصرح باستخدامها في الفئران عن طريق الاستنشاق 2 CO وعلى الفور perfused intracardially لإزالة كافة تعميم غير ملتصقة الخلايا. (4) ثم يتم حصاد الأمخاخ ويتم فصل ثم جناسة الدماغ التي أعدتها هضم الأنسجة مع D collagenase والدناز BSL I. من المايلين والحطام الخلية عن طريق التدرج Percoll. (5) معجل BSL ثم تغسل، تحسب باستخدام عدادة الكريات، ملطخة الأجسام المضادة الفلورسنت وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.

ether.within صفحة = "دائما"> الشكل 2
الشكل 2. تحليل BSL في أدمغة الفئران perfused أو unperfused. أصيب C57BL / 6 الفئران مع P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). تم حصادها على العقول بي 6 أيام من الحيوانات أو perfused unperfused. تم عزل BSL، ملطخة الأجسام المضادة المقاومة للNK1.1 والفلورسنت مكافحة TCR وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. (A) قطع دوت تصور النسب المئوية للخلايا NK، الخلايا الليمفاوية T، NK1.1 + + TCR الخلايا والخلايا النفي المزدوج NK1.1 - TCR - في perfused (لوحات أعلى) أو unperfused (لوحات القاع) الفئران المصابة مكافحة الملاريا والسذاجة . (B) تم حساب العدد المطلق للخلايا الليمفاوية والنفي المزدوج T وعلى يوم 6 بي مع P. berghei ANKA والسيطرة على الفئران السذاجة. كل شريط represeاليلة الوسط من 3 عينات ± SEM، * P> 0.05.

الشكل 3
ويمكن الكشف عن الشكل 3. خلايا NK واللمفاويات T في أدمغة P. berghei الفئران المصابة ANKA. أصيب C57BL / 6 الفئران مع P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). تم استخراج العقول على بي بعد 6 أيام التروية من الحيوانات الموت الرحيم. تم عزل BSL، ملطخة NK1.1 المضادة، المضادة للTCR، ومكافحة CD4 CD8 والأجسام المضادة لمكافحة الفلورسنت وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. (A) لوحات تصور الأعلى النسب المئوية للخلايا NK، والخلايا الليمفاوية T + NK1.1 TCR + الخلايا في الفئران المصابة مكافحة الملاريا والسذاجة. لوحات توضح النسب المئوية للأسفل CD4 + + CD8 الخلايا وT + بوابات داخل αβTCR NK1.1 - (B) والعدد المطلق للدماغ المعزول CD4 + وحسبت CD8 + الخلايا التائية على يوم 6 بي مع P. berghei ANKA والسيطرة على الفئران السذاجة. كل شريط يمثل متوسط ​​± SEM من 3 عينات.

الشكل 4
الشكل 4. غالبية الخلايا الليمفاوية T الهجرة إلى الدماغ استجابة لعدوى الملاريا الحادة تعبر عن مستقبلات chemokine CXCR3. أصيب C57BL / 6 الفئران مع P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). تم استخراج العقول على بي بعد 6 أيام التروية واسعة من الحيوانات الموت الرحيم. تم عزل BSL، ملطخة TCR المضادة، ومكافحة CXCR3 الأجسام المضادة المقاومة للCCR5 وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. لوحات تصور أفضل النسب المئوية للαβT الخلايا الليمفاوية في الفئران المصابة مكافحة الملاريا والسذاجة. المؤامرات كفاف توضيح النسب المئوية للCXCR3 + (لوحات الأوسط) وCCR5 + (اللوحة السفلية) الخلايا الليمفاوية داخل بوابات + αβTCR.

مشكلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها
ناقصة التروية
  • تأكد من أن PBS هو في درجة حرارة الغرفة قبل perfusing الفئران.
  • يجب الحرص على عدم نيك الأوعية الدموية التي تقع تحت القفص الصدري.
  • كن حذر بعدم أجهزة أي نيك (مثل الكبد) عندما فتح تجويف الصدر.
  • ضبط معدل تدفق PBS مل إلى 5 ~ / دقيقة. لن الدم يمكن إزالتها بسرعة كافية إذا كان تدفق بطيء للغاية، مما قد يؤدي إلى جلطات. إذا كان تدفق سريع جدا، قد ضغط مرتفع قد يضر الأوعية الدموية الصغيرة.
  • لا يدخل الإبرة بعيدا فيإلى البطين الأيسر حيث أن ذلك قد بيرس الحاجز. لتجنب هذا الأمر، رسم 5 إختر مم من رأس الإبرة لاستخدامها كدليل.
لا يكفي تعافى BSL
  • تحقق من تطفلن الدم P. berghei الفئران المصابة ANKA. على بي 5-6 يوم، ويتوقع الفئران للوصول إلى ~ تطفلن الدم 4-7٪.
  • تحقق كولاجيناز D والدناز I التركيز في كوكتيل الهضم. قد لا يكفي حل وسط انتعاش الانزيمات الخلية.
  • تمديد الهضم الأنزيمي من أنسجة المخ يصل إلى 1 ساعة.

الجدول 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عزل وتحليل BSL هو وسيلة تسمح توصيف وتقدير من الخلايا الالتهابية الهجرة إلى الدماغ استجابة لإصابة الأنسجة أو العدوى في نماذج الماوس التجريبية. إدخال خطوة نضح intracardial لإزالة المقصورة الدم قبل استخراج الجهاز والعزلة اللاحقة خلية مفيد لمنع التلوث من الخلايا الالتهابية مع المنظمات غير التهابات الكريات البيض الجائلة. قد لا يكون هذا شرطا أساسيا في الأمراض مثل فيروس موجه للعصب التهاب الدماغ و النخاع الفئران في الخلايا الالتهابية التي تخترق الدماغ حمة ولكن له أهمية خاصة في مكافحة الملاريا القوارض، الكريات الحمراء المصابة التي والكريات البيض الالتهابية تبقى المحتبسة داخل الأوعية الدموية بدلا من التسلل أنسجة المخ . وفقا لذلك، لا ينبغي نضح intracardial من الملاريا الفئران المصابة فقط أن يوصى بها لتحليل BSL لكن يمكن أيضا أن يكون مفيدا للتقييم الطفيل النسيج تنحية 10،11. مماثلة لالتهابات الكريات البيض غير المتداولة، وأشكال غير ناضجة من طفيليات الملاريا غير قادر على الانضمام إلى البطانة الوعائية، وينبغي إزالتها عن طريق إجراء نضح. في المقابل، pRBC ملتصقة (schizonts ناضجة) ويبدو أن تبقى ضمن الأوعية الدموية في الدماغ. P. وقد ولدت berghei ANKA الطفيليات المعدلة وراثيا معربا عن وسيفيراز 12 و موردا قيما لهذا النوع من التحليل. بعد الإصابة مع وسيفيراز، معربا عن خطوط، يمكن تحديد الطفيلي الأنسجة العزل عن طريق التصوير من العقول perfused من الحيوانات المصابة باستخدام نظام IVIS 10،11. A المقارنة المباشرة لعزل الطفيلي في أيام 6-7 في بي أدمغة الحيوانات perfused وأدمغة الفئران المصابة بالطفيليات مراسل مرحلة محددة و(أي التعبير عن وسيفيراز فقط خلال المرحلة المتقسمة) أن تكون مفيدة لمزيد من التحقق من صحة هذه الطريقة.

واحدالمهم العيب من النهج التقليدي للتحليل النسيجي للخلايا الأنسجة التسلل هو أن هذه التقنيات لا تسمح للسكان تقييم الخلية التي تتطلب الاعتراف علامة الخلية أكثر من واحد لتحديد هويتهم (أي NK1.1 + + αβTCR CD1d المقيدة NKT أو CD4 + + T Foxp3 الخلايا التنظيمية). على عكس الأنسجة، وتحليل تدفق cytometric من الكريات البيض الالتهابية هو قابل للstainings الأجسام المضادة متعددة، وتوفير أداة مفيدة للغاية لتوصيف المظهري شامل لتتسرب الخلوية 7،9،13. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو حساسة بما يكفي للكشف عن الخلايا التي تحدث السكان على ترددات منخفضة تصل إلى 1-3٪ من إجمالي التسلل داخل الأوعية، بما في ذلك ليس فقط المحلية ولكن أيضا خلايا نقل adoptively وكذلك خلايا T مستضد محددة. P. berghei ANKA الطفيليات المعدلة وراثيا معربا عن MHC I الحواتم وMHC II-المقيدة من OVA 14 + CD8 + T من الخلايا OT-I الفئران يمكن أن يتم الكشف عن BSL من بين Ly5.2 + C57BL / 6 الفئران المصابة PbTG، وتوفير دليل على أن الخلايا T التهابات الهجرة إلى الدماغ في ردا على الملاريا طفيلي محددة 14.

تحليل BSL مفيد أيضا لتقييم إمكانات العلاجات المضادة للالتهابات رواية في النماذج الحيوانية ما قبل السريرية. على سبيل المثال، تم قدرة الاجسام المضادة ضد بروتين الإنترفيرون γ CXCR3-محرض chemokine 10 (IP-10) لمنع تسلل داخل الأوعية الدماغ والتخفيف من حدة أعراض المرض المرتبطة بالملاريا الحادة أثبتت بنجاح باستخدام هذاالطريقة 11.

واحد الحد أن هذا الأسلوب قد يكون هو أن العدد الإجمالي للخلايا الدماغ تعافى من الأفراد عموما بما فيه الكفاية لمجموعة واحدة من stainings الأجسام المضادة. قد تكون هناك حاجة بالتالي التجارب منفصلة إذا كانت مطلوبة علامات الخلية أكثر من 4-6 للتحليل. بشكل عام، هذا الإجراء هو السهل القيام بها. الخطوة الوحيدة التي قد تتطلب بعض التدريب الأولي هو نضح intracardial. يتم سرد بعض التلميحات التي قد تكون مفيدة للتغلب على المشاكل المحتملة في الجدول 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الآنسة ليانا Mackiewicz للمساعدة التقنية. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال دعم حكومة الولاية الفيكتوري البنية التحتية التشغيلية والحكومة الأسترالية الوطنية للصحة والبحوث الطبية IRIISS المجلس ومشروع منح 1031212.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions and buffers
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500 1:10 dilution in distilled water
RPMI medium Mouse tonicity
Mouse tonicity PBS 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3
0.4%Trypan Blue Sigma Aldrich T-8154 1:2 dilution
Collagenase D Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I Sigma Aldrich D4263-5VL From bovine pancreas
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 30% solution in PBS
Ultrapure Tris Invitrogen 15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl) AnalaR 10017
Red Cell Lysis Buffer 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2
FCS Gibco 1009
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1M, pH 7.2
Antibodies and conjugates
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 BD Pharmingen 553142 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml)
FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 R&D Systems FAB1685P
Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
Equipment and material
SuperFrost microscope slide Lomb Menzel-Gläser
Dissection forceps, scissors REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir Nalgene
Rubber tubing
23G needle BD PrecisionGlide 302008
Cell dissociation kit containing metal sieve Sigma Aldrich CD-1
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
Hemocytometer GmbH Neubauer 717810
Flow cytometry tubes BD Falcon 352008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
  2. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
  3. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
  4. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
  5. LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
  6. Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
  7. Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
  8. Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
  9. Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
  10. Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
  11. Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
  12. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
  13. Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
  14. Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).

Tags

علم المناعة، العدد 71، العدوى، الأمراض المعدية، أمراض الدم، علم الأحياء الجزيئية، علم الأحياء الخلوي، الفأر، الدماغ، والتهاب داخل الأوعية الدموية،
العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J.,More

Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J., Hansen, D. S. Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice. J. Vis. Exp. (71), e50112, doi:10.3791/50112 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter