Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit Published: January 2, 2013 doi: 10.3791/50112

Summary

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen bloedvaten

Abstract

We beschrijven een werkwijze voor isolatie en karakterisering van hechtende ontstekingscellen uit hersenen bloedvaten P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen. Infectie van gevoelige muizen-stammen met deze parasiet stam resulteert in de inductie van experimentele cerebrale malaria, een neurologisch syndroom dat recapituleert bepaalde belangrijke aspecten van Plasmodium falciparum-gemedieerde ernstige malaria in mensen 1,2. Rijpe vormen van bloed-stage malaria expressie parasitaire eiwitten op het oppervlak van de geïnfecteerde erythrocyten, waardoor ze binden aan vasculaire endotheelcellen. Dit proces leidt tot verstoppingen in de bloedstroom, wat resulteert in hypoxie en bloedingen 3 en stimuleert ook de werving van inflammatoire leukocyten naar de plaats van parasiet vastlegging.

In tegenstelling tot andere infecties, zoals virussen neutrotopic 4-6, zowel malaria-geparasiteerde rode bloedcellen (PRBC) en geassocieerde InflammAtory leukocyten blijven afgezonderd binnen de bloedvaten in plaats van te infiltreren in de hersenen parenchym. Dus om contaminatie van afgezonderd leukocyten met niet-inflammatoire circulerende cellen, uitgebreide intracardiale perfusie van geïnfecteerde-muizen voorafgaand aan orgaanextractie en weefsel verwerking wordt verontreinigd is nodig in deze procedure om het bloed compartiment te verwijderen. Na perfusie, zijn hersenen geoogst en ontleed in kleine stukjes. De weefselstructuur wordt verder verstoord door enzymatische behandeling met collagenase en D DNAse I. De resulterende hersenhomogenaat wordt vervolgens gecentrifugeerd op een Percoll-gradiënt die scheiding van hersenen gesekwestreerde leukocyten (BSL) van myeline en andere weefselafval maakt. Geïsoleerde cellen worden vervolgens gewassen, geteld met een hemocytometer en gekleurd met fluorescente antilichamen voor verdere analyse door flowcytometrie.

Deze procedure maakt uitgebreide fenotypische karakterisatie van inflammatoire leukocyten migreren naar de hersenen in rereactie op verschillende stimuli, waaronder beroerte alsook virale of parasitaire infecties. De werkwijze verschaft ook nuttig voor het beoordelen van nieuwe anti-inflammatoire behandelingen in preklinische diermodellen.

Protocol

1. Infectie van muizen met P. berghei-ANKA

  1. Ontdooi een portie van gecryopreserveerde P. berghei ANKA PRBC.
  2. Juist remmen cerebrale malaria-resistente BALB / c donor muis (8-12 weken oud) met de twee handen beperking techniek. Injecteer muis met 100-200 pi PRBC met een 1 ml insulinespuit (28G naald). Routinematig, 1-2 donormuizen geïnjecteerd.
  3. Op de dagen 4 tot 5 na infectie (pi) te verwijderen donor muis van kooi en plaats het op een werkstation of een wegwerp werkende pad.
  4. Voorzichtig beperken de muis aan het eind van de staart en het gebruik van een klein schaartje knippen de staartpunt (ongeveer 1 mm). Als alternatief kan een kleine staart punctie met een 25 G naald worden uitgevoerd.
  5. Breng een druppel bloed uit de staart van de muis ader aan het einde van een matte-end microscoopglaasje.
  6. Plaats een tweede dia (spreader) op een hoek van 45 ° en een back in de bloeddruppel. Zodra het bloed verspreidt zich langs de rand, duw de spreider-slide evelleen de overkant van de microscoop dia om het bloeduitstrijkje maken. Laat het uitstrijkje aan de lucht drogen.
  7. Fix bloeduitstrijkjes in 100% methanol gedurende 30 seconden en vervolgens vlek slides in vers bereid Giemsa gedurende 10 min..
  8. Spoel bloeduitstrijkje met stromend water gedurende 1 minuut, laat aan de lucht drogen en te onderzoeken schuif onder de microscoop (100x, olie-immersie). Inventariseer PRBC binnen 1.000 erytrocyten en bereken procent parasitemie. Donormuizen moeten bereiken parasitemie niveaus tussen 2,5-5% voordat ze kunnen worden ontlucht voor infectie van proefdieren.
  9. Verzamel bloed van de donor muis door retro-orbitale bloeding met een gehepariniseerde micro-hematocriet capillair. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de Walter & Eliza Hall Instituut Animal Ethics Committee eisen. Afhankelijk van de lokale Animal Ethische Commissie heeft op andere eisen bloedingen procedures kunnen worden gebruikt. Los benodigde hoeveelheid bloed in RPMI medium bij een uiteindelijke concentratie van 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Bedenk dateen gewone muis hematocriet is ~ 6x10 9 rode bloedcellen / 1 ml.
  10. Infect experimentele C57BL / 6 muizen (8-12 weken oud) door injectie intraperitoneaal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
  11. Om parasitemie niveaus van geïnfecteerde muizen te controleren volgt u de stappen 1,3-1,8. Parasitemie moet worden bepaald om de 2-3 dagen gestart op dag 2 of 3 pi
  12. Ontstaan ​​van ernstige malaria in C57BL / 6 muizen zou kunnen manifesteren als gebogen uiterlijk, troefde bont en lage activiteit. Sommige muizen kan herstellen in dit stadium, maar progressie tot verlies van zelfrichtend reflex geeft onomkeerbare ziekte en dieren worden gedood.

2. Intracardiale Perfusie van Muizen en Brain Extraction

  1. Monteer een handmatige zwaartekracht perfusie systeem zorgen voor een 500 ml reservoir een kolom houder aan de top van een 60 cm kolom stand. Verbinding plastic slang aan de onderkant van het reservoir en zet een slangklem op buffer te regelen. Sluit de slang aan een 23 G naald. Fill tot het reservoir met PBS (bewaard bij 22 ° C), open klem en buffer te laten lopen door de slang om alle luchtbellen te verwijderen.
  2. Euthanaseren P. berghei ANKA-geïnfecteerde muis door CO 2 inhalatie. Bevestig de dood door het ontbreken van pedaal, orbitale en respiratoire respons.
  3. Pin euthanized muis door de achterpoten en de voorpoten dorsaal op een piepschuim dissectie board in een plastic bakje. Afhankelijk van de lokale Animal Ethische Commissie eisen anesthesie kan worden toegediend voorafgaand aanvang van intracardiale pefusion.
  4. Veeg ventrale zijde met 70% ethanol.
  5. Gebruik grote schaar en pincet voor de huid te openen langs de middellijn van de borstholte bloot te leggen. Vouw en speld de huid aan de zijkanten.
  6. Houd het borstbeen met fijne tang en knip het middenrif en langs beide zijden van het borstbeen doorsnijden van de ribben. Zorg ervoor dat er geen grote bloedvaten beschadigen.
  7. Speld de ribbenkast door het borstbeen losjes naast het hoofd.
  8. Houd ventrikels with fijne tang en voorzichtig incise rechter atrium met fijne schaar.
  9. Plaats 23G naald bevestigd aan de zwaartekracht perfusie systeem in linker ventrikel naar de aorta ascendens, terwijl PBS wordt uitgevoerd. Plaats slechts 0,5 cm van de naaldpunt.
  10. Perfuseren muis gedurende 5 minuten of totdat effluent is duidelijk.
  11. Losmaken muis en leg hem op zijn buik. Veeg hoofd met 70% ethanol.
  12. Met grote schaar, een snede boven het cervicale ruggenmerg gebied.
  13. Gebruik fijne schaar om een ​​mediane caudale-rostrale cut te beginnen bij de basis van de schedel en schil de huid weg naar de schedel bloot te leggen.
  14. Die het hoofd plaatst de bladen van een kleine schaar in elk orbitale holte en een snede tussen de banen.
  15. Maak een longitudinale snede langs de pijlnaad en zorgvuldig verwijderen van de schedel op elke hersenhelft naar buiten.
  16. Met behulp van een spatel, til de hersenen en plaats deze in een 10 ml centrifugebuis die RPMI medium.

3. Isolatie van Brain-afgezonderd Leukocyten (BSL)

  1. Werken in een veiligheidskast, vers geoogste hersenen plaats op een roestvrijstalen celzeef (40-60 maaswijdte) in een petrischaal met 3-5 ml van RPMI weefselkweekmedium.
  2. Snijd hersenweefsel in kleine stukjes.
  3. Druk kleine stukjes hersenweefsel door de cel zeef met behulp van een kristal plunjer.
  4. Overdracht hersenhomogenaat een 10 ml en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  5. Los pellet in 3 ml RPMI-medium, dat 0,05% Collagenase D en 2U/ml DNAse I.
  6. Draai mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Verwijder de celresten door op het mengsel door een 70 pm nylon celzeef en / of door incubatie op ijs gedurende 5 minuten.
  7. Leg hersenhomogenaat op een 7 ml 30% Percoll kussen en centrifugeer bij 400 xg (zonder rem) gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
  8. Hersuspendeer pellet in 1 ml rode bloedcellen lysis buffer en incubeer op ijs gedurende 5 minuten totlyseren hechtende PRBC, die niet konden uit de hersenen worden verwijderd door intracardiale perfusie.
  9. Voeg 9 ml van RPMI medium, wassen cellen en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  10. Resuspendeer BSL-bevattende pellet in 50-100 pi RPMI medium en overdracht cellen aan een Eppendorf buis.
  11. Verdun een 5-10 pi aliquot van het celmonster 1:2 in Trypan blauw voor identificatie van levensvatbare cellen.
  12. Tellen levensvatbare cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Vanaf dag 6 pi verder, toen P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen weer te geven neurologische symptomen, 20.000-100.000 BSLs kan worden hersteld.

4. Immunofenotypering van BSL door meerkleuren flowcytometrie

  1. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, zuig de supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul kleuring buffer (PBS, 1% foetaal kalf serum (FCS), 2 mm EDTA).
  2. Voeg 1 pl gezuiverd anti-CD16/32 antilichaam (Fcblock).
  3. Incubeer cellen gedurende 10 min op ijs.
  4. Was de cellen met 1 ml Buffer kleuring. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
  5. Resuspendeer cellen in 50 ul Buffer Kleuring met vooraf bepaalde optimale verdunningen van gekozen fluorescente antilichamen, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR en anti-NK1.1.
  6. Incubeer gedurende 1 uur op ijs.
  7. Was de cellen met 1 ml Buffer kleuring. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
  8. Resuspendeer cellen in 100 ul PBS.
  9. Breng cellen een flowcytometrie plastic buis.
  10. Met een flow cytometer, ten minste het 5.000-10.000 events. Geschikte unstained cel controles en fluorochroom vergoeding monsters moeten worden opgenomen, zoals vereist.
  11. Analyseer de resultaten met behulp van geschikte flowcytometrie software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De resultaten in Fig. 2 tonen percentages en absolute aantallen van de verschillende BSL populaties hersteld van hersenen van geperfundeerde of unperfused malaria geïnfecteerde en naïef controle muizen. BSL geïsoleerd werden gekleurd met PE-anti-NK1.1 en APC-anti-TCR-β antilichamen zoals aangegeven in de tekst Protocol. Consistent met eerdere bevindingen 7-9, αβTCR + T-cellen bestaat een groot deel van de BSL pool in hersenen van geperfundeerde malaria geïnfecteerde muizen (dag 6 pi). Deze populatie bleek sterk ondervertegenwoordigd in hersenen van niet-geperfundeerde dieren (Fig. 2A-B). De schijnbare vermindering van T-cel frequentie in niet-geperfundeerde hersenen werd geassocieerd met een aanzienlijk hoger percentage en het aantal dubbele negatieve cellen (αβTCR - NK1.1 -) in deze dieren (Fig. 2A-B). Hoog percentage en nummers op dubbele negatieve cellen in unperfused hersenen waren niet alleen gedetecteerd in malaria-geïnfecteerde muizen, maar ook in na & iuml, ve controles suggereert dat deze cellen niet-inflammatoire leukocyten in de hersenen bloedvaten die samen teruggewonnen met ontstekingscellen als intracardiale perfusie niet uitgevoerd.

Twee andere voorbeelden van BSL analyse zijn weergegeven in Fig. 3 en Fig. 4. In het kort werden C57BL / 6 muizen geïnfecteerd met P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Temporele associaties tussen leukocyten rekrutering naar de hersenen en het begin van neurologische symptomen (tussen Dag 6-8 pi) zijn aangetoond in P. berghei ANKA geïnfecteerde muizen 7-9. In dit voorbeeld werden malaria geïnfecteerde muizen gedood op dag 6 pi en de BSL werden gezuiverd zoals beschreven in het protocol tekst. BSL geïsoleerd werden gekleurd met PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 en anti-PerCPCy5.5-CD8a antilichamen. De monsters werden verkregen met behulp van een BD Biosciences FACSCalibur flowcytometer en de uitgevoerde analyse met behulp van Wezel 3.0.1 software. Viabare cellen werden gated door voorwaartse en zijwaartse verstrooiing. De percentages van NK cellen, T-lymfocyten en NKT cellen (TCR NK1.1 + + cellen) afgezonderd in hersenen van naïeve en malaria geïnfecteerde muizen (dag 6 pi) worden in de bovenste panelen (Fig. 3A). De onderste panelen tonen percentages van CD4 + en CD8 + T-lymfocyten onder gated NK1.1 - αβTCR + cellen (Fig. 3A). Fig. 3B toont een voorbeeld waarin absolute aantallen CD4 + en CD8 + hersenen gesekwestreerde T-cellen op dag 6 pi berekend P. berghei ANKA. In het algemeen kan 20.000-100.000 BSL worden teruggewonnen uit hersenen van P. berghei ANKA geïnfecteerde muizen. Verschillende factoren zoals tijd pi, kan de gevoeligheid van de muis stam of opnemen van anti-inflammatoire behandelingen beïnvloeden cel herstel. Routinematig, een individuele hersenen biedt genoeg cellen voor 1 set van antilichaam kleuringen.

In het voorbeeld dat in Fig. 4 the chemokine receptor gebruik van hersenen gesekwestreerde T lymfocyten geanalyseerd. Muizen werden geïnfecteerd met P. berghei ANKA en BSL werden geïsoleerd op dag 6 pi Cellen werden gekleurd met APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 en gebiotinyleerd anti-CCR5-antilichamen, gevolgd door incubatie met streptavidine-conjugaat PerCPCy5.5. Monsters werden verworven en geanalyseerd zoals in Fig. 3. De histogrammen vertegenwoordigen percentages van αβTCR + cellen onder totale BSL in malaria-infectie en naïef controle muizen. De contour percelen in de middelste en onderste panelen tonen de percentages van CXCR3 + en CCR5 + cellen in gated αβTCR + cellen.

Figuur 1
Figuur 1. Stroomschema van de procedure voor isolatie en analyse van BSLvan P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen. (1) Een monster van P. cryopreseved berghei ANKA PRBC wordt ontdooid en 1 of 2 donormuizen besmet zijn. (2) Vier dagen later parsitemia niveaus van donormuizen worden berekend, donormuizen zijn ontlucht en bloed verdunningen bereid voor infectie van experimentele muizen. Een malaria-infectie wordt dan ingesteld in ernstige malaria-gevoelige C57BL / 6 muizen. (3) Op dagen 5-7 pi, worden muizen gedood door CO2 inhalatie en onmiddellijk intracardiaal geperfuseerd alle circulerende niet-hechtende cellen te verwijderen. (4) Hersenen worden daarna geoogst en hersenhomogenaat bereid door digestie van het weefsel met Collagenase D en DNAse I. BSL worden vervolgens gescheiden van myeline en celresten door een Percoll-gradiënt. (5) Geprecipiteerd BSL worden vervolgens gewassen, geteld met een hemocytometer, gekleurd met fluorescente antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie.


Figuur 2. BSL analyse in de hersenen van geperfundeerde of unperfused muizen. C57BL / 6 muizen werden geïnfecteerd met P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hersenen werden geoogst op dag 6 pi van geperfundeerde of unperfused dieren. De BSL werden geïsoleerd, gekleurd met anti-NK1.1 en anti-TCR fluorescente antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie. (A) Dot plots weer te geven percentages van NK-cellen, T-lymfocyten, NK1.1 + TCR + cellen en dubbele negatieve cellen NK1.1 - TCR - in geperfundeerde (bovenste panelen) of unperfused (onderste panelen) malaria geïnfecteerde en naïef controle muizen . (B) Het absolute aantal dubbele negatieve cellen en T-lymfocyten en is berekend op dag 6 pi met P. berghei ANKA en naïef controle muizen. Elke staaf represegen het gemiddelde van 3 monsters ± SEM, * p> 0,05.

Figuur 3
Figuur 3. NK cellen en T-lymfocyten kan worden gedetecteerd in hersenen van P. berghei ANKA geïnfecteerde muizen. C57BL / 6 muizen werden geïnfecteerd met P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hersenen werden geëxtraheerd op dag 6 pi na perfusie van de euthanasie dieren. De BSL werden geïsoleerd, gekleurd met anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 en anti-CD8 fluorescente antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie. (A) Top panelen schilderen percentages van NK-cellen, T-lymfocyten en NK1.1 + TCR + cellen in malaria geïnfecteerde en naïef controle muizen. Bodempanelen illustreren percentages van CD4 + en CD8 + T-cellen in gated αβTCR + NK1.1 - (B) Het absolute aantal hersenen gesekwestreerde CD4 + en CD8 + T cellen werd berekend op dag 6 pi met P. berghei ANKA en naïef controle muizen. Elke staaf stelt het gemiddelde van 3 monsters ± SEM.

Figuur 4
Figuur 4. De meeste T-lymfocyten migreren naar de hersenen in reactie op een ernstige infectie malaria drukken de chemokine receptor CXCR3. C57BL / 6 muizen werden geïnfecteerd met P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hersenen werden geëxtraheerd op dag 6 pi na uitgebreide perfusie van de euthanasie dieren. De BSL werden geïsoleerd, gekleurd met anti-TCR, anti-CXCR3 en anti-CCR5-antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie. Top panelen verbeelden percentages van αβT lymfocyten in malaria-infectie en naïef controle muizen. De contourlijncurves illustreren percentages van CXCR3 + (middelste panelen) en CCR5 + (onderste paneel) cellen in gated αβTCR + lymfocyten.

Probleem Problemen oplossen
Onvolledige perfusie
  • Controleer of PBS op kamertemperatuur is voordat perfuseren muizen.
  • Zorg ervoor dat u nick de bloedvaten die lag onder de ribbenkast.
  • Tewerkgaan geen nick alle organen (bijvoorbeeld de lever) bij het openen van de borstholte.
  • Stel de PBS debiet to ~ 5 ml / min. Bloed niet snel genoeg worden verwijderd als de stroom te traag, wat kan leiden tot klonters. Als de stroom te hoog is, kan de hoge druk kleine bloedvaten beschadigen.
  • Niet steek de naald te ver inaan de linker ventrikel als dit kan doorboren het septum. Om dit te voorkomen, trek je een merk 5 mm van de punt van de naald te gebruiken als een gids.
Niet genoeg BSL hersteld
  • Controleer parasitemie van P. berghei ANKA geïnfecteerde muizen. Op dag 5-6 pi, worden muizen naar verwachting ~ 4-7% parasitemie te bereiken.
  • Controleer Collagenase D en DNAse I-concentratie in de spijsvertering cocktail. Niet genoeg enzymen het gedrang kunnen brengen cel herstel.
  • Breiden enzymatische afbraak van hersenweefsel tot 1 uur.

Tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De isolatie en analyse van BSL is een methode die karakterisering en kwantificering van inflammatoire cellen migreren naar de hersenen in reactie op weefselbeschadiging of infectie in experimentele muismodellen maakt. De invoering van een intracardiale perfusie stap voor het verwijderen van het bloedcompartiment voor orgaanextractie en latere celisolatie is nuttig om contaminatie van inflammatoire cellen met niet-inflammatoire circulerende leukocyten voorkomen. Dit is misschien niet een essentiële vereiste in neurotrope infecties zoals murine encephalomyelitis virus waarin ontstekingscellen doordringen in de hersenen parenchym 5, maar is met name relevant in knaagdier malaria, waarin geïnfecteerde erythrocyten en inflammatoire leukocyten blijven afgezonderd binnen de bloedvaten in plaats van te infiltreren hersenweefsel . Derhalve moet intracardiale perfusie van malaria geïnfecteerde muizen niet alleen aanbevolen voor analyse van BSL maar kan ook nuttig zijn voorbeoordeling van de parasiet-weefsel opslag 10,11. Soortgelijke niet-inflammatoire circulerende leukocyten, onrijpe vormen van malaria parasieten niet houden aan het vasculaire endotheel en worden verwijderd door de perfusie procedure. In tegenstelling, aanhanger PRBC (volwassen schizonten) lijken te blijven binnen de hersenen bloedvaten. P. berghei ANKA transgene parasieten uiten luciferase zijn gegenereerd 12 en zijn een waardevolle bron voor dit type analyse. Na infectie met luciferase-expressie lijnen, kunnen parasieten weefsel-opslag wordt bepaald door beeldvorming van geperfundeerde hersenen van besmette dieren met behulp van een IVIS-systeem 10,11. Een directe vergelijking van de parasiet-opslag op dag 6-7 pi in hersenen van geperfundeerde dieren en hersenen van muizen geïnfecteerd met stadium-specifieke reporter parasieten (dwz het luciferase alleen tijdens schizont fase) zou nuttig zijn voor verdere validatie van deze methode.

Eenbelangrijk nadeel van traditionele benaderingen voor histologische analyse van weefsel-infiltrerende cellen is dat deze technieken niet voor evaluatie van celpopulaties die opname van meer dan een cel merker voor identificatie (dwz NK1.1 + + αβTCR CD1d-restricted NKT of CD4 vereisen + Foxp3 + regulatoire T-cellen). In tegenstelling tot de histologie, flowcytometrische analyse van inflammatoire leukocyten vatbaar is voor meerdere antilichaam kleuringen, die een zeer nuttig hulpmiddel voor uitgebreide fenotypische karakterisering van cellulaire infiltraten 7,9,13. Bovendien is deze werkwijze voldoende gevoelig om celpopulaties zich bij een frequentie zo laag als 1-3% van de totale intravasculaire infiltreren, niet alleen maar ook endogene adoptief getransfereerd cellen als antigen specifieke T-cellen te detecteren. P. berghei ANKA transgene expressie parasieten MHC I en MHC II-beperkte epitopen van OVA 14 + CD8 + T-cellen uit OT-I muizen kon worden gedetecteerd onder BSL van Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG geïnfecteerde muizen, waarin wordt aangetoond dat inflammatoire T-cellen migreren naar de hersenen antwoord op malaria parasiet-specifieke 14.

De analyse van BSL is ook nuttig te evalueren van het potentieel van nieuwe anti-inflammatoire behandelingen in preklinische diermodellen. Zo is de capaciteit van monoklonale antilichamen tegen de CXCR3 chemokine IFN-γ-induceerbare proteïne 10 (IP-10) naar de hersenen intravasculaire infiltratie en te verlichten symptomen geassocieerd met ernstige malaria succes gedemonstreerd met dezemethode 11.

Een beperking dat deze werkwijze zou kunnen hebben is dat het totale aantal cellen gewonnen uit een individu hersenen algemeen voldoende is voor een set van antilichaam kleuringen. Zo afzonderlijke experimenten vereist indien meer dan 4-6 celmarkers zijn voor de analyse. In het algemeen is de procedure eenvoudig uit te voeren. De enige stap die sommige initiële opleiding kan het nodig is de intracardiale perfusie. Enkele hints die nuttig kunnen zijn om mogelijke problemen te overwinnen zijn vermeld in tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Miss Liana Mackiewicz bedanken voor technische bijstand. Dit werk werd mogelijk gemaakt door Victoriaanse Overheid van de Staat Operationele Infrastructuur Support en Australische regering National Health en Medical Research Council IRIISS en Project Grant 1031212.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions and buffers
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500 1:10 dilution in distilled water
RPMI medium Mouse tonicity
Mouse tonicity PBS 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3
0.4%Trypan Blue Sigma Aldrich T-8154 1:2 dilution
Collagenase D Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I Sigma Aldrich D4263-5VL From bovine pancreas
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 30% solution in PBS
Ultrapure Tris Invitrogen 15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl) AnalaR 10017
Red Cell Lysis Buffer 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2
FCS Gibco 1009
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1M, pH 7.2
Antibodies and conjugates
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 BD Pharmingen 553142 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml)
FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 R&D Systems FAB1685P
Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
Equipment and material
SuperFrost microscope slide Lomb Menzel-Gläser
Dissection forceps, scissors REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir Nalgene
Rubber tubing
23G needle BD PrecisionGlide 302008
Cell dissociation kit containing metal sieve Sigma Aldrich CD-1
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
Hemocytometer GmbH Neubauer 717810
Flow cytometry tubes BD Falcon 352008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
  2. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
  3. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
  4. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
  5. LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
  6. Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
  7. Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
  8. Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
  9. Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
  10. Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
  11. Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
  12. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
  13. Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
  14. Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).

Tags

Immunologie Infectie Infectieziekten Hematologie Moleculaire Biologie Cellular Biology Muis Brain intravasculaire ontsteking, Parasiet malaria diermodel
Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J.,More

Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J., Hansen, D. S. Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice. J. Vis. Exp. (71), e50112, doi:10.3791/50112 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter