Summary
Verfahren zur Isolierung von adhärenten entzündliche Leukozyten aus dem Gehirn Blutgefäße
Abstract
Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von adhärenten Entzündungszellen aus Gehirn Blutgefäße von P. berghei ANKA-infizierten Mäusen. Infektion von empfänglichen Maus-Stämme mit diesen Parasiten Dehnung ergibt sich bei der Induktion von experimenteller zerebrale Malaria, eine neurologische Syndrom daß rekapituliert bestimmte wichtige Aspekte des Plasmodium falciparum-vermittelte schwerer Malaria beim Menschen 1,2. Reifen Formen von Blut-stufigen Malaria exprimieren parasitäre Proteine auf der Oberfläche der infizierten Erythrozyten, wodurch sie an vaskulären Endothelzellen binden können. Dieser Prozess induziert Hindernisse in den Blutfluss, was zu Sauerstoffmangel und Blutungen 3 und stimuliert auch die Rekrutierung von Entzündungszellen Leukozyten an den Ort der Parasit Sequestrierung.
Im Gegensatz zu anderen Infektionen, also Viren neutrotopic 4-6, beide Malaria-Parasiten befallenen Erythrozyten (PRBC) sowie zugehörigen InflammAtory Leukozyten bleiben abgesondert innerhalb von Blutgefäßen als Infiltration des Hirnparenchym. So eine Kontamination des einsamen Leukozyten mit nicht-entzündlichen zirkulierenden Zellen, umfangreiche intrakardiale Perfusion von infizierten-Mäuse vor Organentnahme und Gewebe Verarbeitung zu vermeiden wird in diesem Verfahren erforderlich, um die Blut-Kompartiment zu entfernen. Nach Perfusion, werden geerntet und seziert Gehirne in kleine Stücke. Das Tissue-Struktur wird weiter durch enzymatische Behandlung mit Kollagenase D und DNAse I gestört Die resultierende Hirnhomogenisat wird dann auf einem Percoll-Gradienten, die Trennung von brain-sequestered Leukozyten (BSL) von Myelin und andere Gewebedebris ermöglicht zentrifugiert. Isolierte Zellen werden dann gewaschen, gezählt unter Verwendung eines Hämozytometers und gefärbt mit fluoreszierenden Antikörpern für die anschließende Analyse durch Durchflusszytometrie.
Dieses Verfahren ermöglicht eine umfassende phänotypische Charakterisierung von entzündlichen Leukozyten Migration auf das Gehirn in retion auf verschiedene Stimuli, einschließlich Schlaganfall sowie viralen oder parasitären Infektionen. Das Verfahren stellt auch ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung von neuartigen anti-inflammatorische Therapien in präklinischen Tiermodellen.
Protocol
Ein. Infektion von Mäusen mit P. berghei-ANKA
- Defrost ein Aliquot von kryokonservierten P. berghei ANKA PRBC.
- Restrain eine zerebrale Malaria-resistente BALB / c Donor-Maus (8-12 Wochen alt) mit dem two-handed Zurückhaltung Technik. Inject Maus mit 100-200 ul PRBC mit einer 1 ml Insulinspritze (28G Nadel). Routinemäßig werden 1-2 Spender-Mäusen injiziert.
- Am Tag 4-5 nach der Infektion (pi) zu entfernen Donor-Maus aus dem Käfig und legen Sie sie auf einer Workstation oder einem Einweg arbeiten Pad.
- Gently zurückzuhalten Maus bis zum Ende des Schwanzes und mit einer kleinen Schere schneiden Sie die Schwanzspitze (ca. 1 mm). Alternativ könnte ein kleiner Einstich mit einem Schwanz 25 G Nadel vorgenommen werden.
- Geben Sie einen Tropfen Blut aus der Maus Schwanzvene am Ende einer mattierten-End-Mikroskop-Objektträger.
- Legen Sie einen zweiten Schieber (Spreader) auf einem 45 ° Winkel und es zurück in den Blutstropfen. Sobald das Blut breitet sich entlang der Kante, drücken Sie den Streuer-slide evenly auf dem Objektträger um die Blutausstrich machen. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen.
- Fix Blutausstrichen in 100% Methanol für 30 Sekunden und dann färben Folien in frisch hergestelltem Giemsa für 10 min.
- Spülen Blutausstrich mit fließendem Wasser für 1 min, an der Luft trocknen lassen und untersuchen Objektträger unter dem Mikroskop (100x, Öl-Immersion). Aufzählen PRBC in 1.000 Erythrozyten und berechne Prozent Parasitämie. Donor Mäuse sollten Parasitämie Ebenen zwischen 2,5-5% erreichen, bevor sie für die Infektion von Versuchstieren entlüftet werden.
- Blutentnahme von dem Spender Maus durch retroorbitale Blutungen unter Verwendung eines Mikro-heparinisierten Hämatokrit Kapillarrohr. Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den Walter & Eliza Hall Institut Animal Ethics Committee Anforderungen durchgeführt. Je nach den örtlichen Tier Ethic Committee andere Anforderungen Blutungen Verfahren verwendet werden könnten. Aufzulösen erforderliche Blutmenge in RPMI-Medium mit einer Endkonzentration von 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Bedenken Sie, dasseine normale Maus Hämatokrit ~ 6x10 9 roten Blutkörperchen / 1 ml.
- Infect experimentellen C57BL / 6 Mäuse (8-12 Wochen alt) durch Einspritzen intraperitoneal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
- Um Parasitämie Ebenen der infizierten Mäusen beobachten die Schritte 1,3-1,8. Parasitämie sollte ermittelt alle 2-3 Tage, beginnend am Tag 2 oder 3 pi
- Auftreten einer schweren Malaria in C57BL / 6 Mäusen manifestieren könnte als gekrümmte Erscheinung, ruffed Fell und geringe Aktivität. Einige Mäuse können in dieser Phase zu erholen, aber Progression zu Verlust der Selbstkontrolle aufrichtenden Reflex zeigt irreversible Krankheit und Tiere müssen eingeschläfert werden.
2. Intrakardiale Perfusion von Mäusen und Brain Extraction
- Montieren einer manuellen Schwerkraft Perfusionssystem durch Befestigen eines 500 ml Reservoir zu einer Säule angebrachten Halter Anfang einer 60 cm Säule Ständer. Verbinden Kunststoffrohr am unteren Ende des Reservoirs und sichern eine Schlauchklemme zum Puffer zu steuern. Befestigen Sie Schlauch mit einer 23 G Nadel. Fill bis das Reservoir mit PBS (gehalten bei 22 ° C), öffnen Sie klemmen und ermöglichen Puffer durch den Schlauch laufen, um alle Luftblasen zu entfernen.
- Euthanize P. berghei ANKA-infizierten Maus durch CO 2-Inhalation. Bestätigen Tod durch das Fehlen des Pedals, Schwingschleifer und respiratorischen Reaktionen.
- Merken eingeschläfert Maus durch den Hinterbeinen und Vorderpfoten dorsal auf einem Styropor-Dissektion Bord in einer Plastikschale enthalten. Je nach den örtlichen Tier Ethic Committee Anforderungen Anästhesie konnte vor Beginn der intrakardialen pefusion verabreicht werden.
- Wischen Bauchseite mit 70% Ethanol.
- Verwenden Sie große Schere und Pinzette die Haut entlang der Mittellinie öffnen, um die Brusthöhle aussetzen. Fach und Pin Haut an den Seiten.
- Halten das Brustbein mit feinen Pinzetten und schneiden das Diaphragma und auf beiden Seiten des Brustbeins Durchtrennen der Rippen. Achten Sie darauf, dass keine großen Blutgefäße schädigen.
- Pin der Brustkorb von dem Brustbein lose neben dem Kopf.
- Halten Ventrikel with feinen Pinzette vorsichtig incise rechten Vorhof mit feinen Schere.
- Legen 23G Nadel Schwerkraft Perfusionssystem in die linke Herzkammer zur Aorta ascendens während PBS läuft. Legen Sie nur 0,5 cm der Nadelspitze.
- Perfundieren Maus für 5 min oder bis Ablauf ist klar.
- Unpin Maus und legen Sie sie auf ihren Bauch. Wischen Sie den Kopf mit 70% Ethanol.
- Mit großen Schere, einen Schnitt oberhalb des zervikalen Rückenmarks Bereich.
- Verwenden feinen Schere zu machen eine mediane caudal-rostral Schnitt beginnend an der Basis des Schädels und schälen Haut weg, um den Schädel freizulegen.
- Halten den Kopf, legen Sie die Blätter eines kleinen Schere in jeder Augenhöhle und einen Schnitt zwischen den Umlaufbahnen.
- Machen Sie einen Längsschnitt entlang der Pfeilnaht und sorgfältig schälen Schädel auf jeder Gehirnhälfte nach außen.
- Mit einem Spatel, heben das Gehirn und legen Sie sie in einem 10 ml Zentrifugenröhrchen mit RPMI-Medium.
3. Isolierung von Brain-sequestered Leukozyten (BSL)
- Arbeiten in einer Sicherheitswerkbank, Ort frisch Gehirns auf einem Edelstahl-Zellsieb (40-60 Maschenweite) in eine Petrischale mit 3-5 ml RPMI Zellkulturmedium geerntet.
- Cut Hirngewebe in kleine Stücke schneiden.
- Push kleine Stücke von Hirngewebe durch die Zelle unter Verwendung eines Kristalls Sieb Druckfläche.
- Übertragen Gehirnhomogenat in ein 10 ml Röhrchen und Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Das Pellet in 3 ml RPMI-Medium, das 0,05% Collagenase D und 2U/ml DNAse I.
- Drehen Mischung wird 30 min bei Raumtemperatur. Zelltrümmer zu entfernen, indem das Gemisch durch einen 70 um Nylon Zellsieb und / oder durch Inkubation auf Eis für 5 min.
- Lay Hirnhomogenisat auf eine 7 ml 30% Percoll Kissen und Zentrifuge bei 400 × g (ungebremst) 20 min bei Raumtemperatur.
- Pellet in 1 ml Erythrozyten Lysepuffers und Inkubation auf Eis für 5 min auflysieren adhärenten PRBC, die nicht vom Gehirn konnte durch intrakardiale Perfusion entfernt werden.
- 9 ml RPMI-Medium, waschen Zellen und Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Resuspendieren BSL-enthaltende Pellet in 50-100 ul RPMI-Medium und Transfer Zellen zu einem Eppendorf-Röhrchen.
- Verdünnte eine 5-10 ul Aliquots der Zellprobe 1:2 in Trypanblau zur Identifizierung von lebensfähigen Zellen.
- Graf lebensfähigen Zellen unter dem Mikroskop mit einer Zählkammer. Von Tag 6 pi an, als P. berghei ANKA-infizierten Mäuse zeigen neurologische Symptome, 20.000-100.000 BSLs wiederhergestellt werden können.
4. Immunphänotypisierung der BSL durch Multicolour Durchflusszytometrie
- Zentrifuge Zellen bei 250 xg für 10 min bei 4 ° C, den Überstand aspirieren und Pellet in 50 ul Färbepuffer (PBS, 1% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mm EDTA).
- Fügen Sie die 1 ul gereinigt anti-CD16/32 Antikörper (Fcblock).
- Inkubieren Zellen für 10 min auf Eis.
- Waschen der Zellen mit 1 ml der Färbung Buffer. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
- Die Zellen in 50 ul Färbepuffer mit vorgegebenen optimalen Verdünnungen der erforderlichen fluoreszierenden Antikörpern, dh anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR-und Anti-NK1.1.
- Inkubieren für 1 Stunde auf Eis.
- Waschen der Zellen mit 1 ml der Färbung Buffer. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
- Die Zellen in 100 ul PBS.
- Übertragen Zellen einem Durchflusszytometrie Kunststoffrohr.
- Mit einem Durchflusszytometer, erwerben mindestens 5.000-10.000 Ereignisse. Entsprechende ungefärbten Zelle steuert und Fluorochrom Entschädigung Proben enthalten, wie benötigt werden.
- Analyse der Ergebnisse mit Hilfe geeigneter Durchflusszytometrie Software.
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Representative Results
Die Ergebnisse in Abb.. 2 zeigen Prozentsätze und absolute Zahl der verschiedenen BSL Populationen aus Gehirnen von perfundierten oder unperfused Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen erholt. Isolated BSL wurden mit PE-anti-NK1.1 und APC-anti-TCR-β-Antikörper gefärbt, wie im Protokoll Text angezeigt. Übereinstimmend mit früheren Resultaten 7-9, bestehend αβTCR + T-Zellen einen hohen Anteil an der BSL Pool in Gehirnen von perfundierten Malaria-infizierte Mäuse (6 Tage pi). Diese Population zu sein schien deutlich unterrepräsentiert in Gehirnen von nicht-perfundierten Tieren (2A-B). Bei diesen Tieren (Abb. 2A-B) Die scheinbare Reduktion der T-Zell-Frequenzen im nicht-perfundierten Gehirn wurde mit einem erheblich höheren Prozentsatz und Gesamtzahl der Doppel-negativen Zellen - (- NK1.1 αβTCR) assoziiert. Hoher Anteil und Zahlen auf Doppel-negativen Zellen in unperfused Gehirne waren nicht nur erkannt in Malaria-infizierten Mäusen, sondern auch in na & iuml; ve Kontrollen, was darauf hindeutet, dass diese Zellen nicht-entzündliche Leukozyten in Gehirn Blutgefäße, die zusammen mit Entzündungszellen zurückgewonnen werden, wenn intrakardiale Perfusion nicht ausgeführt wird sind.
Zwei weitere Beispiele für BSL Analyse sind in Abb. 3 und Abb. 4. Kurz gesagt, wurden C57BL / 6 Mäuse mit P. infiziert berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Zeitlichen Zusammenhänge zwischen Leukozytenstärkung zum Gehirn und dem Auftreten der neurologischen Symptome (zwischen Tag 6-8 pi) wurden in P. nachgewiesen berghei ANKA infizierten Mäusen 7-9. In diesem besonderen Beispiel wurden Malaria-infizierte Mäuse am Tag 6 pi euthanasiert und die BSL wurden gereinigt, wie in dem Protokoll Text beschrieben. Isoliert BSL wurden mit PE-anti-NK1.1, APC-Anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 und anti-PerCPCy5.5-CD8a Antikörpern gefärbt. Die Proben wurden mit einem BD Biosciences FACSCalibur Durchflusszytometer und die Analyse unter Verwendung Weasel 3.0.1 Software. Überlich Zellen waren gated durch Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht. Die Prozentsätze von NK-Zellen, T-Lymphozyten und NKT-Zellen (+ NK1.1 TCR +-Zellen) im Gehirn von naiven und Malaria-infizierte Mäuse (6 Tage pi) sequestriert sind in den oberen Platten (3A) gezeigt. Die Bodentafeln zeigen Prozentsätze von CD4 + und CD8 + T-Lymphozyten unter gated NK1.1 - αβTCR +-Zellen (Abb. 3A). Fig. 3B zeigt ein Beispiel, bei dem absolute Anzahl der CD4 + und CD8 +-Hirn sequestered T-Zellen am Tag 6 pi mit P. wurden berechnet berghei ANKA. Im Allgemeinen kann 20.000-100.000 BSL aus Gehirnen von P. zurückgewonnen werden berghei ANKA infizierten Mäusen. Verschiedene Faktoren wie Zeit pi könnte Suszeptibilität des Mausstamm oder Einbeziehung von entzündungshemmenden Therapien beeinflussen Zellgewinnung. Routinemäßig bietet ein individuellen Gehirns genügend Zellen für 1 Satz Antikörper Färbungen.
Im Beispiel der Fi bereitgestelltg. 4 der Chemokinrezeptor Nutzung von Gehirn-sequestered T-Lymphozyten analysiert. Die Mäuse wurden mit P. infiziert berghei ANKA und BSL wurden isoliert am Tag 6 pi Zellen mit APC-Anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 und biotinyliertem Anti-CCR5-Antikörper, durch Inkubation mit einem Streptavidin-Konjugat PerCPCy5.5 gefolgt gefärbt waren. Die Proben wurden erfasst und analysiert nach Abb. 3. Die Histogramme stellen Prozentsätze αβTCR + Zellen unter insgesamt BSL in Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen. Die Kontur-Plots in der mittleren und unteren Platten zeigt den prozentualen Anteil der CXCR3 + und CCR5 + Zellen innerhalb gated αβTCR + Zellen.
Abbildung 1. Flussdiagramm des Verfahrens zur Isolierung und Analyse von BSLvon P. berghei ANKA-infizierten Mäusen. (1) Ein Aliquot cryopreseved P. berghei ANKA PRBC wird aufgetaut und 1 oder 2 Donor Mäusen infiziert. (2) Vier Tage später parsitemia der Geberländer Mäusen berechnet, Spender Mäuse ausgeblutet und Blut Verdünnungen für die Infektion von Versuchsmäusen vorbereitet. Eine Infektion mit Malaria wird dann in schweren Malaria-empfindlichen C57BL / 6 Mäusen zu setzen. (3) An den Tagen 5-7 pi werden die Mäuse durch CO 2-Inhalation getötet und sofort intrakardial perfundiert, um alle zirkulierenden nicht adhärente Zellen zu entfernen. (4) Gehirne werden dann geerntet und einem Hirnhomogenisat durch Verdauung des Gewebes mit Kollagenase D und DNAse I BSL hergestellt werden dann aus myelin und Zelltrümmer durch einen Percoll-Gradienten getrennt. (5) Gefälltes BSL werden dann gewaschen, unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt, mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert.
Abbildung 2. BSL-Analyse in den Gehirnen von perfundierten oder unperfused Mäusen. C57BL / 6 Mäuse mit P. infiziert berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Die Gehirne wurden am Tag 6 pi aus perfundierten oder unperfused Tieren geerntet. Die BSL wurden isoliert, mit Anti-NK1.1 und Anti-TCR-fluoreszierenden Antikörpern und mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Dot Plots zeigen Prozentsätze von NK-Zellen, T-Lymphozyten, NK1.1 + TCR + Zellen und Doppel-negativen Zellen NK1.1 - TCR - in perfundierten (obere Bilder) oder unperfused (Bodenplatten) Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen . (B) Die absolute Zahl der doppelt negativen Zellen und T-Lymphozyten und wurde am Tag 6 pi mit P. berechnet berghei ANKA und naiv Kontrollmäusen. Jeder Balken represents der Mittelwert von 3 Proben ± SEM, * p> 0,05.
Abbildung 3. NK-Zellen und T-Lymphozyten im Gehirn von P. erkannt werden berghei ANKA infizierten Mäusen. C57BL / 6 Mäuse mit P. infiziert berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Gehirne wurden am Tag 6 nach der pi Perfusion der Tiere eingeschläfert extrahiert. Die BSL wurden isoliert, mit Anti-NK1.1, Anti-TCR-, anti-CD4 und anti-CD8-Antikörper und fluoreszierenden mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Top-Panels zeigen Prozentsätze von NK-Zellen, T-Lymphozyten und NK1.1 + TCR + Zellen in Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen. Bodentafeln veranschaulichen Prozentsätze von CD4 + und CD8 + T-Zellen innerhalb gated αβTCR + NK1.1 - (B) Die absolute Zahl der Gehirn-sequestered CD4 + und CD8 + T-Zellen wurde am Tag 6 pi mit P. berechnet berghei ANKA und naiv Kontrollmäusen. Jeder Balken stellt den Mittelwert von 3 Proben ± SEM.
Abbildung 4. Die Mehrheit der T-Lymphozyten der Migration auf das Gehirn als Reaktion auf schwere Malaria-Infektion äußern den Chemokinrezeptor CXCR3. C57BL / 6 Mäuse mit P. infiziert berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Gehirne wurden am Tag 6 nach umfangreichen pi Perfusion der Tiere eingeschläfert extrahiert. Die BSL wurden isoliert, mit Anti-TCR-, Anti-CXCR3-und Anti-CCR5-Antikörper und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Top-Panels zeigen Prozentsätze der αβT Lymphozyten in Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen. Die Konturplots veranschaulichen Prozentsätze von CXCR3 + (mittleren Tafeln) und CCR5 + (unteres Feld) Zellen innerhalb gated αβTCR +-Lymphozyten.
| Problem | Fehlerbehebung |
| Unvollständige Perfusion |
|
| Nicht genug BSL erholt |
|
Tabelle 1.
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Discussion
Die Isolierung und Analyse der BSL ist eine Methode, Charakterisierung und Quantifizierung von Entzündungszellen die Migration auf das Gehirn als Reaktion auf Gewebeverletzung oder Infektion in experimentellen Mausmodellen können. Die Einführung eines intrakardialen Perfusion Schritt zur Entfernung des Organs Blutabteil vor Extraktion und anschließende Zellisolation ist nützlich, um eine Kontamination von entzündlichen Zellen mit nicht-entzündliche zirkulierenden Leukozyten zu verhindern. Dies könnte nicht eine wesentliche Voraussetzung, neurotrope Infektionen wie murine encephalomyelitis virus in dem Entzündungszellen durchdringen die Hirnparenchym 5 sein, aber ist besonders relevant in Nagetier Malaria, in dem infizierten Erythrozyten und Leukozyten entzündlichen bleiben in Blutgefäßen sequestriert anstatt infiltrierenden Hirngewebe . Dementsprechend sollte intrakardiale Perfusion von Malaria-infizierte Mäuse nicht nur zur Analyse der BSL empfohlen werden, sondern könnte auch nützlich seinBeurteilung der Parasiten-Gewebe Sequestrierung 10,11. Ähnlich wie bei nicht-entzündliche zirkulierenden Leukozyten, sind unreife Formen der Malaria-Parasiten nicht an das vaskuläre Endothel anhaften und sollte durch die Perfusion entfernt werden. Im Gegensatz dazu scheinen haftende PRBC (reifen Schizonten) innerhalb des Gehirns Blutgefäße bleiben. P. berghei ANKA transgenen Parasiten Luciferase wurden 12 erzeugt und sind eine wertvolle Ressource für diese Art von Analyse. Nach der Infektion mit Luciferase-exprimierenden Linien können Parasiten Gewebe-Sequestrierung durch Abbildung des perfundierten Gehirnen von infizierten Tieren mit einem IVIS Systems 10,11 ermittelt werden. Ein direkter Vergleich der Parasiten-Sequestrierung an den Tagen 6-7 pi in Gehirnen von perfundierten Tieren und Gehirn von Mäusen mit Bühne-spezifischen Reporter Parasiten infiziert (dh Luciferase nur während Schizonten Bühne) wäre nützlich für die weitere Validierung dieser Methode.
Einwichtiger Nachteil der traditionellen Ansätzen für histologische Analyse von Gewebe-infiltrierenden Zellen ist, dass diese Techniken nicht möglich Beurteilung von Zellpopulationen, die Erkennung von mehr als einer Zelle Marker für die Identifizierung (dh NK1.1 + + αβTCR CD1d NKT-restringierten oder CD4 erfordern + Foxp3 + regulatorischen T-Zellen). Im Gegensatz zu der Histologie ist die durchflusszytometrische Analyse von entzündlichen Leukozyten zugänglich multiple Antikörper-Färbungen und bietet ein sehr nützliches Werkzeug für eine umfassende phänotypische Charakterisierung der zellulären Infiltrate 7,9,13. Darüber hinaus ist dieses Verfahren empfindlich genug, um Zellpopulationen auftretenden Frequenzen so niedrig wie 1-3% des gesamten intravasalen infiltrieren, einschließlich nicht nur, sondern auch endogene adoptiv transferierten Zellen als auch Antigen-spezifische T-Zellen zu detektieren. P. berghei ANKA transgenen Parasiten MHC I und MHC II-restringierte Epitope von OVA 14 + CD8 + T-Zellen von OT-I Mäusen könnte unter der BSL Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG-infizierten Mäusen detektiert werden, was beweist, dass inflammatorische T-Zellen zum Gehirn wandern in Antwort auf Malaria Parasiten-spezifische 14.
Die Analyse der BSL ist auch nützlich, um das Potenzial von neuartigen anti-inflammatorische Therapien in präklinischen Tiermodellen auszuwerten. Zum Beispiel hat die Fähigkeit von monoklonalen Antikörpern gegen den CXCR3 Chemokin IFN-γ-induzierbaren Proteins 10 (IP-10) zu Gehirn intravaskulären Infiltration Verhinderung und Linderung Krankheitssymptome mit schwerer Malaria zugeordnet erfolgreich demonstriert mit diesenMethode 11.
Eine Einschränkung, dass diese Methode wahrscheinlich ist, dass die Gesamtanzahl von Zellen aus einem Individuum gewonnen Gehirns allgemein ist für einen Satz von Antikörper Färbungen genug. Somit getrennten Experimenten ist erforderlich, wenn mehr als 4-6 Zellmarker für die Analyse erforderlich sind. Im Allgemeinen ist das Verfahren einfach durchzuführen. Der einzige Schritt, einige anfängliche Ausbildung erfordern könnte, ist die intrakardiale Perfusion. Ein paar Hinweise, die nützlich sein, um mögliche Probleme zu überwinden könnte, sind in Tabelle 1 aufgelistet.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Frau Liana Mackiewicz für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Victorian State Government Operational Support der Infrastruktur und der australischen Regierung National Health and Medical Research Council IRIISS und Project Grant 1031212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
