Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ Published: January 2, 2013 doi: 10.3791/50112
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research

Summary

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם במוח

Abstract

אנו מתארים שיטה לבידוד ואפיון של תאי דלקת חסיד מכלי דם במוח של פ עכברי berghei אנקה נגוע. זיהום של-זני עכברים רגישים עם תוצאות מתח טפיל זה באינדוקציה של קדחת מוח ניסיונית, תסמונת נוירולוגית שחוזר על היבטים חשובים מסוימים של מלריה חמורה Plasmodium falciparum בתיווך ב1,2 בני האדם. צורות בוגרות של מלריה בדם שלב לבטא חלבונים טפילים על פני השטח של כדורי האדום הנגוע, המאפשר להם להיקשר לתאי האנדותל של כלי דם. תהליך זה גורם לחסימות בזרימת דם, וכתוצאה מהיפוקסיה ושטפי דם 3 וגם ממגר את הגיוס של לויקוציטים הדלקתי לאתר של קיבוע טפיל.

בניגוד לזיהומים אחרים, וירוסים כלומר neutrotopic 4-6, שני תאי המלריה parasitized דם האדומים (pRBC), כמו גם הקשור inflammleukocytes atory יישאר מוחרם בתוך כלי דם ולא מסתנן parenchyma המוח. לפיכך, כדי למנוע זיהום של לויקוציטים המוחרם עם תאים שאינם דלקתיים במחזור, זלוף intracardial הנרחב של עכברים נגועים לפני חילוץ איברים ועיבוד רקמות נדרש בהליך זה כדי להסיר את תא הדם. לאחר זלוף, המוח נקצר ומבותר לחתיכות קטנות. מבנה הרקמה שבש עוד יותר על ידי טיפול האנזימטית עם collagenase D וDNAse I. אז homogenate המוח וכתוצאה הוא centrifuged בשיפוע Percoll המאפשר פרדה של לויקוציטים מוח המוחרם (מנהלת ליגה) מהמיאלין ופסולת רקמות אחרות. תאים מבודדים אז נשטפים, נספר באמצעות hemocytometer ומוכתם עם נוגדני ניאון לניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.

הליך זה מאפשר אפיון הפנוטיפי מקיף של לויקוציטים הדלקתי נודד למוח מחדשsponse לגירויים שונים, כולל שבץ, כמו גם זיהומים נגיפיים או טפילים. השיטה מספקת גם כלי שימושי להערכת טיפולים חדשניים אנטי דלקתיים במודלים של בעלי חיים קדם קליניים.

Protocol

1. זיהום של עכברים עם פ berghei-אנקה

  1. להפשיר aliquot של פ cryopreserved berghei האנקה pRBC.
  2. לרסן עכבר מוחות מלריה עמיד BALB / ג תורם (8-12 שבועות בן) באמצעות טכניקת האיפוק בשתי ידות. הזרק עכבר עם 100-200 μl של pRBC שימוש במזרק אינסולין מ"ל 1 (28g מחט). באופן שגרתי, 1-2 עכברים תורמים מוזרקים.
  3. בימים שלאחר הזיהום 4-5 (פאי) להסיר עכבר תורם מכלוב והנח אותו על תחנת עבודה או משטח עבודה פנויה.
  4. עדינות לרסן את העכבר עד סוף הזנב ובאמצעות מספריים קטנים לחתוך את קצה הזנב (כ 1 מ"מ). לחלופין, לנקב זנב קטן באמצעות מחט 25 G יכול להתבצע.
  5. הנח טיפת הדם מוריד הזנב של העכבר הקרוב לסוף שקופית מיקרוסקופ המעומם סוף.
  6. הנח שקופית שנייה (מפזר) בזווית של 45 °, ולגבות אותו לטיפה של דם. ברגע שהדם מתפשט לאורך הקצה, לדחוף את המפזר-שקופית הערבnly פני שקופית מיקרוסקופ כדי להפוך את הכתם של הדם. אפשר למרוח לייבוש באוויר.
  7. תקן את כתמי דם במתנול 100% למשך 30 שניות ולאחר מכן כתם שקופיות בGiemsa המוכן טרי למשך 10 דקות.
  8. יש לשטוף את כתם דם במים זורמים במשך דקות 1, לאפשר לאוויר יבש ולבחון שקופיות מתחת למיקרוסקופ (100x, טבילת שמן). למנות pRBC בתוך 1000 אריתרוציטים ולחשב parasitemia אחוזים. עכברים תורמים צריכים להגיע לרמות parasitemia בין 2.5-5% לפני שניתן יהיו דממו הם לזיהום של חיות ניסוי.
  9. איסוף דם מעכבר התורם על ידי דימום רטרו מסלולית באמצעות צינור נימי מייקר המטוקריט heparinized. כל הניסויים מבוצעים בעמידה בדרישות וולטר ואלייזה הול המכון בבעלי חי ועדת האתיקה. בהתאם לדרישות ועדת אתיקת בעלי חיים מקומיות נהלי דימום אחרים עשויים להיות בשימוש. להמס כמות הנדרשת של דם במדיום RPMI בריכוז סופי של 1x10 6 pRBC/0.2 מ"ל. תחשוב על זההמטוקריט עכבר רגיל הוא ~ 6x10 9 תאי דם אדומים / מ"ל 1.
  10. להדביק C57BL ניסיוני / 6 עכברים (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneally (IP) מיליליטר 1x10 6 pRBC/0.2.
  11. כדי לעקוב אחר רמות parasitemia של עכברים נגועים בצע את השלבים 1.3-1.8. Parasitemia צריך להיות נחוש כל 2-3 ימים מתחיל ביום 2 או 3 pi
  12. התפרצות של מלריה חמורה בC57BL / 6 עכברים עלולים להתבטא במראה כפוף, ruffed פרווה ופעילות נמוכה. עכברים מסוימים עשויים להתאושש בשלב זה, אך התקדמות לאובדן של רפלקס ליישר עצמי מצביעה על מחלה בלתי הפיכה ובעלי החיים חייבים להיות מורדמים.

2. זלוף Intracardial של עכברים ומיצוי המוח

  1. להרכיב מערכת זלוף הכביד ידנית על ידי הבטחת מאגר 500 מ"ל לבעל טור המחובר לחלקו העליון של מעמד עמודה 60 סנטימטרים. חבר צינור פלסטיק לקצה התחתון של המאגר ולאבטח מהדק צינורות לשלוט בזרימת חיץ. צרף צינורית למחט 23 G. Fill את המאגר עם PBS (החזיק ב22 מעלות צלזיוס), פתח לצבוט ולאפשר חיץ לרוץ דרך הצינורות כדי להסיר את כל בועות האוויר.
  2. להרדים פ עכבר berghei אנקה נגועה על ידי 2 משאיפת CO. לאשר את המוות בהעדר הדוושה, מסלולית ותגובות בדרכי נשימה.
  3. הצמד עכבר להרדים על ידי כפות האחוריות וקדמיות dorsally על קרש חיתוך קלקר הכלול במגש פלסטיק. בהתאם להרדמה מקומית Animal אתיקת ועדת דרישות יכולים להינתן בתחילה מוקדמת של pefusion intracardial.
  4. נגב צד הגחוני עם אתנול 70%.
  5. השתמש במספריים ומלקחיים גדולים כדי לפתוח עור לאורך קו האמצע על מנת לחשוף את חלל בית החזה. עור לקפל ולהדק את הצדדים.
  6. החזק את עצם החזה עם מלקחיים עדינים ולחתוך את הסרעפת ולאורך שני צידי עצם חזה ניתוק הצלעות. הקפד שלא לפגוע בשום כלי דם גדולים.
  7. להצמיד לצלעות בחזה באופן רופף לצד הראש.
  8. החזק שנינות חדרי לבמלקחי h דקים ועלייה ימנית בזהירות חתוך במספריים עדינים.
  9. הכנס מחט 23 ז המחובר למערכת זלוף הכביד לתוך חדר שמאלי לכיוון אב העורקים עולה תוך PBS פועל. הכנס רק 0.5 סנטימטר של קצה המחט.
  10. תנקב את העכבר למשך 5 דקות או עד ששפכים הוא ברור.
  11. עכבר הסר ולהניח אותה על הבטן שלה. נגב את הראש עם אתנול 70%.
  12. בעזרת מספריים גדולים, עושה חתך מעל לאזור חוט השדרה הצווארי.
  13. השתמש במספריים מצוינים לעשות חתך החציוני זנב-מקורי מתחיל בבסיס הגולגולת ולקלף את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
  14. מחזיק את הראש, הנח את הלהבים של מספריים קטנים לתוך כל חלל מסלולית ולעשות חתך בין המסלולים.
  15. לעשות חתך אורכים לאורך תפר sagittal ומקלף בזהירות את הגולגולת באונה כל מוח כלפי חוץ.
  16. בעזרת מרית, בעדינות להרים את המוח ולמקם אותו לתוך צינור צנטריפוגה 10 מ"ל המכיל בינוני RPMI.

3. בידוד של מוח Leukocytes-מוחרם (מנהלת ליגה)

  1. עבודה בקבינט ביטחון, מקום שנקטף מוח טרי על גבי מסננת נירוסטת תא (40-60 גודל רשת) בצלחת פטרי המכילה 3-5 מ"ל של מדיום תרבות רקמות RPMI.
  2. חיתוך ברקמת מוח לחתיכות קטנות.
  3. לדחוף חתיכות קטנות של רקמת מוח דרך מסננת התא באמצעות בוכנת גביש.
  4. העברת homogenate המוח לשפופרת 10 מ"ל וצנטריפוגה XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
  5. ממס גלול ב 3 מ"ל של מדיום RPMI, המכיל 0.05% collagenase D ו2U/ml DNAse I.
  6. סובב תערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. להסיר שאריות של תאים על ידי דחיפת התערובת באמצעות מסננת 70 מיקרומטר ניילון תא ו / או על ידי דוגר על קרח למשך 5 דקות.
  7. שכב homogenate מוח על 30% מיליליטר כרית 7 Percoll וצנטריפוגה XG ב 400 (ללא ברקסים) למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
  8. Resuspend גלול ב 1 מ"ל של חיץ תאי דם האדום תמוגה ולדגור על קרח למשך 5 דקות כדיlyse pRBC חסיד, שלא ניתן להסירו מהמוח על ידי זלוף intracardial.
  9. הוסף 9 מ"ל של מדיום RPMI, לשטוף תאים וצנטריפוגות XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
  10. מנהלת הליגה resuspend המכיל גלולה ב50-100 μl של מדיום RPMI ותאים להעברת צינור אפנדורף.
  11. מדולל aliquot 5-10 μl של מדגם התא 01:02 בTrypan כחול לזיהוי של תאי קיימא.
  12. ספירת תאי קיימא תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. מגיל 6 ואילך pi יום, כאשר פ עכברי berghei אנקה נגועה להציג סימנים נוירולוגיים, 20,000-100,000 BSLs ניתן לשחזר.

4. Immunophenotyping של מנהלת ליגה על ידי cytometry זרימה הססגונית

  1. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C, לשאוב supernatant ו resuspend גלול ב 50 μl של חיץ מכתים (PBS, 1% עוברי עגל בסרום (FCS), 2 המ"מ EDTA).
  2. הוסף μl 1 מתוך מטוהר anti-CD16/32 נוגדן (Fcblock).
  3. דגירת תאים עבור 10 דקות על קרח.
  4. שטוף תאים עם 1 מ"ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant.
  5. תאי resuspend ב 50 μl של הכתמת המאגר המכיל דילולים שנקבעו מראש אופטימליים של נוגדני ניאון הנדרשים, CD4 נגד כלומר, אנטי CD8, אנטי TCR ואנטי NK1.1.
  6. דגירה במשך שעה 1 על קרח.
  7. שטוף תאים עם 1 מ"ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant.
  8. Resuspend תאים ב100 μl של PBS.
  9. העברת תאים לצינור פלסטיק cytometry זרימה.
  10. שימוש cytometer זרימה, לרכוש לפחות 5,000-10,000 אירועים. פקדים מתאימים בתוליים תאים ודגימות פיצויי fluorochrome צריכים להיכלל כנדרשים.
  11. לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת cytometry זרימה מתאימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות באיור. 2 אחוזים מהופעות ולמספרים מוחלטים של אוכלוסיות שונות מנהלות התאוששו ממוחם של עכברי perfused או unperfused בקרה נגועה מלריה, ונאיביים. מנהלת הליגה מבודדת הוכתמה PE-אנטי NK1.1 ונוגדני APC-אנטי TCR-β כפי שצוינה בפרוטוקול הטקסט. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 7-9, αβTCR + תאי T מורכב שיעור גבוה של ברכת מנהלת הליגה במוחם של עכברים נגועים במלרית perfused (היום 6 פאי). אוכלוסייה זו שנראית באופן משמעותי ייצוג במוחם של בעלי חיים שאינם perfused (איור 2A-B). ההפחתה לכאורה של תדרים סלולריים T במוח שאינו perfused הייתה קשורה באחוז גבוה במידה ניכרת ומספר כולל של תאים שליליים כפולים (αβTCR - NK1.1 -) בבעלי חיים אלה (איור 2A-B). אחוז גבוה ומספרים בתאים שליליים כפולים במוחה unperfused לא היו מתגלה רק בעכברים נגועים במלריה, אלא גם בna & iuמ"ל; פקדי ve, טוען כי תאים אלה הם תאי דם לבנים שאינם דלקתיים המצויים בכלי דם במוח שהם התאוששו יחד עם תאי דלקת אם זלוף intracardial אינו מבוצע.

שתי דוגמאות נוספות של מנהלת ליגת ניתוח מוצגות באיור. 3 ואיור. 4. בקצרה, עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). עמותות זמניות בין גיוס יקוציט למוח והופעת תסמינים נוירולוגיים (בין 6-8 ימים pi) הוכחו בפ berghei אנקה נגועה 7-9 עכברים. בדוגמא הספציפית הזה, עכברים נגועים במלריה היו מורדמים ביום 6 פאי, ומנהלת הליגה טוהרו כמתואר בטקסט הפרוטוקול. מנהלת הליגה מבודדת הוכתמה PE-אנטי NK1.1 CD4 FITC-אנטי, APC-אנטי TCR-β, ונוגדני PerCPCy5.5-אנטי CD8α. הדגימות נרכשו באמצעות cytometer BD Biosciences FACSCalibur זרימה והניתוח בוצע באמצעות תוכנת 3.0.1 סמור. באמצעותתאי ble היו מגודרים על ידי קדימה ופיזור צד. את האחוזים של תאי NK, תאי T ותאי NKT (NK1.1 + TCR + תאים) מוחרמים במוח של עכברים תמימים ונגועים במלריה (היום 6 pi) המסומנת בפנלים העליונים (איור 3 א). הפנלים התחתונים מראים אחוזים מהסוג CD4 + וCD8 + לימפוציטים מסוג T בין NK1.1 המגודר - αβTCR + תאים (איור 3 א). איור. 3B מתאר דוגמה שבמספרים מוחלטים של CD4 + ותאי T CD8 + מוח מוחרמים חושבו ביום 6 pi עם פ berghei אנקה. באופן כללי, ניתן 20,000-100,000 מנהלת הליגה התאוששה ממוחם של פ עכברים נגועים אנקת berghei. מספר גורמים כגון פאי הזמן, רגישות של עכבר הזן או ההכללה של טיפולים אנטי דלקתיים עשויות להשפיע על התאוששות תא. באופן שגרתי, מוח אדם אחד מספק מספיק תאים לסט 1 מתוך stainings נוגדנים.

בדוגמא שספקה בFiגרם. 4 השימוש בקולט הכמוקין של לימפוציטים מסוג T מוח המוחרם נותח. עכברים נגועים בפ berghei האנקה ומנהלת הליגה היינו מבודדת ביום 6 תאי pi הוכתמו APC-אנטי TCR-β, נוגדני biotinylated-אנטי CCR5-אנטי CXCR3 PE ו, ואחרי דגירה עם-PerCPCy5.5 streptavidin הצמוד. דוגמאות נרכשו ונותחו לפי איור. 3. את היסטוגרמות מייצגת אחוזי התאים + αβTCR בין מנהלת ליגה הכוללת בעכברים נגועים בקרה-מלריה ונאיביים. חלקות הגובה באמצע והפנלים תחתונים מראות את האחוזים של CXCR3 + + וCCR5 תאים בתוך αβTCR המגודר + תאים.

איור 1
איור 1. תרשים זרימה של ההליך לבידוד וניתוח של מנהלת הליגה מפ עכברי berghei אנקה נגוע. (1) aliquot cryopreseved של פ berghei האנקה pRBC הוא הפשיר ו1 או 2 עכברים תורמים נגועים. (2) הרמות כעבור ארבעה ימים parsitemia של עכברים תורמים מחושבות, עכברים תורמים הם דילולים דממו ודם שהוכנו לזיהום של עכברי ניסוי. אז זיהום מלריה הוא להגדיר בC57BL מלריה החמורה רגיש / 6 עכברים. (3) בפאי 5-7 ימים, עכברים מורדמים על ידי 2 משאיפת CO ומייד intracardially perfused כדי להסיר את כל התאים במחזור שאינם חסידים. (4) מוחותיהם אז נקצר וhomogenate מוח שהוכן על ידי עיכול הרקמה עם collagenase D וDNAse I. מנהלת ליגה שלאחר מכן נפרד מהמיאלין ופסולת תא על ידי שיפוע Percoll. (5) זרזה מנהלת הליגה אז נשטפים, נספר באמצעות hemocytometer, מוכתם נוגדני ניאון ונותח על ידי cytometry זרימה.

ether.within עמודים = "תמיד"> איור 2
איור 2. ניתוח מנהלת ליגה במוחם של עכברי perfused או unperfused. עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). המוח נקצר ב 6 pi היום מחי perfused או unperfused. מנהלת הליגה הייתה מבודדת, מוכתמת נוגדנים אנטי NK1.1 ואנטי TCR ניאון ונותח על ידי cytometry זרימה. () חלקות דוט מתארות אחוזי תאי NK, לימפוציטים מסוג T, NK1.1 + + TCR תאים והתאים שליליים כפולים NK1.1 - TCR - בperfused (פנלים עליונים) או (הפנלים תחתונים) unperfused עכברי בקרה נגועות מלריה, ונאיביים . (ב) המספר המוחלט של תאים שליליים כפולים ולימפוציטים מסוג T וחושב על יום פאי 6 עם פ berghei אנקה ועכברי בקרה נאיביים. כל הבר represeNTS הממוצע של 3 דגימות ± SEM, * p> 0.05.

איור 3
איור 3. תאי NK ותאי T יכולים להיות מזוהים במוחם של פ עכברים נגועים אנקת berghei. עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). מוחות הוצאו ב 6 pi היום אחרי זלוף מבעלי החיים מורדמים. מנהלת הליגה הייתה מבודדת, מוכתמת באנטי NK1.1, אנטי TCR, אנטי CD4 ונוגדני ניאון אנטי CD8 ונותח על ידי cytometry זרימה. () פנלים למעלה מתארים אחוזי תאי NK, תאי T וNK1.1 + + TCR התאים בעכברים נגועים בקרה-מלריה ונאיביים. פנלים תחתונים להמחיש אחוזי CD4 + ותאי T CD8 + בתוך αβTCR המגודר + NK1.1 - (ב) המספר המוחלט של CD4 המוח המוחרם + ו CD8 + תאי T חושבים על יום פאי 6 עם פ berghei אנקה ועכברי בקרה נאיביים. כל עמודה מייצגת הממוצע של 3 דוגמאות ± SEM.

איור 4
איור 4. רוב לימפוציטים מסוג T הנודד למוח בתגובה לזיהום מלריה חמור להביע קולט הכמוקין CXCR3. עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). מוחות הוצאו ב 6 pi היום אחרי זלוף הנרחב של בעלי החיים מורדמים. מנהלת הליגה הייתה מבודדת, מוכתמת באנטי TCR, אנטי CXCR3 ונוגדנים אנטי CCR5 ונותח על ידי cytometry זרימה. פנלים עליונים מתארים אחוזי αהלימפוציטים βT בעכברים נגועים בקרה-מלריה ונאיביים. חלקות הגובה להמחיש אחוזי CXCR3 + (אמצע פנלים) וCCR5 + (פנל תחתון) בתוך תאי הלימפוציטים + αβTCR מגודרים.

בעיה פתרון בעיות
זלוף לא הושלם
  • בדקו שPBS הוא בטמפרטורת חדר לפני מרוסס עכברים.
  • היזהר שלא לכופף את כלי הדם שהיו מתחת לכלוב הצלעות.
  • להיות carful לא לניק כל איברים (למשל הכבד) כאשר פותחים את בית החזה.
  • התאם את קצב זרימת PBS ל~ 5 מ"ל / דקה. דם לא יוסר מהר מספיק אם הזרימה איטית מדי, שעלול לגרום לקרישי דם. אם הזרימה היא מהירה מדי, בלחץ הגבוה עלול לפגוע בכלי דם קטנים.
  • אל תכניס את המחט עמוקה מדי בלחדר השמאלי כמאי לנקב זה המחיצה. כדי להימנע מכך, לצייר 5 מ"מ סימן מקצה המחט להשתמש כמדריך.
לא מספיק מנהלת הליגה התאוששה
  • בדקו parasitemia של פ עכברים נגועים אנקת berghei. על 5-6 pi היום, העכברים צפויים להגיע ~ parasitemia% 4-7.
  • בדקו collagenase D וריכוז DNAse אני בקוקטייל העיכול. אין מספיק אנזימים עלולים לסכן את התאוששות תא.
  • הארך את עיכול אנזימטי של רקמת המוח עד 1 שעה.

טבלת 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבידוד והאנליזה של מנהלת הליגה הוא שיטה המאפשרת אפיון וכימות של תאים דלקתיים הנודדים למוח בתגובה לפגיעה ברקמות או זיהום במודלים של עכברי ניסוי. ההקדמה של צעד זלוף intracardial להסרת תא הדם לפני חילוץ איברים ובידוד התא הבא היא שימושית כדי למנוע זיהום של תאים דלקתיים עם לויקוציטים במחזור שאינו דלקתי. זה לא יכול להיות דרישה הכרחית בזיהומי neurotropic כגון וירוס Encephalomyelitis עכברי שבתאים דלקתיים לחדור למוח parenchyma 5, אך רלוונטי במיוחד במלרית מכרסם, בי אריתרוציטים נגועים וLeukocytes הדלקתי נשארים מוחרמים בתוך כלי דם ולא מסתננים רקמת המוח . בהתאם לכך, זלוף intracardial של עכברים נגועים במלריה לא צריך להיות מומלץ רק לניתוח של מנהלת הליגה, אך יכול להיות שימושי גם עבורהערכה של קיבוע טפיל רקמות 10,11. בדומה לויקוציטים במחזור שאינם דלקתיים, גלגולים המוקדמים של טפילי מלריה אינם מסוגלים לדבוק לאנדותל כלי הדם, ויש להסיר על ידי הליך זלוף. לעומת זאת, pRBC חסיד (schizonts הבוגר) מופיע להישאר בתוך כלי דם במוח. פ הטפילים הטרנסגניים Anka berghei מבטאים לוציפראז כבר נוצרו 12 והם משאב יקר ערך עבור סוג זה של ניתוח. לאחר הדבקה עם קווי לוציפראז מבטא-, רקמות התפייס הטפיל יכול להיקבע על ידי הדמיה של מוח perfused מבעלי חיים נגועים באמצעות מערכת IVIS 10,11. השוואה ישירה של טפיל-התפייס בימים 6-7 pi במוחם של בעלי חיים ומוח של עכברי perfused נגוע בטפילי כתב שלב ספציפיים (כלומר להביע לוציפראז רק במהלך שלב schizont) יהיה שימושי עבור אימות נוספת של שיטה זו.

אחדחסרון מהותי של גישות מסורתיות לניתוח היסטולוגית של רקמות תאי הסתננות היא שהטכניקות הללו אינם מאפשרות הערכה של אוכלוסיות תאים שדורשות הכרה בסמן יותר מתא אחד לזיהוי שלהם (כלומר NK1.1 + + αβTCR CD1d מוגבל NKT או CD4 + + T תאי Foxp3 רגולציה). בניגוד ליסטולוגיה, ניתוח cytometric זרימה של לויקוציטים הדלקתי הוא נוח לstainings נוגדנים המרובים, מתן כלים שימושיים מאוד לאפיון פנוטיפי מקיף של חודר סלולרי 7,9,13. בנוסף, שיטה זו היא רגישה מספיק כדי לזהות אוכלוסיות תאים המתרחשים בתדרים נמוכים כמו 1-3% מintravascular הסך לחדור, לרבות אנדוגני לא רק, אלא גם תאים שהועבר adoptively כמו גם תאי T ספציפיים לאנטיגן. פ טפילים הטרנסגניים Anka berghei מבטאים אפיטופים MHC II-MHC אני מוגבל ומOVA 14 + CD8 + תאי T מOT-I עכברים ניתן היה לזהות בין מנהלת הליגה לLy5.2 עכברים + C57BL / 6 PbTG נגוע, מתן עדויות לכך שתאי T דלקתיים נודדים למוח ב תגובה למלריה הן 14 טפיל ספציפי.

הניתוח של מנהלת הליגה שימושי גם כדי להעריך את הפוטנציאל של טיפולים חדשניים אנטי דלקתיים במודלים של בעלי חיים קדם קליניים. לדוגמה, היכולת של נוגדנים חד שבטי כנגד חלבון CXCR3 הכמוקין IFN-γ-מושרה 10 (IP-10) כדי למנוע חדירת intravascular מוח ולהקל על תסמיני מחלה הקשורים למלריה חמורה הודגמה בהצלחה באמצעות זהשיטת 11.

מגבלה אחת ששיטה זו יכולה להיות היא שהמספר הכולל של תאי מוח התאוששו מאדם אחד הוא בדרך כלל מספיק עבור קבוצה אחת של stainings נוגדנים. לכן ניסויים נפרדים יש צורך אם יותר מ 4-6 סמנים סלולריים נדרשים לניתוח. באופן כללי, הוא ההליך קל לביצוע. הצעד היחיד שעלולה לדרוש קצת אימון ראשוני הוא זלוף intracardial. כמה רמזים שיכולים להיות שימושי כדי להתגבר על בעיות פוטנציאליות מופיעים בטבלת 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות למיס ליאנה מצקייביץ' לסיוע טכני. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני מדינת ממשלה התפעולית תשתיות וממשלה האוסטרלית הלאומיים בריאות והמועצה למחקר הרפואי IRIISS והפרויקט גרנט 1031212.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions and buffers
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500 1:10 dilution in distilled water
RPMI medium Mouse tonicity
Mouse tonicity PBS 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3
0.4%Trypan Blue Sigma Aldrich T-8154 1:2 dilution
Collagenase D Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I Sigma Aldrich D4263-5VL From bovine pancreas
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 30% solution in PBS
Ultrapure Tris Invitrogen 15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl) AnalaR 10017
Red Cell Lysis Buffer 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2
FCS Gibco 1009
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1M, pH 7.2
Antibodies and conjugates
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 BD Pharmingen 553142 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml)
FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 R&D Systems FAB1685P
Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
Equipment and material
SuperFrost microscope slide Lomb Menzel-Gläser
Dissection forceps, scissors REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir Nalgene
Rubber tubing
23G needle BD PrecisionGlide 302008
Cell dissociation kit containing metal sieve Sigma Aldrich CD-1
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
Hemocytometer GmbH Neubauer 717810
Flow cytometry tubes BD Falcon 352008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
  2. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
  3. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
  4. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
  5. LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
  6. Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
  7. Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
  8. Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
  9. Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
  10. Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
  11. Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
  12. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
  13. Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
  14. Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).

Tags

אימונולוגיה גיליון 71 זיהום מחלות זיהומיות המטולוגיה ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה תאית עכבר מוח דלקת intravascular טפיל מלריה מודל חיה
בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J.,… More

Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J., Hansen, D. S. Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice. J. Vis. Exp. (71), e50112, doi:10.3791/50112 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter