Summary
의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한 방법
Abstract
우리는 P.의 뇌 혈관의 점착성의 염증 세포의 분리 및 특성에 대한 방법을 설명 berghei ANKA에 감염된 쥐. 실험 뇌성 말라리아의 유도, neurologic 증후군이 기생충 변형 결과를 따르게 마우스 변종의 감염 인간 1,2에서 Plasmodium falciparum로 인한 심각한 말라리아 recapitulates 특정 중요한 측면이. 혈액 단계 말라리아의 중년 여인 형태들이 혈관 내피 세포에 바인딩 할 수 있습니다 감염된 적혈구의 표면에 기생 단백질을 표현한다. 이 과정은 hypoxia와 haemorrhages 3 결과, 혈액의 흐름에 장애물을 유도하며 기생충 격리의 사이트에 염증 백혈구의 모집을 자극.
다른 감염, 즉 neutrotopic 바이러스 4-6 말라리아-parasitized 적혈구 (pRBC)뿐만 아니라 관련 inflamm 모두는 달리atory 백혈구는 혈관 내에서 오히려 뇌 실질에 침투보다 분리 된 상태로 유지됩니다. 따라서 비 염증 순환 세포, 장기의 추출 및 조직 처리하기 전에 감염된 - 쥐의 광범위한 intracardial 재관류로 분리 된 백혈구의 오염을 방지하는 것은 혈액 구획을 제거하는이 절차가 필요합니다. 재관류 후, 머리가 수확되고 작은 조각으로 해부 했어요. 조직 구조는 더욱 그 결과 뇌 homogenate 그때 myelin 및 기타 조직 쓰레기들로부터 뇌를 분리 백혈구의 분리 (BSL)을 할 수있는 Percoll 기울기에 centrifuged되어 Collagenase D 및 DNAse I.있는 효소 처리에 의해 방해된다. 절연 셀이 후 씻어 있으며, 유동 세포 계측법에 의한 후속 분석을 위해 형광 항체와 hemocytometer과 스테인드을 사용하여 계산.
이 절차는 염증성 백혈구의 종합적인 phenotypic 특성을 다시에있는 뇌로 마이그레이션 할 수 있습니다뇌졸중뿐만 아니라 바이러스 또는 기생충 감염 등 다양한 자극에 sponse. 방법은 또한 사전 임상 동물 모델에서 소설 항 염증성 치료의 평가에 유용한 도구를 제공합니다.
Protocol
1. P.있는 마우스의 감염 berghei - ANKA
- 녹이 cryopreserved P.의 나누어지는 berghei ANKA pRBC.
- 두 손으로 구속 기법을 사용하여 뇌성 말라리아에 저항력이 BALB / C 공여 마우스를 (8-12주짜리) 구속. 1 ML의 인슐린 주사기 (28G 바늘을)를 사용 pRBC의 100-200 μl와 마우스를 주입. 일상적으로, 1-2 기증자 마우스가 주입되어 있습니다.
- 후 감염 4~5일에서 (PI) 케이지에서 기증자 마우스를 제거하고 워크 스테이션이나 일회용 작업 패드에 놓으십시오.
- 부드럽게 꼬리의 끝 부분에 마우스를 구속하고 작은 가위를 사용하여 (약 1mm) 꼬리 끝을 잘라. 또는 25 G 바늘을 사용하여 작은 꼬리 구멍이 수행 될 수 있습니다.
- 불투명 엔드 현미경 슬라이드의 끝 부분 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액 한 방울을 넣으십시오.
- 45 ° 각도에 두 번째 슬라이드 (확장기)를 놓고 피 드롭으로 다시. 피가 가장자리를 따라 펼쳐지되면, 확장기 - 슬라이드 이브를 밀어핏자국을 할 수있는 현미경 슬라이드에 걸쳐 nly. 비방은 건조한 공기 할 수 있습니다.
- 10 분에 신선하게 조리 된 Giemsa에서 슬라이드를 착색 한 후 30 초 100 %의 메탄올에 피 묻은 얼룩을 수정합니다.
- 1 분에 물을 실행에 핏자국을 씻어, 공기 건조 할 수 있으며 현미경 (100x, 석유 침적)에서 슬라이드를 검사합니다. 1000 적혈구 내에서 pRBC을 열거하고 %의 parasitemia를 계산합니다. 그들이 실험 동물의 감염 출혈이되기 전에 기증자 마우스는 2.5-5 % 사이 parasitemia 수준에 도달해야합니다.
- heparinized 마이크로 혈소판 모세관을 사용하여 복고풍 궤도 출혈에 의해 기증 마우스에서 혈액을 수집합니다. 모든 실험은 월터 엘리자 홀 연구소 및 동물 윤리위원회의 요구 사항을 준수 수행됩니다. 지역 동물 윤리위원회의 요구에 따라 다른 출혈이 절차를 사용할 수 있습니다. 1X10 6 pRBC/0.2 ML의 최종 농도에 RPMI 매체에서 혈액 필요한 양을 분해. 그을 고려일반 마우스 혈소판 ~ 6x10 9 적혈구 / 1 ML입니다.
- intraperitoneally (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 ML을 주입하여 실험 C57BL / 6 마우스 (8-12주 이전)를 감염.
- 감염된 쥐 parasitemia 수준을 모니터링하려면 단계 1.3-1.8를 따르십시오. Parasitemia는 하루에 2 ~ 3 파이부터 2-3일 모든 결정해야
- 쥐가 hunched 모양과 같은 매니페스트 수도 C57BL에서 / 6 심한 말라리아의 증상은, 모피 및 낮은 활동을 주름 옷깃이 달린. 일부 마우스는이 단계에서 복구 할 수 있지만, 자기 righting 반사 손실에 진행은 돌이킬 수없는 질병을 나타냅니다과 동물은 euthanized해야합니다.
2. 마우스 및 뇌 추출의 Intracardial 재관류
- 60cm 열 스탠드 상단에 부착 된 열 홀더에 500 ML 저장소를 확보하여 수동 중력 재관류 시스템을 조립. 저수지의 바닥 끝 부분에 플라스틱 튜브를 연결하고 버퍼 흐름을 제어 할 수있는 튜브 클램프를 고정하십시오. 23 G 바늘에 튜브를 연결합니다. FilPBS (22 ° C에 보관)과 저수지까지 내 말은, 클램프 및 모든 기포를 제거하는 튜브를 통해 실행하는 버퍼를 허용 엽니 다.
- 안락사시켜야 P. CO 2 흡입하여 berghei ANKA에 감염된 마우스. 페달, 궤도 및 호흡기 반응의 부재에 의해 죽음을 확인합니다.
- dorsally 플라스틱 트레이에 포함 된 스티로폼 분해 보드에 뒷다리와 앞 손으로 euthanized 마우스를 핀. 지역 동물 윤리위원회 요구 사항 마취에 따라 intracardial pefusion의 사전 개시를 관리 할 수있다.
- 70 %의 에탄올과 복부 측면을 닦아주십시오.
- 흉강을 노출하는 중간 선을 따라 피부를 열고 대형 가위와 집게를 사용하십시오. 측면에 접어 핀 피부.
- 고급 집게로 가슴을 잡고 가로막을 절감하고 가슴의 양쪽을 따라 갈비뼈를 severing. 대용량의 혈관을 손상 않도록주의보십시오.
- 머리를 느슨하게 옆에있는 흉골에 의해 흉곽을 고정.
- 심실의 지혜를 개최H 고급의 포셉, 고급 가위로 조심스럽게 절개 우심방.
- PBS가 실행되는 동안 오름차순 대동맥으로 왼쪽 심실에 비중 재관류 시스템에 부착 23G 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝의 0.5 cm를 삽입합니다.
- 5 분 또는 유출 될 때까지 마우스를 Perfuse 것은 분명하다.
- 고정 해제 마우스와 복부에 놓여 있었다. 70 %의 에탄올과 머리를 닦아주십시오.
- 큰 가위를 사용하여, 그냥 자궁 경부 척추 영역 위에 몫을합니다.
- 중간 꼬리 - 뱃 부리 장식이있는 컷이 두개골을 노출 떨어져 두개골의 기지에서 시작, 피부 껍질을 벗기면하기 위해 고급 가위를 사용합니다.
- 머리 개최, 각 궤도 구멍에 작은 가위 블레이드를 배치하고 궤도 사이의 몫을합니다.
- 시상 봉합을 따라 길이 방향 절단을 확인하고 조심스럽게 바깥쪽으로 각각의 뇌 반구에있는 두개골 껍질을 벗기면.
- 주걱 사용하여 부드럽게 뇌를 들고 RPMI 매체를 포함하는 10 ML의 원심 분리기 튜브에 넣습니다.
3. 뇌 - 분리 된 백혈구의 절연 (BSL)
- 안전 캐비닛에서 근무 곳 갓 RPMI 조직 문화 매체 3-5 ML을 포함하는 배양 접시에있는 스테인리스 스틸 셀 스트레이너 (40-60 메쉬 크기)의 상단에 뇌를 수확.
- 작은 조각으로 뇌 조직을 잘라 버릴거야.
- 크리스탈 플런저를 사용하여 셀 스트레이너를 통해 뇌 조직의 작은 조각을 밀어 넣습니다.
- 4에 10 분 ° C.에 250 XG에서 10 ML 튜브와 원심 분리기에 뇌 homogenate를 전송
- 0.05 % Collagenase D 및 2U/ml DNAse I.를 포함 RPMI 매체의 3 ML에서 펠렛을 분해
- 실온에서 30 분을위한 혼합물을 회전합니다. 70 μm 나일론 셀 스트레이너 및 /를 통해 혼합물을 눌러 5 분 동안 얼음에 잠복기에 의한 세포 파편을 제거합니다.
- 실온에서 20 분 400 XG (브레이크)에서 7 ML 30 % Percoll 쿠션과 원심 분리기에 뇌 homogenate를 놓는다.
- 5 분에 대한 얼음에 붉은 혈액 세포 용해 버퍼와 품다 1 ML에 Resuspend 펠릿intracardial 재관류에 의해 뇌에서 제거 할 수 없습니다 자기편 pRBC을 lyse.
- RPMI 매체 9 ML을 추가, 4 ° C.에 10 분을 위해 250 XG에서 세포와 원심 분리기를 씻어
- RPMI 매체와 Eppendorf 튜브에 전송 세포의 50-100 μl에 Resuspend BSL 함유 펠렛.
- 가능한 세포의 식별 Trypan 파란색으로 셀 샘플의 5-10 μl 나누어지는 1시 2분을 희석.
- hemocytometer를 사용하여 현미경으로 가능한 셀을 계산합니다. 6 일 파이 (Π) 이후, P.에서 berghei ANKA에 감염된 마우스는 20,000-100,000 BSLs을 복구 할 수 있습니다, 신경 증상을 표시합니다.
4. 여러 가지 빛깔의의 유동 세포 계측법에 의해 BSL의 Immunophenotyping
- 4에 10 분 ° C에 250 XG에서 세포를 원심 분리기 (PBS, 1 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 2mm EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 착색 버퍼 50 μl의 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 대기음.
- anti-CD16/32 항체 (Fcblock)를 정화의 1 μl를 추가합니다.
- 1 세포를 배양얼음에 0 분.
- 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음.
- 필요한 형광 항체의 미리 정해진 최적의 dilutions 즉, 안티 - CD4, 항 CD8, 안티 TCR 및 안티 NK1.1를 포함하는 버퍼를 착색의 50 μl에 Resuspend 세포.
- 얼음에 1 시간에 품다.
- 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음.
- PBS 100 μl에 세포를 Resuspend.
- 유동 세포 계측법 플라스틱 튜브에 세포를 전송합니다.
- 흐름 cytometer를 사용, 적어도 5,000-10,000 이벤트를 취득. 필요에 따라 적절한 흠없는 셀 컨트롤과 fluorochrome 보상 샘플이 포함되어야합니다.
- 적절한 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.
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Representative Results
그림의 결과입니다. 이 쇼 비율과 perfused 또는 unperfused 말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 마우스의 뇌에서 발견 한 다른 BSL 인구의 절대 숫자. 프로토콜 텍스트에 표시된대로 절연 BSL는 PE - 반 NK1.1과 APC-반 TCR-β 항체 물들했다. 이전 결과 7-9에 의거하여 αβTCR + T 세포는 perfused 말라리아에 감염된 쥐 (6 일 PI)의 뇌에있는 BSL 수영장의 높은 비율을 구성. 이 인구는 크게 (그림 2A-B) 비 perfused 동물의 뇌에 제대로 이루어지지 못해 것으로 나타났다. 이 동물 (그림 2A-B) 비 perfused 뇌에 T 세포 주파수의 명백한 감소는 상당히 높은 비율을 더블 부정적인 세포의 총 수 (- - NK1.1 αβTCR)과 관련된되었습니다. unperfused 뇌에 두 번 부정적인 세포에서 높은 비율과 숫자가 아니라 NA & IU의 말라리아에 감염된 쥐에서만 발견하지 못했습니다ML, VE 컨트롤이 세포가 intracardial 재관류이 수행되지 않은 경우 염증 세포와 함께 복구 아르 뇌 혈관에 존재하는 비 염증성 백혈구 것을 제안.
BSL 분석의 두 가지 더 예는 그림에 표시됩니다. 3 그림. 4. 간단히, C57BL / 6 마우스는 P.에 감염되었습니다 berghei ANKA (1x10 6 pRBC). 백혈구 뇌에 회원 모집 및 신경 증상의 발병 (일 6-8 PI 사이) 사이의 시간적 협회는 P.에서 보여준되었습니다 berghei ANKA 쥐 7-9 감염. 이 특정 예제에서, 말라리아에 감염된 생쥐는 하루에 6 파이에 euthanized되었고, 프로토콜 텍스트에 설명 된대로 BSL은 정화되었다. 절연 BSL는 PE - 안티 - NK1.1, APC-반 TCR-β, FITC-항 CD4와 PerCPCy5.5 - 반 CD8α 항체 물들했다. 샘플은 족제비 3.0.1 소프트웨어를 사용하여 BD Biosciences FACSCalibur 흐름 cytometer 및 수행 분석을 사용하여 획득했다. 를 통해경 세포는 순방향 및 측면 분산하여 출입을 금지했다. NK 세포, T 림프구와 NKT 세포 (NK1.1 + TCR + 세포)의 비율은 상단 패널 (그림 3A)에 표시됩니다 순진하고 말라리아에 감염된 쥐 (6 일 PI)의 뇌에 격리. 하단 패널은 CD4의 비율을 보여 + 및 출입을 금지 NK1.1 사이 CD8 + T 림프구 - αβTCR + 세포 (그림 3A). 그림. 3B는 CD4 +와 CD8 + 뇌 분리 된 T 세포의 절대 숫자는 P.와 함께 6 일 파이에 계산 된의 예를 도시 berghei ANKA. 일반적으로 20,000-100,000 BSL은 P.의 뇌에서 발견 할 수 있습니다 berghei ANKA 감염된 쥐. 같은 시간 파이 등 여러 가지 요인이 항 염증 치료의 마우스 스트레인 또는 포함의 민감도는 세포 복구에 영향을 미칠 수 있습니다. 일상적으로, 한 개인의 뇌는 항체 stainings의 1 세트에 충분한 세포를 제공합니다.
Fi 접속 설비에서 제공되는 예에서g. 뇌 격리 T 림프구의 4 케모카인 수용체 사용 분석되었다. 마우스는 P.에 감염되었습니다 berghei ANKA 및 BSL은 하루에 6 파이 셀은 streptavidin-PerCPCy5.5 켤레과 부화에 이어 APC - 반 TCR-β, PE-반 CXCR3와 biotinylated - 안티 CCR5 항체, 물들 된 고립되었다. 샘플이 획득 및 그림에 따라 분석 하였다. 3. histograms 말라리아에 감염된 그리고 나이브 컨트롤 마우스에 총 BSL 사이 αβTCR의 + 세포의 비율을 나타냅니다. 중간과 하단 패널의 윤곽 플롯은 CXCR3의 비율 +와 CCR5 출입을 금지 αβTCR 내 + 셀 + 세포를 보여줍니다.
BSL의 분리 및 분석을위한 절차의 그림 1. 흐름 차트P.에서 berghei ANKA에 감염된 쥐. P. (1) A cryopreseved 나누어지는 berghei ANKA pRBC는 defrosted되어 있으며 1 개 또는 2 기증자 마우스가 감염되어 있습니다. (2) 기증 마우스 네 일 후 parsitemia 수준은 기증 쥐 실험 쥐 감염을 준비 없어져야 및 혈액 dilutions되어 계산됩니다. 말라리아 감염 후 심한 말라리아 - 민감 C57BL / 6 마우스에 설정되어 있습니다. (3) 일 5-7 PI에서 쥐들이 CO 2 흡입하여 euthanized 즉시 intracardially 모든 순환 비 점착성의 세포를 제거하는 perfused 있습니다. (4) 뇌 그런 다음 수확하고 Collagenase D와 DNAse I. BSL과 조직의 소화에 의해 준비 뇌 homogenate는 다음 Percoll 기울기에 의해 myelin과 셀의 잔해로부터 구분됩니다. (5) BSL은 다음 씻어 형광 항체 물들과 유동 세포 계측법에 의해 분석 hemocytometer를 사용하여 계산됩니다 시켰던.
그림 2. perfused 또는 unperfused 쥐 뇌에 BSL 분석. C57BL / 6 마우스는 P.에 감염되었습니다 berghei ANKA (1x10 6 pRBC). 뇌는 perfused 또는 unperfused 동물 6 일 파이에 수확되었다. BSL은 절연 방지 NK1.1 및 안티 TCR 형광 항체 물들과 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 쥐를 perfused에 (상단 패널) 또는 unperfused (아래 패널) - TCR - (A) 점 플롯은 NK 세포, T 림프구, NK1.1 NK1.1 + TCR + 세포와 더블 부정적인 세포의 비율을 묘사 . (B) 절대 더블 부정적인 세포와 T 림프구의 수와는 P.와 함께 6 일 파이에 계산 berghei ANKA 그리고 나이브 제어 마우스. 각 막대 represe국세청 세 샘플의 평균 ± SEM, * P> 0.05.
그림 3. NK 세포와 T 림프구는 P.의 뇌에서 감지 할 수 있습니다 berghei ANKA 감염된 쥐. C57BL / 6 마우스는 P.에 감염되었습니다 berghei ANKA (1x10 6 pRBC). 뇌는 euthanized 동물의 재관류 후 6 일 파이에 추출되었다. BSL은 안티 - NK1.1, 안티 TCR, 항 CD4 및 안티 CD8 형광 항체 물들과 유동 세포 계측법에 의해 분석, 고립되었다. (A) 상단 패널은 NK 세포, T 림프구와 말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 쥐 NK1.1 + TCR + 세포의 비율을 도시한다. 하단 패널은 개폐 αβTCR 내 CD4 +와 CD8 + T 세포 + NK1.1의 비율을 보여줍니다 - (B) 뇌 분리 된 CD4의 절대 숫자 +와 CD8 + T 세포는 P.와 함께 6 일 파이에 계산 berghei ANKA 그리고 나이브 제어 마우스. 각 막대는 3 샘플 ± SEM의 평균을 나타냅니다.
그림 4. 심각한 말라리아 감염에 대한 응답으로 뇌에 이주하는 T 림프구의 대부분은 케모카인 수용체 CXCR3을 표현한다. C57BL / 6 마우스는 P.에 감염되었습니다 berghei ANKA (1x10 6 pRBC). 뇌는 euthanized 동물의 광범위한 재관류 후 6 일 파이에 추출되었다. BSL은 절연 안티 - TCR, 안티 CXCR3 및 안티 CCR5 항체 물들과 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 상단 패널은 α의 비율을 묘사말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 쥐 βT 림프구. 등고선 플롯은 CXCR3 + (중앙 패널)와 CCR5 + (아래 패널) 출입을 금지 αβTCR의 +의 림프구에서 세포의 비율을 보여줍니다.
| 문제 | 문제 해결 |
| 불완전 재관류 |
|
| 충분한 BSL은 복구되지 않음 |
|
표 1.
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Discussion
BSL의 절연 및 분석은 특성화 및 실험 마우스 모델에서 조직 부상이나 감염에 대한 응답으로 뇌에 이주하는 염증 세포의 정량화 할 수있는 방법입니다. 장기 추출 및 후속 전지 분리하기 전에 혈액 구획의 제거를위한 intracardial 재관류 단계의 도입은 비 염증성 순환 백혈구와 염증 세포의 오염을 방지하기 위해 유용합니다. 이 염증 세포가 뇌 실질 5 침투하는 등 손쥐 뇌척수염 바이러스 등의 neurotropic 감염에 필수적인 요건이 될하지만, 감염된 적혈구와 염증 백혈구가 남아 혈관 내에서 분리 된 것이 아니라 뇌 조직에 침투하는, 쥐 말라리아에 특히 관련이 없을 수도 . 따라서, 말라리아에 감염된 쥐 intracardial 재관류는 BSL의 분석을 권장해서는 안뿐만 아니라 유용 할 수 있습니다기생충 - 조직 격리 10,11의 평가. 비 염증 순환 백혈구와 마찬가지로, 말라리아 기생충의 미숙 한 형태의 혈관 내피을 준수 할 수 있으며, 재관류 절차에 의해 제거해야합니다. 반면, 점착성의 pRBC (성숙 schizonts)은 뇌 혈관 내에 남아있는 것 같습니다. P. 루시 페라 제 표현을 berghei ANKA 유전자 변형의 기생충은 12를 생성 및 분석이 유형의 가치있는 리소스입니다되었습니다. 루시 페라 제 - 표현 라인 감염 후, 기생충 조직 - 격리는 IVIS 시스템 10,11을 사용하여 감염된 동물에서 perfused 뇌의 영상에 의해 결정될 수있다. 마우스 perfused 동물과 뇌의 뇌의 일 6-7 파이의 기생충 - 격리의 직접 비교가 무대 별 기자 기생충에 감염 (예 : 만 schizont 단계에서 루시 페라 제 표현)이 방법의 추가 확인을 위해 유용 할 것입니다.
한의 분석을 위해 기존의 조직 학적 접근 방법의 중요한 단점 조직 - 침투 세포를하면 이러한 기술을 허용하지 않는 것입니다 자신의 식별 하나 이상의 셀 표시 (예 NK1.1 + αβTCR + CD1d 제한 NKT 또는 CD4 인정을 필요로 세포 인구의 평가 + Foxp3 + T 세포 규제). 조직학과는 달리, 염증성 백혈구의 흐름 cytometric 분석은 세포 침투 7,9,13 종합 phenotypic 특성에 대한 매우 유용한 도구를 제공하는 여러 항체 stainings 의무가 있습니다. 또한,이 방법은 전체 혈관 내생뿐만 아니라 adoptively 이전 셀뿐만 아니라, 항원 특정 T 세포뿐만 아니라 포함 침투 1-3 %의 낮은 주파수에서 발생하는 세포 인구를 감지 할 수있을만큼 민감하다. P.는 OVA 14 일부터 MHC I과 MHC II 제한 epitopes을 표현 berghei ANKA 유전자 변형의 기생충 + C57BL / 6 PbTG에 감염된 생쥐 Ly5.2의 BSL 사이에 감지 할 수있는 OT-I 마우스에서 Ly5.1 + CD8 + T 세포를 전송, 여기서 설명 말라리아에 대한 반응은 기생충 특정 14아르.
BSL의 분석은 사전 임상 동물 모델에서 소설 항 염증성 치료의 가능성을 평가하는데 유용합니다. 예를 들어, 뇌 혈관 침투를 방지하고 심한 말라리아와 관련된 질병의 증상을 완화 할 수있는 CXCR3 케모카인 IFN-γ-inducible 단백질 10 (IP-10)에 대한 단클론 항체의 용량이 성공적으로이를 사용하여 입증되었습니다방법 11.
이 방법은있을 수있는 하나의 한계는 한 사람 뇌에서 발견 세포의 총 수는 항체 stainings 한 세트에 대해 일반적으로 충분 것입니다. 이상 4-6 셀 마커 분석에 필요한 경우 별도의 실험 따라서이 필요 될 수 있습니다. 일반적으로 절차는 수행하기에 용이합니다. 일부 초기 교육을 필요로 할 수있는 유일한 단계는 intracardial 재관류입니다. 잠재적 인 문제를 극복하는 데 유용 할 수있는 몇 가지 힌트는 표 1에 나열되어 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원을 위해 양을 리아나 Mackiewicz 감사드립니다. 이 작품은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 및 호주 정부 국립 보건 의학 연구위원회 IRIISS 및 프로젝트 기금 1,031,212을 통해 가능하게되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
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