Summary
En metode for isolering av adherente inflammatoriske leukocytter fra hjernen blodkarene
Abstract
Vi beskriver en fremgangsmåte for isolering og karakterisering av adherente inflammatoriske celler fra hjernen blodkar av P. Berghei ANKA-infiserte mus. Infeksjon av mottakelige mus-stammer med denne parasitten belastning fører til induksjon av eksperimentelle cerebral malaria, en nevrologisk syndrom som rekapitulerer visse viktige aspekter av Plasmodium falciparum-mediert alvorlig malaria hos mennesker 1,2. Modne former av blod-trinns malaria uttrykker parasittiske proteiner på overflaten av infiserte erytrocytt, som tillater dem å binde til vaskulære endotelceller. Denne prosessen induserer hindringer i blodstrømmen, noe som resulterer i hypoksi og blødninger 3 og også stimulerer til rekruttering av inflammatoriske leukocytter til området av parasitten håndtering.
I motsetning til andre infeksjoner, dvs. neutrotopic virus 4-6, begge malaria-parasitized røde blodceller (PRBC) samt tilhørende inflammatory leukocytter forblir sequestered i blodkar enn infiltrere hjernen parenchyma. Dermed å unngå forurensning av sequestered leukocytter med ikke-inflammatoriske sirkulerende celler, omfattende intracardial perfusjon av infiserte-mus før organ utvinning og vev behandling er nødvendig i denne prosedyren for å fjerne blod kupé. Etter perfusjon blir hjerner høstes og dissekert i små biter. Vevet strukturen er ytterligere forstyrret ved enzymatisk behandling med kollagenase D og DNAse I. Det resulterende hjerne Homogenatet deretter sentrifugert på en Percoll gradient som tillater separasjon av hjerne-sequestered leukocytter (BSL) fra myelin og andre vev rusk. Isolerte celler vaskes deretter, telles ved hjelp av en hemocytometer og farget med fluorescerende antistoffer for etterfølgende analyse ved strømningscytometri.
Denne prosedyren gir omfattende fenotypisk karakterisering av inflammatoriske leukocytter migrere til hjernen i reutvikling som svar på ulike stimuli, inkludert slag, så vel som virale eller parasittiske infeksjoner. Metoden gir også et nyttig verktøy for vurdering av nye anti-inflammatorisk behandling i pre-kliniske dyremodeller.
Protocol
1. Infeksjon av mus med P. berghei-ANKA
- Defrost en delmengde av fryses ned P. berghei ANKA PRBC.
- Beherske et cerebral malaria-resistant BALB / c donor mus (8-12 uker gamle) med to-hånds tilbakeholdenhet teknikk. Injisere mus med 100-200 ul PRBC med en 1 ml insulinsprøyte (28g p). Rutinemessig, er 1-2 donor mus injisert.
- På dager 4-5 etter infeksjon (pi) fjerne donor mus fra bur og legg den på en arbeidsstasjon eller en engangs arbeider pad.
- Forsiktig begrense musen ved utgangen av halen og ved hjelp av små saks kutte haletipp (ca. 1 mm). Alternativt kan en liten hale punktering bruke en 25 G nål utføres.
- Plasser en dråpe blod fra musens halevenen nær slutten av en frostet-end objektglass.
- Sett en annen lysbilde (spreder) på en 45 ° vinkel og sikkerhetskopiere det inn i dråpe blod. Når blodet spres langs kanten, trykk sprederen-slide evenly over objektglass å gjøre blodutstryk. La smøre lufttørke.
- Fix blod utstryk i 100% metanol i 30 sek og deretter flekken lysbilder i nylagde Giemsa i 10 min.
- Skyll blodutstryk med rennende vann i 1 min, la lufttørke og undersøke lysbilde under mikroskop (100x, olje nedsenking). Nummerere PRBC innen 1000 erytrocytter og beregne prosent parasitemia. Donor mus bør nå parasitemia nivåer mellom 2,5-5% før de kan blødde for smitte av forsøksdyr.
- Samle blod fra donor mus ved retro-orbital blødning ved hjelp av en heparinisert mikro-hematokrit kapillarrør. Alle eksperimenter utføres i samsvar med The Walter & Eliza Hall Institute dyreetikk komité krav. Avhengig av lokale Animal Hydraulikk komité andre krav blødning prosedyrer kan brukes. Oppløs nødvendige mengden blod i RPMI medium ved en endelig konsentrasjon på 1X10 6 pRBC/0.2 ml. Tenk aten normal mus hematokritt er ~ 6x10 9 røde blodlegemer / 1 ml.
- Infisere eksperimentell C57BL / 6 mus (8-12 uker gamle) ved å injisere intraperitonealt (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
- Å overvåke parasitemia nivåer av infiserte mus følger trinnene 01.03 til 01.08. Parasitemia bør bestemmes hver 2-3 dager med start på dag 2 eller 3 pi
- Utvikling av alvorlig malaria i C57BL / 6 mus kanskje manifest som krum utseende, Ruffed pels og lav aktivitet. Noen mus kan komme på dette stadiet, men progresjon til tap av selv-refleks indikerer irreversibel sykdom og dyr må avlives.
2. Intracardial Perfusjon av Mus og Brain Extraction
- Montere en manuell tyngdekraften perfusjon systemet ved å sikre en 500 ml reservoar til en kolonne innehaveren festet til toppen av en 60 cm kolonne stativ. Koble plastrør til bunnenden av reservoaret og fest et tubing klammer for å kontrollere buffer flyt. Fest slangen til en 23 G kanyle. Fill opp reservoaret med PBS (holdt ved 22 ° C), åpne klemme og tillate buffer å kjøre gjennom slangen for å fjerne alle luftbobler.
- Avlive P. berghei ANKA-infiserte mus med CO 2 innånding. Bekreft døden ved fravær av pedalen, orbital og respiratorisk respons.
- Pin avlives musen ved bakbeina og forbeina dorsally på en styrofoam disseksjon bord finnes i et plastbrett. Avhengig av lokale Animal Ethic Committee krav anestesi kan gis før oppstart av intracardial pefusion.
- Tørk ventrale side med 70% etanol.
- Bruk store saks og pinsett for å åpne huden langs midtlinjen for å avsløre brysthula. Brett og pin hud til sidene.
- Hold sternum med fine pinsett og kutte mellomgulvet og langs begge sider av sternum severing ribbeina. Pass på å ikke skade noen store blodkar.
- Pin brystkassen ved sternum løst ved siden av hodet.
- Hold ventricles viddh fin pinsett og forsiktig incise rett atrium med fine saks.
- Sett 23G nål festet til tyngdekraften perfusjon systemet inn venstre hjertekammer mot stigende aorta mens PBS kjører. Sett kun 0,5 cm av nålespissen.
- Perfuse musen for 5 min eller til avløpsvannet er klart.
- Løsne mus og legge den på magen sin. Tørk hodet med 70% etanol.
- Bruk av store saks, et snitt like over cervical ryggmargen området.
- Bruke fine saks for å lage en median caudal-rostral kutt starter på bunnen av hodeskallen og skrelle huden vekk for å avsløre skallen.
- Holde hodet, plasserer bladene av en liten saks i hver orbital hulrom og foreta et kutt mellom banene.
- Lage en langsgående kutt langs sagittal sutur og nøye skrelle skallen på hver hjernehalvdel utover.
- Bruk en slikkepott, forsiktig løfte hjernen og plassere den i en 10 ml sentrifugerør inneholder RPMI medium.
3. Isolering av Brain-sequestered Leukocytter (BSL)
- Arbeider i en sikkerhetskabinett, sted nyhøstet hjernen på toppen av en rustfritt stål celle silen (40-60 mesh størrelse) i en petriskål inneholdende 3-5 ml RPMI vevskulturmedium.
- Skjær hjernevev i små biter.
- Push små biter av hjernevev gjennom cellen ved hjelp av en sil krystall stempelholderen.
- Overføre hjernen homogenat i et 10 ml rør og sentrifuger ved 250 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Oppløs pellet i 3 ml RPMI medium inneholdende 0,05% kollagenase D og 2U/ml DNAse I.
- Roter blandingen i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern celleavfall ved å skyve blandingen gjennom en 70 um nylon celle sil og / eller ved inkubering på is i 5 min.
- Lay hjernen homogenat på en 7 ml 30% Percoll pute og sentrifuger ved 400 xg (ingen bremser) i 20 min ved romtemperatur.
- Gjensuspender pellet i 1 ml røde blodlegemer lyseringsbuffer og inkuber på is i 5 min tilLyse tilhenger PRBC, som ikke kunne fjernes fra hjernen ved intracardial perfusjon.
- Legg 9 ml RPMI medium, vaske celler og sentrifuger ved 250 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Gjensuspender BSL-holdig pellet i 50-100 ul RPMI medium og overføre celler til en Eppendorf tube.
- Fortynn en 5-10 pl alikvot av cellen prøven 1:2 i Trypan blå for identifisering av levedyktige celler.
- Tell levedyktige celler under mikroskopet ved hjelp av en hemocytometer. Fra 6 dagers pi utover, da P. Berghei ANKA-infiserte mus viser nevrologiske utfall, 20,000-100,000 BSLs kan gjenopprettes.
4. Immunfenotyping av BSL ved Multicolour flowcytometri
- Sentrifuger cellene ved 250 xg i 10 min ved 4 ° C, aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 50 pl av flekker buffer (PBS, 1% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM EDTA).
- Tilsett 1 pl av renset anti-CD16/32 antistoff (Fcblock).
- Inkuber celler for 10 min på isen.
- Vask cellene med 1 ml Staining Buffer. Sentrifuger cellene ved 250 xg i 10 min ved 4 ° C og aspirere supernatanten.
- Resuspender celler i 50 pl buffer inneholdende Staining forhåndsbestemt optimale fortynninger av nødvendige fluorescerende antistoffer, dvs. anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR-og anti-NK1.1.
- Inkuber i 1 time på is.
- Vask cellene med 1 ml Staining Buffer. Sentrifuger cellene ved 250 xg i 10 min ved 4 ° C og aspirere supernatanten.
- Resuspender celler i 100 ul PBS.
- Overføre celler til en strømningscytometri plastrør.
- Ved hjelp av en flowcytometer, erverve minst 5,000-10,000 hendelser. Passende unstained celle kontroller og fluorokrom kompensasjon prøver skal inngå som nødvendig.
- Analysere resultatene ved hjelp av passende flowcytometri programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene i fig. 2 viser prosenter og absolutte tall av ulike BSL populasjoner utvinnes fra hjernen til perfused eller unperfused malaria-smittede og naive kontroll mus. Isolert BSL ble farget med PE-anti-NK1.1 og APC-anti-TCR-β antistoffer som angitt i protokollen teksten. I samsvar med tidligere funn 7-9 omfattet αβTCR + T-celler en høy andel av den BSL bassenget i hjernen perfusert malaria-infiserte mus (dag 6 pi). Denne populasjonen som syntes å være signifikant underrepresentert i hjerner av ikke-perfunderte dyr (fig. 2A-B). Den tilsynelatende reduksjon av T-celle-frekvenser i ikke-perfunderte hjerner ble assosiert med en betydelig høyere prosentandel og totalt antall doble negative celler (αβTCR - NK1.1 -) i disse dyrene (fig. 2A-B). Høy andel og tall på doble negative celler i unperfused hjerner var ikke bare oppdaget i malaria-infiserte mus, men også i na & iuml, ve kontroller, noe som tyder på at disse cellene er ikke-inflammatoriske leukocytter stede i hjernen blodkar som er gjenvunnet sammen med inflammatoriske celler hvis intracardial perfusjon ikke er utført.
To ytterligere eksempler på BSL analysen er vist i fig. 3 og fig. 4. Kort, ble C57BL / 6 mus infisert med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Timelige assosiasjoner mellom leukocytt rekruttering til hjernen og utbruddet av nevrologiske symptomer (mellom dager 6-8 pi) er påvist i P. berghei ANKA smittet mus 7-9. I dette spesielle eksempel ble malaria-infiserte mus avlives på dag 6 pi, og BSL ble renset som beskrevet i protokollen teksten. Isolert BSL ble farget med PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 og PerCPCy5.5-anti-CD8α antistoffer. Prøvene ble kjøpt ved hjelp av en BD Biosciences FACSCalibur flowcytometer og analysen gjøres ved hjelp av beltebil 3.0.1-programvaren. ViaBLE celler var gated av fremover og side scatter. Prosenter av NK-celler, T-lymfocytter og NKT celler (NK1.1 + TCR + celler) trukket i hjernen naive og malaria-infisert mus (dag 6 pi) er angitt i de beste panelene (Fig. 3A). De nederste panelene viser prosenter av CD4 + og CD8 + T-lymfocytter blant gated NK1.1 - αβTCR + celler (fig. 3A). Fig. 3B viser et eksempel der absolutte tall av CD4 + og CD8 + hjerne-sequestered T celler ble beregnet på dag 6 pi med P. berghei ANKA. Generelt, kan 20,000-100,000 BSL utvinnes fra hjernen til P. Berghei Anka infiserte mus. Flere faktorer som tid pi kan mottakelighet av musen belastning eller inkludering av anti-inflammatoriske behandlinger påvirke celle utvinning. Rutinemessig, gir en individuell hjernen nok celler for 1 sett av antistoff stainings.
I eksemplet gitt i Fig. 4 av kjemokinreseptor bruk av hjerne-sequestered T-lymfocytter ble analysert. Mus ble infisert med P. berghei ANKA og BSL ble isolert på dag 6 pi Celler ble farget med APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 og biotinylert-anti-CCR5 antistoff, etterfulgt av inkubasjon med et streptavidin-PerCPCy5.5 konjugat. Prøvene ble kjøpt og analyseres i henhold fig. 3. Histogrammene representerer prosenter av αβTCR +-celler blant totalt BSL i malaria-smittede og naivt kontroll mus. Konturen tomter i midtre og nedre panelene viser prosenter av CXCR3 + og CCR5 + celler innenfor gated αβTCR + celler.
Figur 1. Flytskjema av prosedyren for isolasjon og analyse av BSLfra P. Berghei ANKA-infiserte mus. (1) En cryopreseved alikvot av P. berghei ANKA PRBC er tint og 1 eller 2 donor mus er smittet. (2) Fire dager senere parsitemia nivåer av donor mus beregnet, donor mus er bløgget og blod fortynninger forberedt for smitte av eksperimentelle mus. En malaria er deretter satt opp i alvorlig malaria-utsatte C57BL / 6 mus. (3) På dag 5-7 pi, er mus avlives etter CO 2 innånding og umiddelbart intracardially perfused å fjerne alle sirkulerende ikke-adherente celler. (4) Hjerner blir deretter høstet og en hjerne homogenat fremstilt ved fordøyelse av vevet med kollagenase D og DNAse I. BSL blir deretter skilt fra myelin og celleavfall ved en Percoll gradient. (5) presipiterte BSL vaskes deretter, telles ved hjelp av en hemocytometer, farget med fluorescerende antistoffer og analysert ved strømningscytometri.
Figur 2. BSL analyse i hjernen perfused eller unperfused mus. C57BL / 6 mus ble smittet med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hjernene ble høstet på dag 6 pi fra perfused eller unperfused dyr. BSL ble isolert, farget med anti-NK1.1 og anti-TCR fluorescerende antistoffer og analysert ved strømningscytometri. (A) Prikkplott skildre prosenter av NK-celler, T-lymfocytter, NK1.1 + TCR + celler og doble negative celler NK1.1 - TCR - i perfusjon (toppaneler) eller unperfused (paneler bunn) malaria-smittede og naive kontroll mus . (B) Den absolutte antall doble negative celler og T-lymfocytter og ble beregnet på dag 6 pi med P. berghei ANKA og naive kontroll mus. Hver bar represeNTS gjennomsnittet av 3 prøver ± SEM, * p> 0,05.
Figur 3. NK-celler og T-lymfocytter kan påvises i hjerner av P. Berghei Anka infiserte mus. C57BL / 6 mus ble smittet med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hjernene ble hentet på dag 6 pi etter perfusjon av euthanized dyr. BSL ble isolert, farget med anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 og anti-CD8-fluorescerende antistoffer og analysert ved strømningscytometri. (A) Top paneler skildre prosenter av NK-celler, T-lymfocytter og NK1.1 + TCR + celler i malaria-smittede og naive kontroll mus. Bottom paneler illustrere prosenter av CD4 + og CD8 + T celler innenfor gated αβTCR + NK1.1 - (B) Den absolutte antallet hjerne-sequestered CD4 + og CD8 + T-celler ble beregnet på dag 6 pi med P. berghei ANKA og naive kontroll mus. Hver stolpe representerer gjennomsnittet av 3 prøver ± SEM.
Figur 4. Flertallet av T-lymfocytter migrere til hjernen som svar til alvorlig malaria infeksjon uttrykke kjemokinreseptor CXCR3. C57BL / 6 mus ble smittet med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hjernene ble hentet på dag 6 pi etter omfattende perfusjon av euthanized dyr. BSL ble isolert, farget med anti-TCR, anti-CXCR3 og anti-CCR5 antistoff og analysert ved strømningscytometri. Toppaneler skildre prosenter av αβT lymfocytter i malaria-smittede og naive kontroll mus. Konturen plott illustrerer prosenter av CXCR3 + (midterste paneler) og CCR5 + (nederst panel) celler i gated αβTCR + lymfocytter.
| Problem | Feilsøking |
| Ufullstendig perfusjon |
|
| Ikke nok BSL gjenvunnet |
|
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering og analyse av BSL er en metode som tillater karakterisering og kvantifisering av betennelsesceller migrere til hjernen i respons til vevsskade eller infeksjon i eksperimentelle musemodeller. Innføringen av en intracardial perfusjon steg for fjerning av blod kupé før orgel utvinning og påfølgende celleisolasjon er nyttig for å hindre kontaminering av inflammatoriske celler med ikke-inflammatoriske sirkulerende leukocytter. Dette kan ikke være et viktig krav i neurotropisk infeksjoner som murint encefalomyelitt virus som betennelsesceller trenge gjennom hjernen parenchyma 5, men er særlig relevant i gnager malaria, der infiserte erytrocytter og inflammatoriske leukocytter forblir sequestered i blodkar enn infiltrere hjernevev . Følgelig bør intracardial perfusjon av malaria-infiserte mus ikke bare anbefales for analyse av BSL, men kan også være nyttig forvurdering av parasitt-vev håndtering 10,11. Som ligner ikke-inflammatoriske sirkulerende leukocytter, umodne former for malariaparasitter ikke klarer å følge det vaskulære endotel og bør fjernes ved perfusjon prosedyren. I kontrast, tilhenger PRBC (modne schizonter) ser ut til å holde seg innenfor hjernen blodkar. P. Berghei Anka transgene parasitter uttrykker luciferase er generert 12 og er en verdifull ressurs for denne type analyse. Etter infeksjon med luciferase-uttrykkende linjer, kan parasitt vev-håndtering bestemmes ved avbildning av perfusert hjerner fra infiserte dyr med et IVIS system 10,11. En direkte sammenligning av parasitt-håndtering på dag 6-7 pi i hjernen hos perfused dyr og hjernen til mus infisert med scene-spesifikke reporter parasitter (dvs. uttrykke luciferase bare under schizont scenen) vil være nyttig for videre validering av denne metoden.
Enviktig ulempe av tradisjonelle histologiske metoder for analyse av vev-infiltrere celler er at disse teknikkene ikke mulig å vurdere cellepopulasjoner som krever anerkjennelse av mer enn én celle markør for identifikasjon deres (dvs. NK1.1 + αβTCR + CD1d-restricted NKT eller CD4 + Foxp3 + T regulatoriske celler). I motsetning til histologi, er flowcytometrisk analyse av inflammatoriske leukocytter mottagelig for flere antistoff stainings, som gir et svært nyttig verktøy for omfattende fenotypisk karakterisering av mobilnettet infiltrater 7,9,13. I tillegg, er denne metoden følsom nok til å detektere cellepopulasjoner opptrer med en frekvens så lav som 1-3% av den totale intravaskulære infiltrere, herunder ikke bare endogene men også adoptively overførte celler samt antigen spesifikke T-celler. P. Berghei Anka transgene parasitter uttrykker MHC I og MHC II-restricted epitoper fra OVA 14 + CD8 + T-celler fra OT-I mus kunne påvises blant BSL av Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG-infiserte mus, og gir bevis for at T-cellene migrerer inflammatoriske til hjernen i respons på malaria er parasitt-spesifikke 14.
Analysen av BSL er også nyttig for å vurdere potensialet av nye anti-inflammatoriske behandlinger i pre-kliniske dyremodeller. For eksempel, har kapasiteten av monoklonale antistoffer mot CXCR3 chemokine IFN-γ-induserbar protein 10 (IP-10) for å hindre hjernen intravaskulær infiltrasjon og lindre sykdomssymptomer forbundet med alvorlig malaria blitt demonstrert ved hjelp av dennemetode 11.
En begrensning at denne metoden kan ha er at det totale antall av celler utvinnes fra en individuell hjernen er vanligvis nok for ett sett av antistoff stainings. Således separate eksperimenter kan være nødvendig dersom mer enn 4-6 celle markører kreves for analysen. Generelt, er prosedyren enkel å utføre. Den eneste skritt som kan kreve noen innledende trening er den intracardial perfusjon. Noen tips som kan være nyttige for å overvinne eventuelle problemer blir listet opp i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Miss Liana Mackiewicz for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom viktoriansk delstatsmyndighetene Operasjonell Infrastruktur Support og australske regjeringen National Health and Medical Research Council IRIISS og Project Grant 1031212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
