Summary
Um método para o isolamento de leucócitos aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos do cérebro
Abstract
Descreve-se um método para o isolamento e caracterização de células aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos cerebrais de P. berghei ANKA camundongos infectados. Infecção de estirpes de ratinho-sensíveis com estes resultados de deformação parasita na indução da malária cerebral experimental, uma síndrome neurológica que recapitula certos aspectos importantes da malária Plasmodium falciparum mediada grave em seres humanos 1,2. Formas maduras de sangue fase-malária expressar proteínas parasitas sobre a superfície dos eritrócitos infectados, o que lhes permite ligar-se a células endoteliais vasculares. Este processo induz a obstrução do fluxo sanguíneo, resultando em hipóxia e hemorragias 3 e também estimula o recrutamento de leucócitos inflamatórios para o local de fixação do parasita.
Ao contrário de outras infecções, isto é, os vírus neutrotopic 4-6, ambos os malária parasitados glóbulos vermelhos (CGV), bem como associado Inflammleucócitos Atory permanecem sequestrados no interior dos vasos sanguíneos, em vez de se infiltrar no parênquima cerebral. Assim, para evitar a contaminação dos leucócitos sequestrados com não-inflamatórios de células circulantes, perfusão intracardíaca extensa de camundongos infectados-antes da extracção e processamento de tecidos de órgãos é necessária neste procedimento para remover o compartimento do sangue. Após a perfusão, os cérebros são colhidas e dissecado em pequenos pedaços. A estrutura de tecido é adicionalmente interrompido por tratamento enzimático com colagenase D e I. DNAse O homogenato de cérebro resultante é então centrifugado num gradiente de Percoll, que permite a separação de cérebro-sequestradas leucócitos (BSL) de mielina e detritos de outro tecido. As células isoladas são então lavadas, contadas utilizando um hemocitómetro e coradas com anticorpos fluorescentes para posterior análise por citometria de fluxo.
Este procedimento permite a caracterização fenotípica abrangente de leucócitos inflamatórios migrar para o cérebro em response a vários estímulos, incluindo acidente vascular cerebral, bem como infecções virais ou parasitárias. O método também proporciona um instrumento útil para a avaliação de novos tratamentos anti-inflamatórias em modelos pré-clínicos com animais.
Protocol
1. Infecção de camundongos com P. berghei ANKA-
- Descongelação uma alíquota de P. criopreservado berghei ANKA CHA.
- Conter um cerebral malária resistente rato BALB / c dador (8-12 semanas de idade), utilizando a técnica de retenção de duas mãos. Injectar mouse com 100-200 ul de concentrado de hemácias utilizando uma seringa de insulina 1 ml (28G agulha). Rotineiramente, 1-2 camundongos doadores são injetados.
- Em 4-5 dias pós-infecção (pi) remover camundongo doador de gaiola e coloque-o em uma estação de trabalho ou uma almofada descartável de trabalho.
- Suavemente conter rato pela extremidade da cauda e usando uma tesoura pequena corte da ponta da cauda (cerca de 1 mm). Alternativamente, uma pequena cauda punção utilizando uma agulha de 25 G pode ser realizada.
- Colocar uma gota de sangue a partir da veia da cauda do rato, perto da extremidade de uma lâmina de microscópio fosco end.
- Coloque uma segunda corrediça (espalhador) num ângulo de 45 ° e guardá-lo para a gota de sangue. Quando o sangue se espalha ao longo da borda, empurre o véspera spreader slide-omente através da lâmina de microscópio para fazer o exame de sangue. Permitir o esfregaço secar ao ar.
- Fix esfregaços de sangue em metanol a 100% durante 30 segundos e, em seguida, as lâminas em mancha de Giemsa preparada de fresco durante 10 min.
- Enxaguar esfregaço de sangue com água corrente durante 1 minuto, deixa-se secar ao ar e examinar lâmina sob o microscópio (100x imersão em óleo). Enumerar CHA dentro 1.000 eritrócitos e calcular parasitemia por cento. Ratinhos dadores devem atingir níveis de parasitemia entre 2,5-5% antes de serem sangrados para a infecção de animais de experiência.
- Recolher o sangue do rato doador por sangramento retro-orbital com um tubo de micro-hematócrito capilar heparinizado. Todos os experimentos são realizados em conformidade com o Walter & Eliza Hall Institute animal, as exigências do Comitê de Ética. Dependendo locais animal, as exigências do Comitê de Ética procedimentos sangramento outros possam ser usados. Dissolver a quantidade necessária de sangue em meio RPMI a uma concentração final de 1x10 ml 6 pRBC/0.2. Considere queum hematócrito normal de murganho é ~ 6x10 9 células vermelhas do sangue / 1 ml.
- Infect C57BL experimental / 6 machos (8-12 semanas de idade) por injecção intraperitoneal (ip) 1x10 6 ml pRBC/0.2.
- Para monitorar os níveis de parasitemia de camundongos infectados siga os passos de 1,3-1,8. Parasitemia deve ser determinada em cada 2-3 dias, começando no dia 2 ou 3 pi
- O início da malária grave em camundongos C57BL / 6 pode se manifestar como a aparência corcunda, ruffed pele e baixa atividade. Alguns ratos podem se recuperar nesta fase, mas a progressão para a perda de auto-alinhamento reflexo indica doença irreversível e os animais devem ser sacrificados.
2. Perfusão intracardíaca de Ratos e Extração Cérebro
- Montar um sistema de perfusão manual de gravidade pela obtenção de um reservatório de 500 ml, a um suporte de coluna ligada à parte superior de um suporte de coluna de 60 cm. Conectar tubos de plástico para a extremidade inferior do reservatório e fixar o grampo de tubo para controlar o fluxo de tampão. Anexar tubo a uma agulha G 23. Fill-se o reservatório com PBS (mantida a 22 ° C), abrir e permitir apertar tampão para ser executado através do tubo para remover todas as bolhas de ar.
- Euthanize P. berghei ANKA rato infectado por inalação de CO 2. Confirmar a morte pela ausência de pedal, orbital e as respostas respiratórias.
- Pin do mouse sacrificados pelas patas traseiras e frente dorsal em uma placa de isopor dissecção contida em uma bandeja de plástico. Dependendo locais de Ética Comitê de anestesia animal requisitos podem ser administrados antes de início pefusion intracardíaca.
- Wipe lado ventral com etanol a 70%.
- Use uma tesoura grande e pinças para abrir pele ao longo da linha média para expor a cavidade torácica. Dobras cutâneas e pino para os lados.
- Segure o esterno com uma pinça fina e cortar o diafragma e ao longo de ambos os lados do esterno cortando as costelas. Tome cuidado para não danificar os grandes vasos sanguíneos.
- Pin da caixa torácica pelo esterno frouxamente ao lado da cabeça.
- Segure sagacidade ventrículosfórceps h finos e cuidadosamente inciso átrio direito com tesoura fina.
- Inserir a agulha 23G ligado a sistema de perfusão gravidade em ventrículo esquerdo para a aorta ascendente, enquanto PBS está em execução. Inserir apenas 0,5 cm da ponta da agulha.
- Perfundir rato por 5 minutos ou até o efluente é clara.
- Desafixar mouse e colocá-lo em seu abdômen. Limpe a cabeça com etanol 70%.
- Com uma tesoura de grande porte, fazer um corte logo acima da área da medula espinhal cervical.
- Use uma tesoura fina para fazer um corte caudo-rostral mediana começando na base do crânio e casca da pele para expor o crânio.
- Segurando a cabeça, colocar as lâminas de uma tesoura pequena em cada cavidade orbital e fazer um corte entre as órbitas.
- Faça um corte longitudinal ao longo da sutura sagital e cuidadosamente descascar o crânio em cada hemisfério cerebral para fora.
- Usando uma espátula, levantar suavemente o cérebro e colocá-lo dentro de um tubo de centrífuga de 10 ml contendo meio RPMI.
3. Isolamento de Brain-sequestradas Leucócitos (BSL)
- Trabalhando numa câmara de segurança, lugar recentemente colhido cérebro em cima de uma peneira de aço inoxidável de células (40-60 malhas) em uma placa de Petri contendo 3-5 ml de meio de cultura RPMI tecido.
- Corte o tecido cerebral em pedaços pequenos.
- Empurrar pequenos fragmentos de tecido do cérebro de células através do filtro utilizando um êmbolo de cristal.
- Transferir homogenato de cérebro de um tubo de 10 ml e centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Dissolver sedimento em 3 ml de meio RPMI, contendo 0,05% de colagenase D e 2U/ml DNAse I.
- Girar mistura durante 30 min à temperatura ambiente. Remover os detritos celulares, empurrando-se a mistura através de um filtro de 70 | iM de células de nylon e / ou através de incubação em gelo durante 5 min.
- Lay homogenato de cérebro em uma almofada de 7 ml de Percoll a 30% e centrifuga-se a 400 xg (sem travões) durante 20 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lise de sangue vermelho de células e incubado em gelo durante 5 min alisar CHA aderente, a qual não pode ser removido a partir do cérebro por perfusão intracardíaca.
- Adicionar 9 ml de meio RPMI, lavar e centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Ressuspender o pellet contendo BSL em 50-100 ul de meio RPMI e transferir as células para um tubo de Eppendorf.
- Diluir uma alíquota de 5-10 uL da amostra de células 1:2 em azul de tripano para a identificação de células viáveis.
- Contar as células viáveis no microscópio utilizando um hemocitómetro. A partir de dia 6 pi, quando P. berghei ANKA camundongos infectados exibem sinais neurológicos, 20,000-100,000 BSLs pode ser recuperado.
4. Imunofenotipagem de BSL por citometria de fluxo Multicolour
- Centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul de tampão de coloração (PBS, 1% de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de EDTA).
- Adicionar a ul de uma purificado anti-CD16/32 anticorpo (Fcblock).
- Incubar as células durante 10 min em gelo.
- Lavar as células com 1 ml de Tampão de Coloração. Centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 50 ul de tampão de coloração contendo pré-determinadas diluições óptimas de anticorpos fluorescentes necessários, isto é, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR e anti-NK1.1.
- Incubar por 1 hora no gelo.
- Lavar as células com 1 ml de Tampão de Coloração. Centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 ul de PBS.
- Transferir as células para um tubo de plástico de citometria de fluxo.
- Utilizando um citómetro de fluxo, adquirir pelo menos 5.000-10.000 eventos. Apropriados controlos de células não coradas e amostras de compensação fluorocromo devem ser incluídos, conforme necessário.
- Analisar os resultados usando o software apropriado citometria de fluxo.
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Representative Results
Os resultados na Fig. 2 percentagens de shows e números absolutos de diferentes populações BSL recuperados de cérebros de ratos perfundidos ou não perfundidada controle de infectados com malária e ingênua. BSL isolado foram coradas com PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR-β anticorpos, tal como indicado no texto Protocolo. Consistente com resultados anteriores 7-9, as células T αβTCR + compreendia uma elevada proporção da piscina BSL perfundidos em cérebros de ratos infectados com malária (dia 6 pi). Esta população parecia ser significativamente sub-representados no cérebro dos animais não-perfundidos (Fig. 2A-B). A aparente redução das frequências de células T no cérebro não perfundidos foi associado com uma percentagem consideravelmente mais elevada e o número total de células negativas duplas (αβTCR - NK1.1 -) nestes animais (Fig. 2A-B). Alta porcentagem e números em duplas células negativas no cérebro não perfundidada não foram detectadas apenas na malária camundongos infectados, mas também em nd e iuml; controlos ve, o que sugere que estas células não são os leucócitos inflamatórios presentes em vasos sanguíneos do cérebro que são recuperados juntamente com as células inflamatórias se a perfusão intracardíaca não é realizada.
Dois outros exemplos de análise BSL são mostrados na Fig. 3 e fig. 4. Resumidamente, ratinhos C57BL / 6 foram infectados com P. berghei ANKA (1x10 6 CHA). Associações temporais entre o recrutamento de leucócitos para o cérebro e o aparecimento de sintomas neurológicos (entre os dias 6-8 pi) foram demonstradas em P. berghei ANKA infectados ratinhos 7-9. Neste exemplo em particular, a malária infectados ratinhos foram sacrificados no dia 6 pi eo BSL foram purificadas como descrito no texto de protocolo. BSL isolado foram coradas com PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 e anti-PerCPCy5.5-CD8a anticorpos. As amostras foram obtidas utilizando uma BD Biosciences citômetro de fluxo FACSCalibur ea análise realizada utilizando Weasel software 3.0.1. Viaveis células foram fechado por frente e dispersão lateral. As percentagens de células NK e linfócitos T e células NK (NK1.1 + TCR + células) sequestrado no cérebro de ratinhos naive e malária infectado (dia 6 pi) estão indicados nos painéis de topo (Fig. 3A). Os painéis inferiores mostram percentagens de CD4 + e linfócitos T CD8 +, entre NK1.1 gated - αβTCR + células (Fig. 3A). Fig. 3B mostra um exemplo no qual os números absolutos de células CD4 + e CD8 + T-brain sequestrados foram calculados no dia 6 pi com P. berghei ANKA. Em geral, 20,000-100,000 BSL podem ser recuperados a partir de cérebros de P. ratinhos berghei ANKA infectadas. Vários fatores, tais como pi tempo, a susceptibilidade da cepa mouse ou inclusão de tratamentos anti-inflamatórios podem influenciar a recuperação celular. Rotineiramente, um cérebro individual fornece células suficientes para um conjunto de colorações de anticorpos.
No exemplo fornecido na Fig. 4, a utilização do receptor de quimiocina de linfócitos T-brain sequestrados foi analisada. Os ratinhos foram infectados com P. berghei ANKA e BSL foram isolados no dia 6 Células pi foram coradas com anti-APC-TCR β-, PE-anti-CXCR3 e biotinilado anti-CCR5 anticorpos, seguido de incubação com um conjugado de estreptavidina-PerCPCy5.5. As amostras foram adquiridos e analisados de acordo com fig. 3. Os histogramas representam percentagens de células + αβTCR entre BSL total em camundongos de controle da malária infectadas e ingênua. As curvas de nível no meio e painéis de fundo mostram as porcentagens de CXCR3 + e CCR5 + células dentro αβTCR fechado + células.
Fluxograma Figura 1. Do procedimento para o isolamento e análise de BSLa partir de P. berghei ANKA camundongos infectados. (1) Uma alíquota de P. cryopreseved berghei ANKA CHA é descongelado e 1 ou 2 ratinhos dadores estão infectados. (2) os níveis de Quatro dias mais tarde parsitemia de ratinhos dadores são calculados, ratinhos dadores são sangrados e as diluições de sangue preparados por infecção de ratinhos experimentais. A infecção por malária é então criada em C57BL malária suscetíveis grave / 6 ratos. (3) Nos dias pi 5-7, os ratinhos foram sacrificados por inalação de CO2 e imediatamente perfundidos intracardially para remover todos os que circulam as células não aderentes. (4) Os cérebros são então colhidos e um homogeneizado de cérebro preparados por digestão do tecido com colagenase D e I. DNAse BSL são então separados de mielina e os detritos celulares por um gradiente de Percoll. (5) precipitado BSL são então lavadas, contadas utilizando um hemocitómetro, coradas com anticorpos fluorescentes e analisadas por citometria de fluxo.
Figura 2. Análise BSL em cérebros de ratos perfundidos ou não perfundidada. Murganhos C57BL / 6 foram infectados com P. berghei ANKA (1x10 6 CHA). Cérebros foram colhidos em pi dia 6 de animais perfundidos ou não perfundidada. A BSL foram isolados, coradas com anticorpos anti-NK1.1 e anti-TCR fluorescente e analisadas por citometria de fluxo. (A) Os gráficos de pontos representam percentagens de células NK, linfócitos T, NK1.1 + TCR + células e duplas células negativas NK1.1 - TCR - em perfusão (painéis superiores) ou não perfundidada (painéis de fundo) ratos controle da malária infectadas e ingênua . (B) O número absoluto de células negativas duplas e linfócitos T, e foi calculado no dia 6 pi com P. berghei ANKA e camundongos de controle ingênuos. Cada barra de represents a média de 3 amostras ± SEM, * p <0,05.
A Figura 3 células. NK e linfócitos T pode ser detectado no cérebro de P. ratinhos berghei ANKA infectadas. Murganhos C57BL / 6 foram infectados com P. berghei ANKA (1x10 6 CHA). Cérebros foram extraídos em pi dia 6 após a perfusão dos animais sacrificados. A BSL foram isolados, corados com anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 e anti-CD8 anticorpos fluorescentes e analisadas por citometria de fluxo. (A) painéis Top retratam percentuais de células NK, linfócitos T e NK1.1 + TCR + células em camundongos infectados controle da malária e ingênua. Os painéis inferiores mostram percentagens de células T CD4 + e CD8 + T dentro αβTCR gated NK1.1 + - (B) O número absoluto de cérebro-sequestradas CD4 + e CD8 + foi calculado no dia 6 pi com P. berghei ANKA e camundongos de controle ingênuos. Cada barra representa a média de 3 amostras ± SEM.
Figura 4. A maioria dos linfócitos T migram para o cérebro, em resposta à infecção por malária grave expressam o receptor de quimiocina CXCR3. Murganhos C57BL / 6 foram infectados com P. berghei ANKA (1x10 6 CHA). Os cérebros foram extraídos em pi dia 6 após a perfusão extensiva dos animais sacrificados. A BSL foram isolados, corados com anti-TCR, anti-CXCR3 e anti-CCR5 anticorpos e analisados por citometria de fluxo. Os painéis superiores representam percentagens de αlinfócitos βT em camundongos infectados controle da malária e ingênua. Os gráficos de contorno ilustrar percentagens de CXCR3 + (painéis do meio) e CCR5 + (painel inferior), as células dentro de linfócitos + gated αβTCR.
| Problema | Solução de problemas |
| Perfusão incompleta |
|
| Não o suficiente BSL recuperado |
|
Tabela 1.
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Discussion
O isolamento e análise de BSL é um método que permite a caracterização e quantificação de células inflamatórias migram para o cérebro, em resposta a uma lesão tecidual ou infecção em modelos de ratos experimentais. A introdução de um passo de perfusão intracardíaca para a remoção do compartimento de sangue antes da extracção orgânica e o isolamento subsequente das células é útil para prevenir a contaminação de células inflamatórias com não-inflamatórios leucócitos circulantes. Isto pode não ser um requisito essencial em infecções neurotrópicas, tais como o vírus da encefalomielite murina em que as células inflamatórias penetram no parênquima cerebral 5, mas é especialmente relevante nos casos de malária de roedores, em que os eritrócitos e os leucócitos inflamatórios infectados permanecem sequestrados no interior dos vasos sanguíneos, em vez de se infiltrar o tecido cerebral . Por conseguinte, a perfusão intracardíaca de malária camundongos infectados não devem apenas ser recomendado para a análise de BSL, mas pode ser também útil para oavaliação do parasita tecido seqüestro 10,11. Semelhante a não-inflamatórias leucócitos circulantes, formas imaturas de parasitas da malária são incapazes de aderir ao endotélio vascular e devem ser removidos pelo procedimento de perfusão. Em contraste, CHA aderente (esquizontes maduros) parecem manter-se dentro dos vasos sanguíneos cerebrais. P. parasitas berghei ANKA transgénicos que expressam a luciferase foram gerados 12 e são um recurso valioso para este tipo de análise. Após a infecção com luciferase expressam linhas, parasita tecido-sequestração pode ser determinado por imagiologia de cérebros perfundidos a partir de animais infectados, utilizando um sistema IVIS 10,11. Uma comparação directa do parasita-sequestração nos dias 6-7 pi em cérebros de animais perfundidos e cérebros de ratos infectados com parasitas específicos do estágio repórter (ou seja, expressam luciferase apenas durante a fase esquizonte) seria útil para validação adicional deste método.
Umimportante desvantagem de abordagens tradicionais para análise histológica de tecido de células infiltrantes-se que estas técnicas não permitem a avaliação das populações de células que requerem o reconhecimento de mais do que um marcador de célula para a sua identificação (isto é, NK1.1 + + αβTCR CD1d-restricted NKT ou CD4 + Foxp3 + células T reguladoras). Ao contrário de histologia, a análise por citometria de fluxo de leucócitos inflamatórios é passível de múltiplas colorações de anticorpos, proporcionando uma ferramenta muito útil para a caracterização fenotípica abrangente de infiltrados celulares 7,9,13. Além disso, este método é suficientemente sensível para detectar a população de células que ocorrem a frequências tão baixo como 1-3% do total de infiltrar intravascular, incluindo não só endógenos, mas também as células transferidas adoptivamente, bem como células T específicas de antigénios. P. berghei ANKA parasitas transgénicos que expressam MHC I e MHC II-restritos epítopos de OVA 14 + células T CD8 + a partir de ratinhos OT-I pode ser detectada entre BSL de Ly5.2 + C57BL / 6 infectados PbTG ratos, fornecendo a evidência de que a migração de células T inflamatórias no cérebro em resposta à malária são parasita específico 14.
A análise de BSL também é útil para a avaliação do potencial de novos tratamentos anti-inflamatórias em modelos pré-clínicos com animais. Por exemplo, a capacidade dos anticorpos monoclonais contra o CXCR3 quimiocina proteína IFN-γ indutível-10 (IP-10) para evitar a infiltração do cérebro intravascular e aliviar os sintomas de doença associados com malária grave tem sido demonstrado com sucesso utilizando estaMétodo 11.
Uma limitação deste método que possa é que o número total de células recuperadas a partir de um cérebro individual é geralmente suficiente para um conjunto de marcações de anticorpos. Assim experiências separadas pode ser necessária se mais de 4-6 marcadores celulares são necessárias para a análise. Em geral, o procedimento é fácil de realizar. O único passo que pode exigir algum treinamento inicial é a perfusão intracardíaca. Algumas dicas que podem ser úteis para ultrapassar os problemas que estão listados na Tabela 1.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a senhorita Liana Mackiewicz para assistência técnica. Este trabalho foi possível graças vitoriana Estado de Infra-estrutura de Apoio Operacional e Governo australiano Governo Nacional de Saúde e Conselho de Pesquisa Médica IRIISS e Projeto Grant 1031212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
