Summary
Un método para el aislamiento de los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de los
Abstract
Se describe un método para el aislamiento y caracterización de células adherentes inflamatorias de los vasos sanguíneos cerebrales de P. berghei ANKA-ratones infectados. La infección de las cepas susceptibles de ratón con esta cepa del parásito en los resultados de la inducción de la malaria cerebral experimental, un síndrome neurológico que recapitula algunos aspectos importantes de Plasmodium falciparum mediada por paludismo grave en 1,2 seres humanos. Formas maduras de la malaria en etapa de sangre expresar proteínas parasitarias en la superficie de los eritrocitos infectados, lo que les permite unirse a las células endoteliales vasculares. Este proceso induce obstrucciones en el flujo sanguíneo, lo que resulta en hemorragias hipoxia y 3 y también estimula el reclutamiento de los leucocitos inflamatorios en el sitio de secuestro del parásito.
A diferencia de otras infecciones, es decir, virus neutrotopic 4-6, ambas parasitados malaria-glóbulos rojos (pRBC) así como Inflamm asociadoAtory leucocitos permanecen secuestrados dentro de los vasos sanguíneos en lugar de infiltrar el parénquima cerebral. Así, para evitar la contaminación de los leucocitos secuestrados con no inflamatorias circulantes, células de perfusión intracardiaca extenso de los ratones infectados antes de la extracción de órganos y procesamiento de tejidos es necesario en este procedimiento para retirar el compartimento de la sangre. Después de la perfusión, los cerebros se cosechan y disecado en trozos pequeños. La estructura del tejido es más interrumpido por tratamiento enzimático con colagenasa D y DNAsa I. El homogeneizado cerebral resultante se centrifugó en un gradiente de Percoll que permite la separación de secuestrados cerebro-leucocitos (BSL) de la mielina y los residuos de otro tejido. Las células aisladas se lavan a continuación, se contaron usando un hemocitómetro y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para su posterior análisis por citometría de flujo.
Este procedimiento permite la caracterización fenotípica completa de la migración de los leucocitos inflamatorios en el cerebro en rerespuesta a varios estímulos, incluyendo accidente cerebrovascular, así como infecciones víricas o parasitarias. El método también proporciona una herramienta útil para la evaluación de nuevos tratamientos anti-inflamatorios en modelos animales preclínicos.
Protocol
1. La infección de ratones con P. berghei ANKA-
- Descongelar una alícuota de criopreservado P. berghei ANKA GRI.
- Reprime un cerebral malaria resistente a ratones BALB / c de ratón donante (8-12 semanas de edad) mediante la técnica de restricción de dos manos. Inyectar ratón con 100-200 l de pRBC utilizando una jeringa de 1 ml de insulina (28G aguja). Rutinariamente, 1-2 ratones donantes se inyectan.
- En 4-5 días post-infección (pi) eliminar ratón donante de la jaula y lo coloca en una estación de trabajo o un paño desechable de trabajo.
- Suavemente contener ratón por el extremo de la cola con unas tijeras pequeñas y cortar la punta de la cola (aproximadamente 1 mm). Alternativamente, una punción pequeña cola usando una aguja de 25 G se pudo realizar.
- Colocar una gota de sangre de la vena de la cola del ratón cerca del final de un portaobjetos de microscopio esmerilado final.
- Coloque una segunda diapositiva (spreader) en un ángulo de 45 ° y una copia en la gota de sangre. Una vez que la sangre se extiende a lo largo del borde, pulse la víspera esparcidor de diapositivasólo en todo el portaobjetos de un microscopio para hacer el frotis de sangre. Deje que la mancha se seque al aire.
- Fijar los frotis de sangre en 100% de metanol durante 30 segundos y luego se tiñen con Giemsa portaobjetos recién preparada durante 10 min.
- Enjuague frotis de sangre con agua corriente durante 1 minuto, se deja secar al aire y examinar portaobjetos bajo el microscopio (100x, aceite de inmersión). Enumerar pRBC a 1.000 eritrocitos y calcular parasitemia por ciento. Los ratones donantes debería alcanzar los niveles de parasitemia entre 2.5-5% antes de que puedan ser sangrados para la infección de animales experimentales.
- Recoger sangre del ratón donante por sangrado retro-orbital utilizando un heparinizada micro-hematocrito tubo capilar. Todos los experimentos se llevan a cabo de conformidad con el Walter y Eliza Hall Institute requisitos comité de ética animal. Dependiendo de las necesidades locales Animal Comité de Ética otros procedimientos sangrado puede ser utilizado. Disolver la cantidad necesaria de sangre en medio RPMI a una concentración final de 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Considere la posibilidad de queun hematocrito normal de ratón es ~ 6x10 9 eritrocitos / ml 1.
- Infect experimental C57BL / 6 ratones (8-12 semanas de edad) mediante la inyección por vía intraperitoneal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
- Para controlar los niveles de parasitemia de ratones infectados siga los pasos 1.3-1.8. La parasitemia debe determinarse cada 2-3 días a partir del día 2 o 3 pi
- El inicio de la malaria severa en C57BL / 6 ratones pueden manifestarse como apariencia encorvada, fallo de piel y baja actividad. Algunos ratones puede recuperar en esta etapa, pero la progresión de la pérdida de reflejo autoadrizable indica enfermedad irreversible y los animales deben ser sacrificados.
2. La perfusión intracardiaca de ratones y de extracción del cerebro
- Montar un sistema de perfusión manual de gravedad asegurando un depósito de 500 ml a un soporte de columna fijado a la parte superior de un soporte de columna de 60 cm. Conectar un tubo de plástico en el extremo inferior del depósito y garantizar una abrazadera de la tubería para controlar el flujo de tampón. Conecte el tubo a una aguja de 23 G. Fill hasta el depósito con PBS (mantenido a 22 ° C), abrir la abrazadera y permitir tampón para correr a través del tubo para eliminar todas las burbujas de aire.
- P. eutanasia berghei ANKA-ratón infectado por inhalación de CO 2. Confirmar la muerte por la ausencia de pedal, orbital y las respuestas respiratorias.
- Pin ratón sacrificados por las patas traseras y delanteras dorsalmente en un tablero de espuma de poliestireno disección contenida en una bandeja de plástico. Dependiendo de ética locales Animal Comité requisitos anestesia puede administrarse antes de comenzar pefusion intracardial.
- Limpie lado ventral con 70% de etanol.
- Con unas tijeras grandes y pinzas para abrir la piel a lo largo de la línea media para exponer la cavidad torácica. Del pliegue cutáneo y el pin a los lados.
- Mantenga el esternón con unas pinzas finas y cortar el diafragma y a lo largo de ambos lados del esternón cortar las costillas. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes.
- Pin de la caja torácica por el esternón libremente al lado de la cabeza.
- Mantenga ingenio ventrículosh finas pinzas y el atrio derecho incisión cuidadosamente con unas tijeras finas.
- Inserte la aguja 23G conectada al sistema de perfusión por gravedad en el ventrículo izquierdo hacia la aorta ascendente mientras PBS está en marcha. Inserte sólo 0,5 cm de la punta de la aguja.
- Perfundir ratón durante 5 minutos o hasta que el efluente es clara.
- Liberar ratón y lo pondré sobre su abdomen. Limpiar la cabeza con 70% de etanol.
- Con unas tijeras grandes, haga un corte justo por encima del área de la médula espinal cervical.
- El uso de tijeras finas para hacer una mediana caudal-rostral corte a partir de la base del cráneo y la cáscara de la piel para exponer el cráneo.
- Sosteniendo la cabeza, colocar las hojas de una tijera pequeñas en cada cavidad orbital y realizar un corte entre las órbitas.
- Haga un corte longitudinal a lo largo de la sutura sagital y retire con cuidado el cráneo en cada hemisferio del cerebro hacia el exterior.
- Usando una espátula, levante suavemente el cerebro y lo coloca en un tubo de centrífuga de 10 ml que contenía medio RPMI.
3. Aislamiento de Brain-secuestrados leucocitos (BSL)
- Trabajando en una cabina de seguridad, lugar recién cosechado cerebro en la parte superior de un filtro de acero inoxidable de células (40-60 tamaño de malla) en una placa de Petri que contenía 3-5 ml de medio de cultivo RPMI tejido.
- Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños.
- Empuje pequeñas piezas de tejido cerebral a través del colador celular usando un émbolo de cristal.
- Transferir homogeneizado de cerebro a un tubo de 10 ml y centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Disolver sedimento en 3 ml de medio RPMI, que contiene 0,05% de colagenasa D y 2U/ml DNAsa I.
- Girar mezcla durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar los restos celulares por empujar la mezcla a través de un filtro de células de nylon 70 micras y / o mediante la incubación en hielo durante 5 min.
- Lay homogeneizado de cerebro en un cojín 7 ml de Percoll al 30% y se centrifuga a 400 xg (sin frenos) durante 20 min a temperatura ambiente.
- Resuspender el sedimento en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incubar en hielo durante 5 min alisar pRBC adherente, que no puede ser eliminado desde el cerebro por perfusión intracardial.
- Añadir 9 ml de medio RPMI, lavar las células y centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Resuspender el pellet que contiene BSL en 50-100 l de medio RPMI y las células de transferencia a un tubo Eppendorf.
- Diluir una alícuota de 5-10 l de la muestra de células 1:2 en azul tripán para la identificación de células viables.
- Contar las células viables bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. A partir del día 6 en adelante, cuando pi P. berghei ANKA de ratones infectados muestran signos neurológicos, 20.000-100.000 BSLs se puede recuperar.
4. Inmunofenotipificación de BSL por citometría de flujo multicolor
- Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 l de tampón de tinción (PBS, 1% de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de EDTA).
- Añadir el 1 l de anticuerpo purificado anti-CD16/32 (Fcblock).
- Se incuban las células durante 10 min en hielo.
- Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 50 l de tampón de tinción que contiene predeterminados diluciones óptimas requeridas de anticuerpos fluorescentes, es decir, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR y anti-NK1.1.
- Incubar durante 1 hora en hielo.
- Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 100 l de PBS.
- Transferir las células a un tubo de flujo plástico citometría.
- El uso de un citómetro de flujo, obtener al menos 5,000-10,000 eventos. Adecuados controles de células no teñidas y muestras fluorocromo compensación deben ser incluidas como sea necesario.
- Analizar los resultados utilizando el software apropiado citometría de flujo.
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Representative Results
Los resultados en la figura. 2 muestran porcentajes y números absolutos de las diferentes poblaciones BSL recuperados de los cerebros de los ratones control perfundidos o unperfused infectadas por la malaria e ingenuo. Aislado BSL fueron teñidas con PE-anti-NK1.1 y anticuerpos APC-anti-TCR-β como se indica en el texto del Protocolo. De acuerdo con resultados anteriores 7-9, αβTCR + células T comprende una elevada proporción de la piscina BSL en cerebros de perfundidos infectadas por la malaria ratones (días 6 pi). Esta población parece ser significativamente subrepresentados en los cerebros de los animales no perfundido (Fig. 2A-B). La aparente reducción de las frecuencias de células T en no perfundidos cerebros se asoció con un porcentaje considerablemente mayor y el número total de células doble negativas (αβTCR - NK1.1 -) en estos animales (Fig. 2A-B). Alto porcentaje y el número de células doble negativas en el cerebro unperfused no sólo fueron detectados en ratones infectados con malaria, pero también en Na + iuml; controles VE, lo que sugiere que estas células no son inflamatorios leucocitos presentes en los vasos sanguíneos del cerebro que son recuperados junto con células inflamatorias si la perfusión intracardiaca no se realiza.
Dos otros ejemplos de análisis de BSL se muestra en la figura. 3 y fig. 4. Brevemente, los ratones C57BL / 6 fueron infectados con P. berghei ANKA (1x10 6 GRI). Asociaciones temporales entre el reclutamiento de leucocitos hacia el cerebro y la aparición de síntomas neurológicos (entre 6-8 días pi) se han demostrado en P. berghei ANKA infectados ratones 7-9. En este ejemplo particular, infectadas por la malaria ratones fueron sacrificados en el día 6 pi, y la BSL se purificaron como se describe en el texto del Protocolo. Aislado BSL fueron teñidas con PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β-FITC, anti-CD4 y anticuerpos anti-PerCPCy5.5-CD8. Las muestras fueron obtenidas usando una BD Biosciences citómetro de flujo FACSCalibur y el análisis realizado usando software Weasel 3.0.1. Víables células fueron cerrada por delante y dispersión lateral. Los porcentajes de células NK, linfocitos T y las células NKT (NK1.1 + TCR + células) secuestrado en el cerebro de los ratones no tratados previamente y infectadas por la malaria-(días 6 pi) se indican en los paneles superiores (Fig. 3A). Los paneles inferiores muestran los porcentajes de células CD4 + y CD8 + de linfocitos T entre gated NK1.1 - αβTCR + células (Fig. 3A). La figura. 3B representa un ejemplo en el que los números absolutos de células CD4 + y CD8 + de cerebro secuestradas células T se calcularon sobre días 6 pi con P. berghei ANKA. En general, 20.000-100.000 BSL se puede recuperar a partir de cerebros de P. berghei ANKA ratones infectados. Varios factores, tales como pi tiempo, la susceptibilidad de la cepa de ratón o la inclusión de los tratamientos antiinflamatorios podrían influir en la recuperación de células. De forma rutinaria, un cerebro individual proporciona suficientes células para 1 juego de tinciones de anticuerpos.
En el ejemplo proporcionado en internetg. 4 el uso del receptor de quimiocinas de cerebro-secuestrados linfocitos T se analizó. Los ratones fueron infectados con P. berghei ANKA y BSL fueron aisladas en el día 6 pi células se tiñeron con APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 y anticuerpos biotinilado anti-CCR5, seguido de incubación con un conjugado de estreptavidina-PerCPCy5.5. Las muestras fueron adquiridas y analizadas según la fig. 3. Los histogramas representan los porcentajes de células + αβTCR entre BSL total en el control de ratones infectados con malaria e ingenuo. Los trazados de contorno en el medio y los paneles inferiores muestran los porcentajes de CXCR3 y CCR5 + + células dentro de αβTCR cerrada + células.
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento para el aislamiento y análisis de BSLde P. berghei ANKA-ratones infectados. (1) Una parte alícuota de cryopreseved de P. berghei ANKA pRBC se descongela y 1 o 2 ratones donantes infectados. (2) niveles Cuatro días más tarde parsitemia de ratones donantes se calculan, ratones donantes son desangrados y diluciones de sangre preparadas para la infección de los ratones experimentales. Una infección de malaria se fija entonces en grave paludismo susceptible C57BL / 6 ratones. (3) El pi 5-7 días, los ratones son sacrificados por inhalación de CO 2 y de inmediato intracardially perfusión para eliminar todas las que circulan las células no adherentes. (4) Los cerebros son luego recolectadas y un homogeneizado de cerebro preparado por la digestión del tejido con colagenasa D y DNAsa I. BSL se separan entonces de la mielina y los desechos celulares por un gradiente de Percoll. (5) Precipitado BSL se lavan a continuación, se contaron usando un hemocitómetro, se tiñeron con anticuerpos fluorescentes y se analizaron por citometría de flujo.
Figura 2. Análisis BSL en cerebros de ratones perfundidos o unperfused. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con P. berghei ANKA (1x10 6 GRI). Los cerebros se recogieron en el día 6 pi de animales perfundidos o unperfused. El BSL se aislaron, se tiñeron con anticuerpos anti-NK1.1 y fluorescente anti-TCR y se analizaron por citometría de flujo. (A) gráficas de puntos representan los porcentajes de células NK, linfocitos T, NK1.1 + TCR + células y células doble negativas NK1.1 - TCR - en perfundido (paneles superiores) o unperfused (paneles inferiores) ratones de control infectadas por la malaria y naïve . (B) El número absoluto de células doble negativas y los linfocitos T y se calculó el día 6 pi con P. berghei ANKA y los ratones no tratados de control. Cada represe barnts la media de 3 muestras ± SEM, * p> 0,05.
Figura 3. Células NK y linfocitos T pueden ser detectados en cerebros de P. berghei ANKA ratones infectados. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con P. berghei ANKA (1x10 6 GRI). Los cerebros se extrajeron el día 6 pi después de la perfusión de los animales sacrificados. El BSL se aislaron, se tiñeron con anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 y anti-CD8 anticuerpos fluorescentes y se analizaron por citometría de flujo. (A) Los paneles superiores muestran los porcentajes de células NK, linfocitos T y NK1.1 + TCR + células en ratones de control infectadas por la malaria e ingenuo. Los paneles inferiores muestran los porcentajes de CD4 + y CD8 + células T dentro de αβTCR cerrada + NK1.1 - (B) El número absoluto de cerebro-secuestrados CD4 + y CD8 + células T se calculó sobre días 6 pi con P. berghei ANKA y los ratones no tratados de control. Cada barra representa la media de 3 muestras ± SEM.
Figura 4. La mayoría de los linfocitos T que migran al cerebro en respuesta a la infección por malaria grave expresar el receptor de quimiocinas CXCR3. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con P. berghei ANKA (1x10 6 GRI). Los cerebros se extrajeron el día 6 pi después de la perfusión extenso de los animales sacrificados. El BSL se aislaron, se tiñeron con anti-TCR, anti-CXCR3 y anticuerpos anti-CCR5 y se analizaron por citometría de flujo. Los paneles superiores muestran los porcentajes de αβT linfocitos en ratones de control infectadas por la malaria e ingenuo. Los gráficos de contorno ilustran los porcentajes de CXCR3 + (paneles de media) y CCR5 + (panel inferior) dentro de las células cerradas linfocitos αβTCR +.
| Problema | Solución de problemas |
| Perfusión incompleta |
|
| No hay suficiente BSL recuperado |
|
Tabla 1.
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Discussion
El aislamiento y el análisis de BSL es un método que permite la caracterización y cuantificación de células inflamatorias que migran hacia el cerebro en respuesta a la lesión tisular o la infección en modelos experimentales de ratón. La introducción de un paso de perfusión intracardiaca para la retirada del compartimento de la sangre antes de la extracción de órganos y posterior aislamiento de las células es útil para prevenir la contaminación de células inflamatorias con no inflamatorias leucocitos circulantes. Esto puede no ser un requisito esencial en las infecciones neurotrópicos tales como virus de la encefalomielitis murina en la que penetran las células inflamatorias en el parénquima cerebral 5, pero es particularmente relevante en la malaria de roedores, en los que los eritrocitos infectados y leucocitos inflamatorios permanecen secuestrados dentro de los vasos sanguíneos en lugar de infiltrar el tejido cerebral . En consecuencia, la perfusión intracardiaca de ratones infectados con malaria no sólo debe ser recomendado para el análisis de BSL, pero podría ser también útil paraevaluación de secuestro del parásito de los tejidos 10,11. Similar a no inflamatorias leucocitos circulantes, las formas inmaduras de parásitos de la malaria son incapaces de adherirse al endotelio vascular y debe ser eliminado por el proceso de perfusión. En contraste, adherente pRBC (esquizontes maduros) parecen permanecer dentro de los vasos sanguíneos cerebrales. P. berghei ANKA parásitos transgénicos que expresan luciferasa se han generado 12 y son un recurso valioso para este tipo de análisis. Después de la infección con luciferasa que expresan líneas, parásito tejido de secuestro puede ser determinado por proyección de imagen del cerebro y perfundido de los animales infectados mediante un sistema IVIS 10,11. Una comparación directa de los parásitos en el secuestro de 6-7 días pi en cerebros de animales perfundidos y cerebros de los ratones infectados con parásitos reportero en particular etapa-(es decir, expresar luciferasa sólo durante la fase de esquizonte) sería útil para la validación adicional de este método.
Unoinconveniente importante de los enfoques tradicionales para el análisis histológicos de tejido con infiltración de células es que estas técnicas no permiten la evaluación de las poblaciones celulares que requieren el reconocimiento de marcador más de una célula para su identificación (es decir, NK1.1 + + αβTCR CD1d-restringida NKT o CD4 + Foxp3 + células T reguladoras). A diferencia de la histología, el análisis de citometría de flujo de leucocitos inflamatorios se presta a múltiples tinciones de anticuerpos, proporcionando una herramienta muy útil para la caracterización fenotípica completa de los infiltrados celulares 7,9,13. Además, este método es suficientemente sensible para detectar poblaciones celulares que ocurren a frecuencias tan bajas como 1-3% del total de infiltrarse intravascular, incluyendo no sólo endógeno, sino también las células transferidas de forma adoptiva, así como células T específicas de antígeno. P. berghei ANKA parásitos transgénicos que expresan MHC I y MHC II-epítopos restringidos de OVA 14 + CD8 + células T de ratones OT-I podría ser detectado entre BSL de Ly5.2 + C57BL / 6 PBTG de ratones infectados, proporcionando evidencia de que células T inflamatorias migrar al cerebro en respuesta a la malaria es el parásito específico 14.
El análisis de BSL es también útil para evaluar el potencial de los nuevos tratamientos anti-inflamatorios en modelos animales preclínicos. Por ejemplo, la capacidad de los anticuerpos monoclonales contra la quimioquina CXCR3 IFN-γ-inducible proteína 10 (IP-10) para evitar la infiltración cerebro intravascular y aliviar los síntomas de enfermedad asociados con la malaria grave se ha demostrado con éxito utilizando estaMétodo 11.
Una limitación de que este método podría tener es que el número total de células recuperadas de un cerebro individual es generalmente suficiente para un conjunto de coloraciones de anticuerpos. Así experimentos separados podría ser necesaria si más de 4-6 marcadores de células son necesarios para el análisis. En general, el procedimiento es fácil de realizar. El único paso que podría requerir algún tipo de formación inicial es la perfusión intracardiaca. Algunas sugerencias que pueden ser útiles para superar los problemas potenciales son listados en la Tabla 1.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Srta. Liana Mackiewicz de asistencia técnica. Este trabajo ha sido posible gracias al apoyo del Gobierno del Estado victoriano infraestructura operativa y del Gobierno de Australia National Health and Medical Research Council IRIISS Proyecto de Donación y 1031212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
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