Summary
本协议描述的使用GAL4-VP16为主要记者和GFP / RFP在斑马鱼次要记者基因陷阱插入突变的方法。约于一体的高表达F0鱼产量的基因陷阱后代共同表达GFP和RFP十名。筛选过程可以容易地缩放，以适应执行插入诱变屏幕实验室的规模。
Abstract
大窝卵数和光学透明胚胎的外部发展使斑马鱼使用荧光记者标记突变基因的表达在体内插入突变的特殊脊椎动物模型系统。几个实验室已在斑马鱼建造及测试增强子和基因陷阱载体，用荧光蛋白，Gal4的和LEXA为基础的转录激活因子作为记者1-7。这些载体有两个潜在的缺点：不理想的严谨性（ 如缺乏的增强子和基因陷阱事件之间的区分能力）和低诱变性（ 如整合到基因很少产生无效等位基因）。基因断裂座子（GBTS）被开发来解决这些缺点8-10。我们已经修改了一个第一大成生化载体，GBT-R15，与GAL4-VP16使用作为主要基因陷阱记者和补充无人机：绿色荧光蛋白作为直接检测基因陷阱事件次要记者。一GAL4-VP16的应用的研究作为主要的基因陷阱记者提供了两个主要的优点。首先，它提高灵敏度表示在低表达水平的基因。其次，它使研究人员能够利用基因捕获线作为Gal4的司机在非常特殊的组织其他转基因的直接表达。这对于基因与非必要的或多余的功能，其中基因陷阱的整合可能不会导致明显的表型上尤为重要。利用GAL4-VP16作为主基因陷阱记者的缺点在于编码基因与N-末端信号序列的蛋白质是不适合于捕获，因为所得到的GAL4-VP16融合蛋白不大可能能够进入细胞核并激活转录。重要的是，利用GAL4-VP16的不预先选择的核蛋白质：我们恢复基因陷阱的突变基因编码的核，细胞质和细胞膜而发挥作用的蛋白质。
Introduction
插入突变已被证明是一个有效的方法来剖析各种模型系统基因功能从单细胞生物如细菌和酵母多细胞生物如老鼠和植物。任何外源DNA（病毒，转座子或质粒）可以用作诱变剂通过中断基因，例如外显子或启动子的基本要素。这种简单的方法有效的目标是非常小的大的复杂的基因组中，由于外显子只占1-3％的典型脊椎动物基因组中。小的有效目标的大小可以通过非常高的矢量积分率被克服，其实例逆转录病毒插入突变的斑马鱼11,12的巨大成功。相比之下，内含子包括约20-30％的脊椎动物的基因组。在斑马鱼中，基于转座子的插入突变的载体，有效地引入空或整合后严重减效突变成内含子被命名为“基因突破transposoNS“（GBTS）8-10。为了实现高效的基因整合的陷阱，他们使用一个最小TOL2转13,14。GBTS的致突变性依赖于鱼源性剪接受体和转录终止/多聚腺苷酸化序列。负责大成生化诱变性的元素两侧通过直接loxP位点用于切除由Cre重组酶，因此，喷射的Cre表达的导致的大成诱发突变高效反转，即使一些转座子序列保持在整合基因座9,10。
最近公布的大成生化载体使用MRFP的基因陷阱记者9,10，导致两个潜在的缺点。首先，它不知道什么分数斑马鱼基因的表达在足够高的水平，通过直接荧光报告融合蛋白进行检测。第二，基因只有一小部分被预期具有重要功能。据估计，目前只有1,400-2,400所需的斑马鱼基因DEVELOPMENT 15,16。大多数基因突变陷阱预计不会显示明显的表型，因此将有限的效用。为了克服这两个限制，我们已经（在准备Balciuniene 等 ）改性GBT-R15 9,10与GAL4-VP16使用作为主要的基因陷阱记者。与AUG-MRFP少在大成R15，翻译起始位点是由GAL4-VP16删除。对于直接检测基因陷阱事件，我们的载体包含的14倍Gal4的UAS 17,18的控制下的EGFP报告。
几个附加的特性设计到我们的两分基因陷阱载体。无人机：绿色荧光蛋白盒被直接FRT位点（ 图1中灰色V形）两侧。注射Flp重组酶的mRNA导致切除的无人机系统：绿色荧光蛋白卡带，而使基因陷阱突变绿色荧光蛋白的荧光痕迹。然后，它可以在转基因线，标志着通过GFP荧光特定组织或发育事件中使用。如在其他GBTS，整个基因陷阱盒被直接loxP位点（开放五边形图1）两侧。这使得基因陷阱事件可逆由Cre重组酶的表达，很容易建立特定基因陷阱一体化之间因果关系的证明和观察到的表型（ 图2）。最后，基因诱捕盒被倒置的I-SceI的大范围核酸酶位点（黑三角图1）两侧。在果蝇中，转座子整合通常由P元素的不精确切除转化为缺失（缺失）。目前没有证据表明TOL2转座子（或任何其他转座子活跃在脊椎动物如睡美人的PiggyBac或AC / DS）的切除可导致缺失。因此，我们包括I-SceI的网站作为诱导缺失的一个潜在的替代方法，即使没有证据，我-SceI位可以在斑马鱼诱发缺失。应当指出的是，虽然I-SceⅠ位兆核酸酶可用于促进转基因在斑马鱼中，由I-SceI的大范围核酸酶切割DNA被用于研究DNA修复机制，包括易出错的非同源末端连接，在酵母和哺乳动物细胞19-22。
我们的基因陷阱载体的集成，可以通过两种不同的机制导致EGFP表达。第一个是真正的基因陷阱事件（ 图1C）：向量集成到一个基因（IMG为Insertionally突变基因），内源性IMG成绩单和GAL4-VP16的5'之间的融合转录制成，并翻译成融合蛋白包含由IMG和GAL4-VP16编码的蛋白质的N-末端。该融合蛋白结合到14倍UAS和激活的eGFP的转录。第二，不太理想的情况下是增强子陷阱（ 图1D）：在eGFP的前面的最小启动子落在靠近整合位点的增强子的控制之下，从而导致产量的eGFP在abSENCE GAL4-VP16生产。我们估计，EGFP表达事件30-50％是由于增强子陷阱和50-70％是由于基因陷阱23（Balciuniene 等人在准备中）。这两个类的事件之间的区别，我们已经取得了14xUAS：MRFP转基因株系（ 图1B），为了方便标记镜头专用γCry：（。Balciuniene等人筹建中）的GFP。基因捕获事件由共表达的GFP和RFP（ 图2中比较C和D）进行验证。
在我们的试点屏幕，我们筛选270 F0鱼注射的DNA转座子转座及mRNA的混合物，后痊愈超过40基因陷阱事件。我们的两个基因陷阱集成时有发生到基因与先前公布的化学诱导突变体：美国国家科学基金会和FLR。我们的插入突变体NSF tpl6和FLR tpl24的表型是由表型的表面上难以区分S中的相应的化学诱导的突变体。我们还注意到，基因陷阱事件出现偏向附近基因的5'端内含子，从而增加无效等位基因的概率。我们观察到在我们所有的基因陷阱线一定程度的无人机沉默（杂色），有的位点显然更容易受到斑斓色彩比其他人。我们不相信无人机沉默是一个显著问题的基因陷阱线传播，因为我们已经能够通过至少五个世代单独选择对GFP的表达很容易地传播我们的所有基因陷阱线。
Protocol
1。生产的F0代的基因陷阱的显微注射。
我们发现，不同遗传背景的胚胎显示不同的公差，以此过程中，与宠物店内为基础的野生型和图宾根 - 长翅（TLF）是最宽容的，而AB和图宾根株有较差的存活率。
- 制备转座子的DNA。准备GBT-B1（pDB783，Balciuniene 等人在准备中）使用标准QIAprep小量制备试剂盒（Qiagen 27106）质粒DNA。 关键是要包括在PB洗涤步骤（这是可选的QIAprep程序），否则小量制备的DNA将被RNA酶A被污染，导致转座的mRNA的降解。注射之前，稀释的DNA在无RNA酶的水（Ambion公司AM9937）至10纳克/微升。
- 制备转座基因的。线性pT3TS/Tol2（pDB600）13使用XbaI和使用mMessage机T3转录线性化的DNA（Ambion公司AM1348） 在体外转录试剂盒。我们已经通过加入0.5微升的RiboLock RNA酶抑制剂（赛默飞世Fermentas公司EO0381）改性的体外转录反应。在DNA酶处理步骤后，使用RNeasy MINELUTE试剂盒（Qiagen 74204）纯化的mRNA。评估在体外转录的mRNA的琼脂糖凝胶电泳的质量。稀释的mRNA在无RNA酶的水至40纳克/微升，并存储为2微升等分试样在-80℃下
- 制备显微注射组合。注射前，加入8微升稀释的DNA转座子转座到mRNA的2微升等分。
- 显微注射。注3 NL的DNA / RNA混合物到使用标准显微注射技术1单元斑马鱼胚胎的卵黄，旨在为蛋黄/卵裂球的接口。收集胚胎每隔20分钟，确保注射1细胞阶段。根据我们的经验，一个熟练的人可以很容易地注入1,000胚胎在1-1.5小时。
- 注射后，运行5微升的左过在1％琼脂糖凝胶上进行质量控制，以确保该转座的mRNA没有被降解注射液。
- 注射胚胎护理。在下午，去除未受精和胚胎畸形和分发胚胎60-80每100毫米的培养皿。异常和死亡的胚胎在第1天受精后（DPF），DPF 2和3 DPF去除。
- 筛选GFP的表达。屏幕无胚胎的GFP荧光在3 DPF（ 图3）明显的缺陷。筛查可以做到无论是在配备有荧光体视显微镜（我们使用尼康一SMZ1500）或直立显微镜（我们使用了蔡司AxioImager用5X Fluar目标）。低GFP的表达表示可能不成功注入或转座子RNA降解由于RNase污染（ 图3A）。选择约30％最亮的胚胎，任何一方有绿色荧光蛋白表达在多种组织或在特定组织的细胞高比例的（ 比较 figures 3B和3C）。从注射1,000胚胎，我们通常有多达100个发育正常，高表达GFP的胚胎。
- 提高使用标准的斑马鱼饲养过程中选择F0的胚胎。这是合理的预期，选择饲养注入胚胎的20-30％能够活到成年。
2。维修的无人机系统：MRFP测试仪线。
我们已经产生了14xUAS：MRFP行标通过镜头专用γCry：绿色荧光蛋白。由于无人机须通过DNA甲基化沉默，它用沉默来传播股票的低水平选择鱼是很重要的。
- 设置独立的UAS：MRFP纯合子与我们最可靠的Gal4基因诱捕线之一交配，NSF tpl6（Balciuniene等人在准备中。）。
- 在第二天，转的UAS：MRFP鱼这给胚胎个别静态储罐，而胚胎收集和清洗。
- 屏幕胚胎GFP和RFP的荧光在1 DPF和3 DPF。
- 这给胚胎具有高MRFP表达建立下一代无人机的互交鱼：MRFP线。
3。筛选F0鱼。
- 交叉个体F0与纯合子无人机：MRFP鱼（ 图4）。我们通常注入我们GBTS与野生型或豹色素沉着图案线，并且我们的纯合子的UAS：MRFP线是在黄铜的背景。因此大成注入F0鱼可以是从UAS容易辨别：MRFP鱼，省去了记录被筛选的F0是否是男性还是女性，以及从在记录和/或确定的性别失误造成潜在的错误每条鱼。因此，人才与经验非常有限，比如我们的本科学生，都能够设置和分解鱼交配。这种方法的缺点是两个不同的遗传背景有正在使用，潜在复杂功能的表型丢失的解释。
- 第二天，返回黄铜无人机：MRFP鱼他们的坦克。将这些都给胚胎成单个静态储罐（我们使用哈根出兵马俑Faunarium小，但任何小坦克可以用于此目的），而胚胎的收集和筛选了F0的鱼。
- 清洁和转移胚胎收集到新的培养皿（<100每盘）在第0天的下午。
- 屏幕胚胎GFP和RFP的荧光在1数码相框，数码相框2和3 DPF。拉胚积极为GFP和RFP出来，通过GFP / RFP的表达模式对它们进行排序（如果超过一个模式是在离合器观察），提高他们树立F1代。
- 安乐死而只产生消极的胚胎（出50-100胚胎的总数）的F0鱼。
- 越过这又产生GFP / RFP阳性后代获得第二批阳性的F0鱼。
4。筛选F1的鱼。
F1的鱼进行筛选，建立F2家庭，记录基因陷阱的表达模式和5'RACE和反向PCR冷冻胚胎批次分子鉴定的基因位点的陷阱。
- MRFP鱼（ 图4）：与纯合子无人机穿越各个F1鱼。
- 第二天，将F1的鱼，给了胚胎成单个静态储罐，而胚胎的收集和筛选。
- 屏幕胚胎GFP和RFP的荧光在1数码相框，数码相框2和3 DPF。独立和照片胚胎阳性GFP和RFP 24。
- 在5 DPF，冻结20 GFP / RFP阳性和20 GFP / RFP阴性胚胎鉴定insertionally突变基因通过反向PCR和5'RACE 9,10批次。提高剩余GFP / RFP阳性的胚胎建立F2代。
Representative Results
在一个成功的注射，至少80％的胚胎注射该基因捕获DNA / TOL2转座基因组合显示某种程度的GFP荧光（ 图3）。当各路GFP阳性胚胎（ 图3C）被选中建立F0池，大约十分之一的筛选F0鱼会产生基因陷阱后代。其中F0鱼的基因陷阱事件被回收，大部分传输除了几个非表达转座子集成一个单一的基因陷阱事件。然而，我们已经建立了从单一F0个人4基因诱捕线。在基因捕获线的GFP / RFP的表达模式的范围从非常具体的组织（例如，在嗅球），以相当普遍。
图1。 Ŧ含GAL4 - 他两分基因陷阱载体GBT-B1及其应用。该含Gal4的基因陷阱载体A.成分：TOL2 5'和TOL2 3'，最小的TOL2转座子结束13; CSA，鲤鱼β-肌动蛋白剪接受体8 ^ GAL4-VP16，AUG-少GAL4-VP16; ZP（ A），斑马鱼的β-肌动蛋白3'非编码区和poly（A）从GBT-R15 9,10元素。 14XUAS，EGFP和SV40 P（A）是无人机系统的组成部分：绿色荧光蛋白表达盒17,18。箭头表示激活无人机系统：绿色荧光蛋白由GAL4-VP16的基因陷阱产生B的14XUAS：MRFP转基因标有镜头的具体γCry：GFP的卡带。箭头表示激活UAS的：MRFP通过GAL4-VP16 反式 C.基因陷阱事件。蓝框是个外显子。剪接是由虚线。D.增强陷阱事件表示。附近的增强子（棕色盒）的载体的整合可能放置的最小启动子的eGFP这增强子的控制下（棕色箭头）。这将导致的eGFP的组织特异性表达，但由于GAL4-VP16不言，MRFP表达不会被激活。
图2。逆转的使用Cre重组酶基因陷阱事件。基因突变陷阱（A）和酶Cre-收归基因陷阱等位基因（B）的A，B。图。C，D共表达绿色荧光蛋白（C）和RFP（D）在NSF tpl6基因的神经系统陷阱线，E，F。注射Cre重组酶的RNA进入NSF tpl6胚胎造成损失的GFP（E）和RFP（F）的表达。需要注意的是在透镜不降低的GFP表达的，正如所料。
图3。胚胎注射了GBT-B1（pDB783）基因陷阱。 ：A.胚胎注射pGBT-B1（pDB783）身体的B独显小GFP荧光，C.胚胎注射pGBT-B1和TOL2转座基因：一个随机组胚胎（B）和选择饲养高表达细胞（C）。
图4。为建立Gal4的基因陷阱线实验大纲。部分重叠的红/绿结构表明共表达GFP和RFP的，而独自绿色表示嵌合基因陷阱或增强子陷阱事件。
Discussion
这里所描述的基因陷阱载体和方法已经被用于一些独立的实验室。根据我们的经验，也有在这个过程中的两个关键步骤。第一个关键步骤是实现基因陷阱整合注入F0胚胎率高。失败在这一步常常可以归因于RNA酶污染的注射剂，特别是小量制备的DNA。这也是非常重要的，在1阶段的细胞用于基因陷阱实验注入胚。在我们的经验，TOL2介导的基因转移是非常有效的，从而有可能以较低质量的DNA不迟于1细胞阶段或注射即使当获得的转基因株系。不合格的注射是更成问题开展基因突变的陷阱的时候，因为向量集成的只有一小部分产生有效的基因陷阱事件。第二个关键步骤是由穿越到我们的无人机，以确定基因陷阱事件：MRFP线。 MRFP表达的缺失是几乎总是指示一个增强子陷阱事件。但是，有时缺乏MRFP表达可指示14×UAS的沉默。因此，重要的是要保持在UAS：MRFP线在非沉默的状态通过使用具有高的RFP的表达的个体时越过NSF tpl6传播下一代。
我们可以预见做出了一些改进我们的基因陷阱向量和协议。第一是使用较少的重复的UAS的基因中的阱结构。它已经表明，一个5×UAS足以达到完全活化在细胞培养实验中，并且重复少的UAS序列是不容易的甲基化和沉默6,25。它也可以是可能的设计基因捕获载体为充分条件诱变，类似于使用的国际小鼠基因陷阱财团和最近适于斑马鱼2,26,27的载体。另一个改进是使用不同吨ransposon系统中，例如睡美人 28，以产生一个UAS：MRFP记者线。这将使注射TOL2基于基因陷阱直接进入记者线和F0s由incrossing筛选。此外，这将消除使用两种不同的遗传背景，使得功能表型损失的解释更简单。即使有了这些改进，这里介绍的一般Gal4的基因陷阱协议仍然是完全适用。
Disclosures
这些作者都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢詹妮弗Emtage博士的手稿的批判性阅读，瑞安吉尔技术援助和与试剂斑马鱼的照顾和斯蒂芬C Ekker博士（梅奥诊所，Rochster，明尼苏达州）的帮助。我们的工作已经由坦普尔大学科学技术学院和美国国立卫生研究院（R01-HD061749）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
| XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
| mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
| Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
| Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
| Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
| * We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. | |||
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