Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Methode des Gene-Trap-Insertionsmutagenese mit Gal4-VP16 als primäre Reporter und GFP / RFP als Sekundär Reportern im Zebrafisch. Etwa einer von zehn hoch-exprimierenden F0 Fischertrag Genfallen Nachkommen Co-GFP und RFP. Das Screening-Verfahren kann leicht skaliert werden, um auf die Größe des Labors Durchführung der Insertionsmutagenese Bildschirm anzupassen.
Abstract
Große Gelegegröße und externe Entwicklung von optisch transparenten Zebrafisch-Embryonen eine außergewöhnliche Wirbeltier-Modellsystem für die in vivo Insertionsmutagenese unter Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Expression von mutierten Genen zu taggen. Mehrere Labors haben Enhancer-und Gen-Trap-Vektoren im Zebrafisch gebaut und getestet, unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Gal4-und lexA-basierten Transkriptionsaktivatoren als Reporter 7.1. Diese Vektoren hatte zwei mögliche Nachteile: suboptimal Stringenz (zB mangelnde Fähigkeit, zwischen Enhancer-und Gen-Trap-Ereignisse unterscheiden) und niedrige Mutagenität (zB Integrationen in Gene selten Nullallele produziert). Gene Brechen Transposon (Haftungshinweise Stellenangebote AGBs) wurden entwickelt, um diese Nachteile zu 8-10 ehen. Wir haben eine der ersten GBT Vektoren, GBT-R15 geändert, für die Verwendung mit Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter und hinzugefügt UAS: eGFP als Sekundär Reporter für den direkten Nachweis von Gen-Trap-Ereignisse. Application von Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter bietet zwei wesentliche Vorteile. Erstens erhöht sie die Empfindlichkeit für Gene bei niedrigen Expressionsniveaus ausgedrückt. Zweitens ermöglicht es Forschern, Gene-Trap-Linien als Gal4 Treiber direkte Expression von anderen Transgenen in ganz bestimmten Gewebe zu verwenden. Dies ist besonders relevant für Gene, die mit nicht-essentiellen oder redundante Funktionen, wobei Genfallenintegration darf nicht in offene Phänotypen führen. Der Nachteil der Verwendung Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter ist, dass Gene, die für Proteine mit N-terminalen Signalsequenzen kodieren, sind nicht zugänglich Trapping, wie die daraus resultierenden Gal4-VP16-Fusionsproteine sind kaum in der Lage, den Kern zu geben und zu aktivieren Transkription. Wichtig ist, dass die Verwendung von Gal4-VP16 keine Vorauswahl für Kernproteine: wir gewonnen Gen-Trap-Mutationen in Genen, die Proteine, die im Zellkern, Zytoplasma und Zellmembran Funktion kodiert.
Introduction
Insertionsmutagenese hat sich als ein leistungsfähiges Konzept zu sezieren Gen-Funktion in verschiedenen Modellsystemen von einzelligen Organismen wie Bakterien und Hefe zu mehrzelligen Organismen wie Mäusen und Pflanzen. Alle exogenen DNA (Viren, Transposon oder Plasmid) kann als mutagen durch Unterbrechung wesentlichen Elemente von Genen wie Exons oder Promotoren dienen. Die effektive Ziel solcher einfachen Ansätzen ist in großen, komplexen Genomen äußerst gering, da die Exons umfassen nur 1-3% eines typischen Wirbeltier-Genoms. Kleine effektive Zielgröße kann durch sehr hohe Vektorintegration Raten überwunden werden, wie durch den enormen Erfolg von retroviralen Insertionsmutagenese in Zebrafisch 11,12 veranschaulicht. Im Gegensatz dazu Introns enthalten etwa 20-30% der Wirbeltiere Genome. Im Zebrafisch, Transposon-basierte Insertionsmutagenese-Vektoren, die effektiv null-oder schwere hypomorphen Mutationen auf die Integration in Introns einzuführen wurden "Gen namens brechen transposons "(Haftungshinweise Stellenangebote AGBs) 10.08. Für eine effiziente Genfallenintegration, verwenden sie eine minimale Tol2 Transposon 13,14. Mutagenität von Haftungshinweise Stellenangebote AGBs setzt auf Fisch gewonnene Spleiß-Akzeptor-und Transkriptions Kündigung / Polyadenylierungssequenzen. Die für die GBT Mutagenität verantwortlich Elementen flankiert werden durch direkten loxP-Stellen zur Exzision von Cre-Rekombinase. Somit Injektion von Cre-mRNA führt zu einer effizienten Reversion GBT-induzierten Mutationen, obwohl einige Transposon-Sequenzen bei der Integration Locus 9,10 bleibt.
Die kürzlich veröffentlichten GBT Vektoren verwenden mRFP als Gene-Trap-Reporter 9,10, was zu zwei potenzielle Mängel. Erstens ist es nicht bekannt, welcher Anteil des Zebrafisch-Gene auf einem ausreichend hohen Niveau, um durch direkte Fluoreszenz-Reporter-Fusionsproteine nachgewiesen werden ausgedrückt. Zweitens, nur eine kleine Untergruppe von Genen erwartet, dass wesentliche Funktionen haben. Es wurde geschätzt, dass es nur 1,400-2,400 Gene für Zebrafisch erforderlich development 15,16. Die meisten Gen-Trap-Mutanten sind nicht zu erwarten, offene Phänotypen angezeigt, weshalb die begrenzten Nutzen haben. Um diese beiden Beschränkungen zu überwinden, haben wir GBT-R15 9,10 modifiziert, um mit Gal4-VP16 als primäre Gene-Trap-Reporter verwenden (Balciuniene et al. In Vorbereitung). Wie bei August-less mRFP in GBT-R15 wurde die Translationsstartstelle von Gal4-VP16 entfernt. Für den direkten Nachweis von Gen-Trap-Ereignisse enthalten unsere Vektoren eine eGFP-Reporter unter der Kontrolle von 14x Gal4 UAS 17,18.
Mehrere zusätzliche Funktionen sind in unserem zweiteiligen Genfallenvektors entwickelt. Die Fachhochschule: eGFP-Kassette wird durch direkte FRT-Stellen (grau Chevrons in Abbildung 1) flankiert. Die Injektion von Flp-Rekombinase mRNA führt zur Exzision der Fachhochschule: eGFP-Kassette, so dass die Gene-Trap-Mutation durch eGFP-Fluoreszenz nicht markiert. Sie kann dann in transgenen Linien, die spezifischen Geweben oder Entwicklungs Veranstaltungen von GFP-Fluoreszenz zu markieren verwendet werden. Wie in anderenHaftungshinweise Stellenangebote AGBs wird das gesamte Gen-Trap-Kassette durch direkten loxP-Stellen (offene Fünfecke in Fig. 1) flankiert. Dies macht Gen-Trap-Ereignisse reversibel durch Expression von Cre-Rekombinase, ohne Festlegung Nachweis der Kausalität Beziehung zwischen einem spezifischen Gen-Trap-Integration und-Phänotyp beobachtet (Abbildung 2). Schließlich wird das Gen-Trap-Kassette durch invertierte I-SceI-Meganuclease Stellen (schwarze Dreiecke in Fig. 1) flankiert. In Drosophila Transposon Integrationen werden oft Deletionen (Mängel), die durch ungenaue Exzision des P-Element umgewandelt. Es gibt keine Beweise dafür, dass Exzision Tol2 Transposons (oder jede andere Transposons bei Wirbeltieren wie Dornröschen, PiggyBac oder Ac / Ds aktiv) kann zu Streichungen führen. Deshalb I-SceI-Sites als potentielle Ersatz Verfahren zur Induktion von Deletionen, obwohl es keinen Beweis, dass I-SceI können Deletionen im Zebrafisch zu induzieren. Es sollte angemerkt werden, dass, während I-SceI MegaNuklease verwendet werden, um Transgenese im Zebrafisch zu erleichtern, ist eine DNA-Spaltung von I-SceI-Meganuclease, DNA-Reparaturmechanismen, einschließlich fehleranfällig nicht-homologen Endverbindung, in Hefe-und Säugerzellen 19-22 studieren.
Integration unserer Genfallenvektors können eGFP-Expression durch zwei verschiedene Mechanismen führen. Die erste ist eine wahre Gen-Trap-Ereignisses (Fig. 1C): Der Vektor integriert sich in einem Gen (IMG des mutierten Gens durch Insertion), eine Fusion zwischen dem Transkript 5 'des endogenen IMG Transkript und der Gal4-VP16 hergestellt und in eine für Fusionsprotein, das den N-Terminus des Proteins durch IMG und Gal4-VP16 codiert. Dieses Fusionsprotein bindet an die UAS-14x und aktiviert die Transkription von eGFP. Die zweite, weniger wünschenswert Ereignis ein Enhancer-Trap (1D): der Minimalpromotor vor eGFP fallen unter die Kontrolle eines Verstärkers in der Nähe der Integrationsstelle, was zur Produktion von eGFP in der ab-Sinn des Gal4-VP16 Produktion. In unserer Schätzung 30-50% eGFP-Expression Ereignisse aufgrund einer Enhancer-Trap und 50-70% sind aufgrund eines Gen-Trap-23 (Balciuniene et al. In Vorbereitung). Um zwischen diesen beiden Klassen von Ereignissen zu unterscheiden, die wir gemacht haben 14xUAS: mRFP transgenen Linie (Abbildung 1B), der Einfachheit halber von der Linse spezifische γCry gekennzeichnet: (. Balciuniene et al in Vorbereitung) GFP. Gen-Trap-Ereignisse werden durch Co-Expression von GFP und RFP (vergleiche C und D in Fig. 2) überprüft.
In unserer Pilot Bildschirm, erholte wir über 40 Gene-Trap-Ereignisse nach dem Screening 270 F0 Fisch mit einer Mischung aus Transposon-DNA und mRNA Transposase injiziert. Nsf und flr: Zwei unserer Genfallenintegrationen haben in Genen, die mit zuvor veröffentlichten chemisch induzierten Mutanten aufgetreten. Die Phänotypen der Insertionsmutanten nsf tpl6 und flr tpl24 sind oberflächlich nicht von der Phänotyps der entsprechenden chemisch induzierten Mutanten. Wir haben auch festgestellt, dass die Gen-Trap-Ereignisse werden in Richtung der Introns in der Nähe von dem 5'-Ende von Genen, die vorgespannt ist, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Null-Allelen zu. Wir beobachten eine gewisse UAS-Silencing (Vielfarbigkeit) in alle unsere Gene-Trap-Linien, und einige Loci sind deutlich anfälliger für Vielfarbigkeit als andere. Wir glauben nicht, dass FH-Silencing ist ein erhebliches Problem für die Ausbreitung der Gene-Trap-Linien, wie wir in der Lage, leicht zu propagieren alle unsere Gene-Trap-Linien durch mindestens fünf Generationen, indem Sie auf GFP-Expression allein.
Protocol
1. Herstellung des F0-Erzeugung durch Mikroinjektion von der Gen-Trap.
Wir haben festgestellt, dass Embryonen von verschiedenen genetischen Hintergründen zeigen unterschiedliche Toleranzen zu diesem Verfahren, mit Haustier-store-Basis Wildtyp und Tübingen - Lange Fin (TLF) die tolerantesten, während AB und Tübingen Stämme haben schlechtere Überlebenszeit.
- Vorbereitung der Transposon-DNA. Bereiten GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. In Vorbereitung) Plasmid-DNA unter Verwendung von Standard QIAprep Miniprep Kit (Qiagen 27106). Es ist wesentlich, um die PB Waschschritt (der in QIAprep Verfahren optional ist) schließen, da sonst das Miniprep-DNA wird von RNase A verunreinigt werden, was zu einer Verschlechterung der Transposase mRNA. Vor der Injektion verdünnter die DNA in RNase-freiem Wasser (Ambion AM9937) bis 10 ng / ul.
- Vorbereitung der Transposase mRNA. Linearisieren pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 mit XbaI und transkribieren die linearisierte DNA mit einem Maschinen mMessage T3(Ambion AM1348) in vitro-Transkription-Kit. Wir haben die in-vitro-Transkriptionsreaktion durch Zugabe von 0,5 ul RiboLock RNase-Inhibitor (Thermofisher Fermentas EO0381) modifiziert. Nach der DNase-Behandlung Schritt reinigen mRNA mit Hilfe eines RNeasy MinElute Kit (Qiagen 74204). Bewerten Sie die Qualität der in vitro transkribierten mRNA durch Agarose-Gelelektrophorese. Verdünnen Sie die mRNA in RNase-freiem Wasser auf 40 ng / ul und lagern 2 ul Aliquots bei -80 ° C
- Herstellung der Mikroinjektion Mischung. Vor der Injektion hinzufügen 8 ul verdünnte Transposon-DNA zu einem 2 ul Aliquot Transposase mRNA.
- Mikroinjektion. Inject 3 nl von DNA / RNA-Gemisch in den Dotter von 1 Zelle Zebrafischembryonen mit Standard-Mikroinjektionstechniken, mit dem Ziel für das Eigelb / Blastomere Schnittstelle. Sammeln Embryonen alle 20 min der Injektion bei 1-Zell-Stadium zu gewährleisten. Nach unserer Erfahrung kann eine geschickte Person leicht injizieren 1.000 Embryonen in 1-1,5 Stunden.
- Nach der Injektion laufen 5 ul der linkenüber Injektionslösung auf einem 1% Agarose-Gel für die Qualitätskontrolle, um sicherzustellen, dass die Transposase mRNA wurde nicht abgebaut.
- Embryo injiziert Pflege. Am späten Nachmittag, entfernen Sie unbefruchteten und abnorme Embryonen und verteilen Embryonen auf 60-80 pro 100 mm Petrischale. Abnormal und tote Embryonen werden in 1 Tag nach der Befruchtung (DPF), 2 und 3 dpf dpf entfernt.
- Screening für GFP-Expression. Bildschirm Embryonen ohne offensichtliche Mängel auf GFP-Fluoreszenz bei 3 dpf (Abbildung 3). Screening kann entweder auf einem Stereomikroskop mit Fluoreszenz ausgestattet oder durchgeführt werden (wir verwenden eine Nikon SMZ1500) auf einem aufrechten Mikroskop (wir verwenden ein Zeiss AxioImager mit 5X Fluar Ziel). Low GFP-Expression zeigt entweder erfolglos Injektion oder Abbau von RNA-Transposase durch RNase Kontamination (Abbildung 3A). Wählen etwa 30% der hellsten Embryonen, die entweder GFP-Expression in multiplen Geweben oder in einem hohen Prozentsatz von Zellen eines bestimmten Gewebes (vgl. Figures 3B und 3C). Von einer Injektion von 1000 Embryonen, haben wir in der Regel bis zu 100 entwicklungs normal, hoch-GFP-exprimierenden Embryonen.
- Heben Sie ausgewählt F0 Embryonen mit Standard-Zebrafisch-Zuchtverfahren. Es ist zu erwarten, dass 20-30% der injizierten Embryonen für die Aufzucht ausgewählt wird bis zum Erwachsenenalter überleben.
2. Pflege der Fachhochschule: mRFP Prüfvorrichtung-Linie.
Wir haben eine 14xUAS generiert: mRFP Linie durch die Linse spezifische γCry markiert: GFP. Seit UAS unterliegt Schweigen durch DNA-Methylierung, ist es wichtig, Fisch mit geringer Schweigen, um die Lager zu propagieren auswählen.
- Individuelle UAS Set: mRFP Homozygoten zur Verbindung mit einer unserer zuverlässigsten Gal4-Gen-Trap Linien, nsf tpl6 (Balciuniene et al in Vorbereitung.).
- Am nächsten Tag, übertragen Sie die UAS: mRFP Fische, die Embryonen auf einzelne statische Tanks gab, während die Embryonen gesammeltund gereinigt.
- Screen-Embryonen für GFP und RFP Fluoreszenz bei dpf 1 und 3 dpf.
- Kreuzen Fische, die Embryonen mit hoher mRFP Ausdruck gab, um die nächste Generation von UAS zu etablieren: mRFP Linie.
3. Screening der F0 Fisch.
- Überqueren einzelnen F0 mit der homozygot UAS: mRFP Fisch (Abbildung 4). Wir spritzen normalerweise unsere Haftungshinweise Stellenangebote AGBs in Linien mit Wildtyp-oder Leopardenmuster Pigmentierung und unsere homozygot UAS: mRFP Linie ist in Messing Hintergrund. Daher kann GBT-injiziert F0 Fisch leicht von der Fachhochschule sein: mRFP Fisch, wodurch die Notwendigkeit für die Aufnahme, ob der F0, die gescreent war ein Mann oder eine Frau sowie mögliche Fehler aus Fehlern in der Aufnahme und / oder der Bestimmung des Geschlechts resultierenden jeder Fisch. Personal mit sehr begrenzte Erfahrung, wie uns Studenten, sind daher in der Lage, Einrichtung und brechen Fisch Paarungen. Dieser Ansatz hat den Nachteil, dass zwei verschiedene genetische Hintergründe sindverwendet wird, möglicherweise kompliziert Interpretation der Verlust der Funktion Phänotypen.
- Am nächsten Tag kehren die Messing UAS: mRFP Fische zu ihren Tank. Legen Sie den Fisch, der F0 Embryonen in einzelne statische Tanks gab (wir verwenden Hagen Exo Terra Faunarium Klein, aber jeder kleine Tank kann für diesen Zweck verwendet werden), während Embryonen werden gesammelt und gesiebt.
- Sauber und Transfer gesammelt Embryonen in neue Petrischalen (<100 pro Schale) am Nachmittag von Tag 0.
- Screen-Embryonen für GFP und RFP Fluoreszenz bei dpf 1, 2 und 3 dpf dpf. Ziehen Embryonen positiv sowohl für GFP und RFP aus, sortieren sie nach GFP / RFP Expressionsmuster (wenn mehr als ein Muster ist in einem Kupplungs beobachtet), und heben Sie sie auf F1-Generation zu etablieren.
- Euthanize F0 die Fische, die nur negativ Embryonen (von einer Gesamtzahl von 50 bis 100 Embryonen) produziert.
- Überqueren Sie die Fische, die F0 GFP / RFP-positiven Nachkommen wieder hergestellt, eine zweite Charge von Positiven zu bekommen.
4.Screening der F1 Fisch.
Die F1-Fisch werden gescreent, um F2 Familien zu schaffen, die Gene-Trap-Expressionsmuster zu dokumentieren und Chargen von Embryonen für die molekulare Identifizierung von Gen-Loci einfrieren Falle durch 5 'RACE und inverse PCR.
- Überqueren einzelnen F1 Fisch mit der homozygot UAS: mRFP Fisch (Abbildung 4).
- Am nächsten Tag, legen Sie die F1-Fische, die Embryonen in einzelne statische Tanks gab, während die Embryonen gesammelt und gesiebt.
- Screen-Embryonen für GFP und RFP Fluoreszenz bei dpf 1, 2 und 3 dpf dpf. Separate und zu fotografieren Embryonen positiv für beide GFP und RFP 24.
- Bei 5 dpf, gefrier Chargen von 20 GFP / RFP-positiven und 20 GFP / RFP-negative Embryonen für die Identifizierung von mutierten Gene durch Insertion durch inverse PCR und 5 'RACE 9,10. Heben restlichen GFP / RFP-positiven Embryonen F2-Generation zu etablieren.
Representative Results
In einem erfolgreichen Injektion, mindestens 80% der Embryonen mit der Gen-Trap-DNA / Tol2 Transposase mRNA Mischung injiziert anzuzeigen gewisse GFP-Fluoreszenz (Fig. 3). Wenn die hellsten GFP-positive Embryonen (3C) ausgewählt, um die F0-Pool zu schaffen, etwa ein in 10 abgeschirmt F0 Fische Gene-Trap-Nachkommen zu erhalten. Unter den F0 Fischen, von denen Gen-Trap-Events gewonnen werden, die meisten übertragen ein einzelnes Gen Trap-Ereignis neben mehreren nicht-exprimierenden Transposon-Integrationen. Allerdings haben wir bis zu vier Gene-Trap-Linien aus einer einzelnen F0 etabliert. GFP / RFP-Gen-Expressionsmuster im Falle Linien reichen von extrem gewebespezifischen (zB im Riechkolben), ziemlich allgegenwärtig.
Fig. 1 ist. Ter GAL4 haltigen zweiteiligen Genfallenvektors GBT-B1 und deren Anwendungen. A. Bestandteile der Gal4-haltigen Genfallenvektors: Tol2 5 'und Tol2 3', minimal Tol2 Transposonenden 13; cSA, Karpfen β-Actin Spleißakzeptor 8; ^ Gal4-VP16, August-Gal4-VP16 weniger; zp ( A), Zebrafisch-β-Actin-3'-UTR und Poly (A)-Elemente von GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP und SV40 p (A) sind Bestandteile der Fachhochschule: eGFP-Expressionskassette 17,18. Der Pfeil zeigt die Aktivierung von UAS: eGFP durch Gal4-VP16 von dem Gen-Trap erzeugt B. Die 14XUAS:. MRFP Transgen durch eine Linse spezifische γCry markiert: GFP-Kassette. Der Pfeil zeigt die Aktivierung von UAS: mRFP durch Gal4-VP16 in trans C Gene Trap-Ereignis.. Blaue Kästen sind Exons. Spleißen wird durch die gestrichelte Linie. D. Enhancer Trap-Ereignis angezeigt. Integration des Vektors in der Nähe eines Verstärkers (braun-Box) kann die minimale eGFP-Promotor unter der Kontrolle dieser Enhancer Ort (braun Pfeil). Dies würde zu einer gewebespezifischen Expression von eGFP führen, aber da Gal4-VP16 wird nicht vorgenommen, würde mRFP Ausdruck nicht aktiviert werden.
2. Reversion von Gen-Trap-Ereignisse mit Cre-Rekombinase. A, B, Schema eines Gene-Trap-Mutation (A) und Cre-Gen-Falle kehrte Allel (B). C, D. Co-Expression von GFP (C) und RFP (D) im Nervensystem der nsf tpl6 Gen Trap-Linie. E, F. Die Injektion von Cre-RNA in nsf tpl6 Embryonen führt zum Verlust der GFP (E) und RFP (F) Ausdruck. Beachten Sie, dass keine Reduzierung der GFP-Expression in der Linse, wie erwartet.
3. Embryonen mit dem GBT-B1 (pDB783)-Gen-Falle injiziert. . A. Embryonen injiziert pGBT-B1 (pDB783) allein wenig GFP-Fluoreszenz-Display im Körper B, C Embryonen injiziert mit pGBT-B1 und Tol2 Transposase mRNA: eine zufällige Gruppe von Embryonen (B) und High-Expressoren für die Aufzucht ausgewählt (C).
4. Experimentelle Entwurf für Einrichtung von Gal4-Gen-Trap Linien. Teilweise überlappend rot / grün Strukturen zeigen, Co-Expression von GFP und RFP, während Grün-Mosaik zeigt allein für die Gen-Trap-oder Enhancer-Trap-Ereignisse.
Discussion
Die hier beschriebene Gen-Trap-Vektoren und Methoden werden bereits in mehreren unabhängigen Labors verwendet. Nach unserer Erfahrung gibt es zwei wichtige Schritte im Prozess. Der erste wichtige Schritt ist es, hohe Genfallenintegration in Embryonen injiziert F0 zu erreichen. Versagen bei diesem Schritt kann oft RNase Kontamination der Injektion Reagenzien, insbesondere das Miniprep-DNA zurückzuführen. Es ist auch sehr wichtig, Embryonen im Stadium 1 Zelle für die Gen-Trap-Experimente zu injizieren. Nach unserer Erfahrung ist Tol2-vermittelte Transgenese sehr effizient, so dass es möglich ist, transgenen Linien auch bei der Injektion später als die 1-Zell-Stadium oder mit geringerer Qualität DNA zu erhalten. Substandard-Injektionen sind viel problematischer, wenn die Durchführung Genfallenmutagenese, da nur ein kleiner Bruchteil von Vektor-Integrationen führen zu effektiven Gen-Trap-Ereignisse. Die zweite kritische Schritt ist die Gene-Trap-Ereignisse durch Kreuzung zu unserer UAS feststellen: mRFP Linie. Fehlen mRFP Ausdruckfast immer ein Hinweis auf einen Enhancer Trap-Ereignis. Manchmal wird jedoch der Mangel an mRFP Ausdruck kann darauf hindeuten, Silencing der 14x UAS. Es ist daher wichtig, die Fachhochschule zu erhalten: mRFP Linie in einem nicht schall Zustand durch die Verbreitung der nächsten Generation mit Personen mit hohem RFP Ausdruck, wenn zu NSF tpl6 gekreuzt.
Wir können voraussehen sie mehrere Verbesserungen an unseren Gen-Trap-Vektoren und Protokoll. Die erste besteht darin, eine weniger wiederholende UAS in der Genfallenkonstrukt verwenden. Es hat sich gezeigt, dass eine 5-fach UAS ist ausreichend, um vollständige Aktivierung in Zellkulturexperimenten zu erzielen, und dass weniger wiederholende UAS-Sequenzen sind weniger anfällig für Methylierung und Silencing 6,25. Es kann auch möglich sein, Gene-Trap-Vektoren für voll bedingte Mutagenese entwerfen, in Analogie zu den von der internationalen Maus Gene-Trap-Konsortiums verwendet und vor kurzem für Zebrafisch 2,26,27 angepasst Vektoren. Eine weitere Verbesserung wäre es, eine andere T verwendenransposon System, zum Beispiel Dornröschen 28, um eine Fachhochschule zu generieren: mRFP Reporter Linie. Dies würde Injektion von Tol2-basierten Gen Fallen direkt in die Reporter-Linie und das Screening von F0s durch Einkreuzung zu ermöglichen. Außerdem würde dies die Verwendung von zwei verschiedenen genetischen Hintergründen zu beseitigen, wodurch die Interpretation der Funktionsverlust-Phänotypen einfacher. Selbst mit diesen Verbesserungen, würde der hier vorgestellten allgemeinen Gal4-Gen-Trap-Protokoll noch voll anwendbar.
Disclosures
Diese Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Jennifer Emtage für das kritische Lesen des Manuskripts, Ryan Gill für die technische Unterstützung und Hilfe bei der Pflege und Zebrafisch Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) für Reagenzien. Unsere Arbeit wurde von der Temple University College of Science and Technology und der National Institutes of Health (R01-HD061749) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
| XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
| mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
| Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
| Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
| Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
| * We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. | |||
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