Experimentell Human Pneumococcal Transport

Summary

Experimentell mänsklig pneumokock vagn har en naturlig modell för vagn och en potentiell modell för användning i utvecklingen av vaccin. Denna teknik är värdefull men komplex och innebär kliniska risker genom att införa en patogen i en människa. Vi har utvecklat ett detaljerat protokoll.

Abstract

Experimentell mänsklig pneumokock vagn (EHPC) är vetenskapligt viktigt eftersom nasofaryngeal transport av Streptococcus pneumoniae är både den största källan till överföring och förutsättningen för invasiv sjukdom. En modell av vagn möjliggör noggrann bestämning av de immunologiska korrelat till skydd, immuniserande effekten av vagnen och effekten av värdens tryck på patogenen i den nasofaryngeala nisch. Vidare, metoder för transport upptäckt användbar i epidemiologiska studier, inklusive vaccin studier kan jämföras.

Syfte

Vi strävar efter att utveckla en EHPC plattform som är en säker och användbar reproducerbar metod som kan användas för att ned-välj pneumokock kandidat nya vacciner med förebyggande av transporter som ett surrogat för vaccin-inducerad immunitet. Det kommer att verka för testning av vacciner och beskrivningar av mekanismerna bakom EHPC och vaccin skydd mot körbanansge ^1. Nuvarande konjugatvaccin mot pneumokocker skydda barn från invasiv sjukdom trots nya vacciner finns ett akut behov som den aktuella vaccinet inte ger optimalt skydd mot icke-bakteriemisk lunginflammation och det har varit tecken på serotyp ersättning med icke-vaccinserotyperna ^2-4.

Metod

Vi ympa med S. pneumoniae suspenderades i 100 pl saltlösning. Säkerhet är en viktig faktor i utvecklingen av den EHPC modellen och uppnås genom intensiv volontär screening och övervakning. En säkerhet bestående av läkare och forskare som är oberoende från studien ger objektiv feedback på veckobasis.

Den bakteriella inokulatet är standardiserad och kräver att inga animaliska produkter ympas in frivilliga (vegetabiliska medier och saltlösning). De doser som krävs för kolonisering (10 ⁴ -10 ⁵⁾ är mycket lägre than de som används i djurmodeller (10 ^{7) 5.} Upptäcka pneumokocker vagn förstärks av en hög volym (helst> 10 ml) nässköljning som är relativt slem gratis. Detta protokoll kommer att behandla de viktigaste delarna av protokollet i tur och ordning. Dessa är (a) volontär val (b) pneumokock beredning av inokulat, (c) ympning, (d) uppföljning och (e) transport upptäckt.

Resultat

Vår nuvarande protokollet har varit säker i över 100 frivilliga i ett intervall av doser med två olika bakteriella serotyper ^6. En dosvalsstudie användning av S. pneumoniae 6B och 23F närvarande genomförs för att fastställa den optimala ympningen dosen för 50% befordran. En förutspådde 50% av antalet transporter gör det möjligt för EHPC modellen har hög känslighet för vaccineffekt med små studier med nummer.

Protocol

1. Volontär selektion och screening

1. Friska frivilliga rekryteras genom affisch annonser och på universitetets webbplats enligt NHS Forskning och etikkommittén vägledning.
2. Inklusionskriterierna för deltagande är:
   1. Vuxna i åldern 18-60 år.
   2. Talar flytande engelska och kan kommunicera enkelt med både mobiltelefon och SMS.
3. Uteslutningskriterierna för deltagande är:
   1. Nära kontakt med på riskindivider (barn, immunsupprimerade vuxna, äldre, kroniskt ohälsa).
   2. Aktuell rökare eller betydande rökning historia (> 10 pack år).
   3. Astma eller andra luftvägsbesvär.
   4. Graviditet.
   5. Allergi mot penicillin eller amoxicillin.
   6. Aktuell deltagande i en annan klinisk prövning inte observationer eller i icke-interventionsstudier fas.
   7. Inte ge fullt informerat samtycke.
4. En första screening besök, ungefär en vecka före inokulering, har en fokuserad klinisk historia och riktade klinisk undersökning.
5. Om en tidigare okänd avvikelse har hittats kommer volontären att uteslutas från studien och lämplig undersökning kommer att ordnas genom primärvården.
6. Under den initiala screeningen besöka en fullständigt blodstatus erhålls för att säkerställa att antalet vita blodkroppar är inom normalt intervall före ympningen besöket. En nasal tvätt utförs för att utesluta naturliga pneumokock bärare (se 6,1).
7. Före inokulering är volontärer utbildas om riskerna med deltagande i studien och är försedda med en nödsituation bipacksedel, digital termometer, larmnummer och 3 dagars kurs av amoxicillin.

2. Beredning av Inokulering Lager

1. Beredning av ympning lagren måste göras i en ren miljö. De använda pipetter bör endast användasd för beredning av inokulat. Alla glas och plast ware bör vara sterila. Vi rekommenderar att ympning lager beredas i ett särskilt rum, med hjälp av en särskild fumehood och inkubator.
2. Pneumokockstammar ympas på en blodagarplatta. Plattor inkuberas vid 37 ° C i 5% CO ₂ natten. Följande dag alla bakterier skrapas från blodagarplatta och ympades i en sträng bestånd förvaringssystemet. Dessa pärla bestånd användas för inokulering mäldberedningen. Testa pärla lager för kontaminering och koloni enhetlighet innan förbereda en ympning lager.
3. För att förbereda ympning lager, ympa en platta blodagar med två pärlor från den önskade pneumokockserotyp pärla lager, strimmor för att täcka hela plattan. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 5% CO ₂ natten. Alla ytterligare inkubationer kommer att använda dessa samma villkor. Också inkubera Vegitone medier natten för att säkerställa sterilitet.
4. Nästa morgon svabbhalv plattan, se till att inte ta bort blodagar och lägga till 12 ml förvärmd Vegitone buljong. Upprepa med den andra halvan av plattan. Låt de två 12 ml flaskor vid 37 ° C under 2 timmar eller tills en förändring i grumlighet blir uppenbar, vilket som inträffar först.
5. Lägg till 12 ml till 40 ml förvärmd Vegitone buljong och blanda väl. Upprepa för de andra 12 ml injektionsflaska. Detta är tidpunkten = 0. Avlägsna 100 pl till läsa den optiska densiteten (OD) vid 600 nm. Avlägsna 20 pl för kvantifiering av bakterier genom kolonibildande enhet (CFU) räknas med användning av en variation av metoden av Miles och Misra (M & M) ^7. Inkubera båda flaskorna.
   1. För M & M, dela en tallrik blodagar i sex avsnitt. Lägg 180 il steril PBS till sex brunnar i en 96-brunnsplatta (U-botten). Tillsätt 20 pl av buljongen till toppen väl och blanda. Seriellt späda provet 1:10 sex gånger och kasta 20 ul från den sjätte brunn. Placera tre 10 pl droppar från den övre och i den första delen avblodagarplatta. Upprepa för de fem andra brunnar. Se till att plattan är torr innan den vänds och inkuberas.
   2. Nästa dag räkna antalet synliga kolonier i varje utspädning sektion och post. Använda utspädning avsnitt med en greve mellan 30 och 300, dividera antalet synliga kolonier med tre för att få ett genomsnitt.
   3. Multiplicera medelantalet kolonier från utspädningsfaktorn och sedan dividera med 10 (mängden 10 pl droppe). Detta ger CFU / il.
   4. Multiplicera denna siffra med 1.000 för att få CFU / ml.
6. Utför OD 600 läsningar och kvantifiering av bakterier från M & M metod varje timme fram till början i mitten logfas nås en OD på 0,25.
7. När detta OD nås lägga steriliserad 10% glycerol till en flaska och förbereda 1 ml portioner. Förvara alikvoter vid -80 ° C.
8. För en mer koncentrerad förrådslösning, centrifugera andra flaskan vid 3.345 x g under 15 min och avlägsna supernatanten. Återsuspendera pelleten i 22,5 ml VegitonE-medium och tillsätt 10% glycerol. Förbered 1 ml portioner och förvara vid -80 ° C.
9. Lämna lager vid -80 ° C under minst 48 timmar innan upptining och kvantifiera.
10. Kvantifiera frysta bakteriella lager av M & M-metoden. Test tre lager rören individuellt för att säkerställa reproducerbarhet. Använd det erhållna värdet att späda mälden till den önskade inokulatkoncentration i saltlösning, såsom beskrivs nedan.
11. För en ympning, är mängden av pneumokocker i ympen beräknas före och efter ympningen. Denna kvantifiering av bakterier från M & M-metod används för att bestämma det genomsnittliga antalet pneumokocker i inokulatet som står för den tid det tar att slutföra hela förfarandet.
    1. Bered ett inokulum, utspädning till den önskade koncentrationen, och utföra kvantifiering av M & M-metod för "pre-ympning" räknas.
    2. I vår Clinical Research Facility tar laget 30 minuter att slutföra hela ympning förfarande. Pneumococcal suspensioner i saltlösning vanligtvis visa en minskad räknas i detta intervall. För att beakta detta, låter vi den utspädda inokulat sitta i rumstemperatur i 30 minuter och sedan utföra en "efter inokulering" kvantifiering av bakterierna från M & M-metoden.
    3. Ta medelvärdet av före och efter för att bestämma den slutliga ympade koncentrationen. Justera "sittande" tid enligt din kliniska protokoll men behåll intervallet så kort som möjligt.
12. Alla nya aktier ska skickas till ett referenslaboratorium för bekräftelse i lager renhet och identitet.

3. Beredning av inokulat

1. Beredning av inokulat bör inledas 30 minuter innan den schemalagda frivilliga ympning utnämningen.
2. Ta en av de tidigare gjorda lager rör från -80 ° C frys, tina den och snurra röret i mikrocentrifug vid 17.000 x g under 3 minuter.
3. Varma blod agarplattor i 37 ° C inkubator. Förbereden 96 brunnars platta för bakteriell kvantifiering av M & M-metod och förbereda utspädning rör enligt den önskade dosen.
4. Avlägsna supernatanten buljongen från den centrifugerade röret och återsuspendera pelleten i 1 ml saltlösning. Detta steg avlägsnar buljongen från inokulum.
5. Upprepa centrifugeringssteget.
6. Avlägsna koksaltlösning supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml saltlösning.
7. Utför utspädning set för önskad inokulatkoncentration och kvantifiera av M & M-metoden.
8. Ta inokulatet till volontären utnämning och efter inokulering volontärerna, upprepa kvantifiering på labbet. Märk röret med datum och inokulat dos och förvara vid -80 ° C.
9. Att säkerställa enhetlighet från ympning till ympning, är det viktigt att använda samma pipetter och dedikerad laboratorieutrustning varje gång.

4. Inokulering

1. Frivilliga bör sitta bekvämt i en halvliggande ställning.
2. Sakta utvisa inokulatet på nässlemhinnan med en cirkelrörelse.
3. Det är viktigt att pipettspetsen inte kommer i kontakt med nässlemhinnan som en störning i integriteten av epitelet kan resultera i bakterier kommer in i blodomloppet.
4. Det är också viktigt att inokulatet inte är för långt bak eller kommer det att köra ner i halsen, det bör ligga inne i näshålan.
5. Upprepa för den andra Naris.
6. Har volontären kvar i halvliggande ställning i 10 min utan att sniffa eller blåser näsan. Detta ger tid för bakterierna att dispergera över slemhinnan.

5. Övervakning

1. Volontärer övervakas dagligen efter ympning. Detta inkluderar en daglig SMS som skickas av volontären till utredarna före 2 pm.
2. Om texten is inte fått med 2 pm volontär kommer att kontaktas för att säkerställa hans / hennes välbefinnande. Om han / hon inte svarar, kommer den tilldelade anhöriga kontaktas för att säkerställa att volontären välbefinnande.
3. Volontärer ombeds att rapportera om någon övre luftvägarna symtom vid varje möte. Klinisk personal kommer att be frivilliga att beskriva hans / hennes symptom och kommer att följa upp eventuella klagomål.
4. Antibiotika som ges till de frivilliga får endast tas under tre omständigheter, i händelse av att de är sjuk och instrueras att ta dem av forskargruppen, om de bär pneumokocker i slutet av studien, eller om de är dåligt och inte kan kontakta forskargruppen. Volontären uppmuntras att hålla denna nödsituation pack med dem hela tiden under studien och ombeds kontakta forskargruppen på daglig basis för de kommande 7 dagarna.
5. Vårt team är tillgängliga 24/7 med sjuksköterska kontakt under arbetstid och två läkare tillgängliga från HoUrs. Alla frågor behandlas av telefonsamtal och / eller omedelbar översyn. Avsättningar är tillgängliga för omedelbar, direkt tillträde till en infektionssjukdom avdelning, om det behövs.

6. Nässköljning (NW) Förfarande

1. Nasala tvättar (NW) utförs vid en inledande screening besök, samt 48 timmar, 7 och 14 dagar efter inokulering. NW metoden tas från Naclerio et al. ⁸ Volontärer koloniserade naturligt av S. pneumoniae är undantagna från ympning och uppföljning.
2. Volontären sitter bekvämt och huvudet lutas bakåt 30 ° från vertikalplanet.
3. Be volontären att ta ett djupt andetag och håll andan medan driver sin tunga upp och bakåt mot gommen. Även i detta läge, är den frivillige uppmanas att signalera att de är redo.
4. En spruta fylld med 20 ml saltlösning införes i den främre nasala utrymmet och 5 ml saltlösning utvisas. Den volunteeR lutar sedan framåt omedelbart och driver ut vätskan genom utandning snabbt genom näsan i en folie skål.
5. Upprepa denna procedur 3 gånger så att varje Naris har tvättats två gånger och hela 20 ml har använts.
6. Pool alla prover tillsammans i ett centrifugrör och skicka till laboratoriet vid rumstemperatur för bearbetning.

7. Nässköljning Processing

1. Centrifugera proverna under 10 minuter vid 3.345 x g..
2. Avlägsna supernatanten och lagrar som 1 ml alikvoter i märkta Eppendorf-rör vid -80 ° C.
3. Tillsätt 100 ul STGG medel ⁹ till pelleten och blanda väl. Säkerställa att den totala volymen i röret vid denna punkt bestämmes. Denna utspädning skall användas vid beräkning av CFU av en vagn positiv NW.
4. Platta en 20 ul droppe av STGG innehåller den återsuspenderade pelleten på en blodagarplatta innehåller gentamicin och strimma hela plattan.
   1. Om NW är efter ympning, Bort 10 | il från STGG innehållande den återsuspenderade pelleten och användning för bakteriell kvantifiering av M & M-metoden.
5. Lägga till ytterligare 800 pl STGG till NW röret och blanda väl.
6. Plattan 25 il på en blodagarplatta och 25 pl på en choklad agarplatta, strimmor hela plattan.
7. Dela upp resterande belopp bakterierna suspenderade i STGG mediet i 2 kryokärl och förvara vid -80 ° C.
8. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten i 5% CO _2.
9. Undersök plattorna nästa dag för pneumokocker och andra potentiella patogener respiratoriska.
10. Pneumokocker identifieras på plattor med kolonimorfologi. Alpha hemolytiska kolonier med föredragande morfologi subodlas på blodagar med optochin skiva och inkuberades över natten.
11. Presumtiva pneumokock kolonier som är optochin känsliga är Gram färgas för att bekräfta grampositiva diplokocker och serotypas med Statens Serum Institut Pneumotest-latex-kit.

Representative Results

Vi har erfarenhet av ympning 159 personer, varav 35 har utfört pneumokocker. Den lägsta dosen vi uppnått vagn med hjälp serotyp 6B var 11.100 cfu/100 il per Naris, den högsta dosen var 313.000 cfu/100 il per Naris. Den lägsta dosen vi uppnått vagn med hjälp serotyp 23F var 9.000 cfu/100 il per Naris, den högsta dosen var 84.500 cfu/100 il per Naris.

Vår metod för transport bedömning är en nasal tvätt, valdes eftersom en färsk studie ¹⁰ visade att 91% av volontärerna funnit nässköljning vara bekvämare än nasofaryngealt pinnen, den nässköljning var också mer benägna att upptäcka patogener med mikrobiologisk kultur. Mikrobiell flora återvunna på blodagarplattor ympade med NW kan vara rörlig och svår att läsa. Gentamicin används på den första blodagarplatta att selektera för pneumokocker. Choklad agarplatta och den andra blodagarplatta används för att upptäcka andra potentiella respiratorisk vägogens som kan hjälpa eller hindra pneumokock kolonisering. Ett exempel på en blodagarplatta inokulerades med NW som är lätt att läsa visas i figur 1a, en svår platta innehållande många typer av växter visas i figur 1b.

Vid varje möte frivilliga ombads att beskriva någon övre luftvägarna symtom, om den finns, och jämförelser mellan transportörer och icke-bärare belystes. Av de 145 personer som nyligen inokulerats med pneumokocker, klagade 28 av symptom (tabell 1). Åtta av dessa var bärare, 20 inte var. De vanligaste symtomen var icke-specifika nasala symtom (Tabell 1). Av de fall där rapporterades systemiska symtom, bland annat feber och / eller sjukdomskänsla, visade ingen av de undersökningar som utförts bevis på pneumokockinfektion och symptom överensstämde med samtidig virusinfektion utom i ett fall av halsfluss. Två pneumokocker positive frivilliga behandlades med antibiotika. En klagade över halsont och öronvärk och efter möte med studiens läkare, råddes att ta antibiotika som en försiktighetsåtgärd. Den andra frivilliga fick diagnosen kliniskt med halsfluss. Alla volontärer hade en snabb tillbakagång av symptomen.

Figur 1. Blodagarplatta ympas med NW. Blod agarplattor ympade med NW kan vara svårt att läsa. 1a är ett exempel på en platta som är lätt att läsa med pneumokocker tydligt. 1b är en platta med massor av sam-koloniserande floran gör det mer svåra att upptäcka om pneumokocker är närvarande.

Symtom		Vagn (n = 32)	Ingen transport (n = 112)
Allasymptom		24%	18%
Systemisk	Feber	3%	4%
	Sjukdomskänsla *	9%	4%
Lokalt	Öron	9%	3%
	Näsa	0	10%
	Halsen	12%	3%

Tabell 1. Karakterisering av frivilliga rapporterade symptom efter S. pneumoniae 6B ympning. Alla klagomål granskades av den externa skyddskommittén och efter fullständiga undersökningar har inga symptom tillskrivs pneumokocksjukdom. De vanligaste symtomen var halsont, fyllda näsa och influensaliknande sjukdom.

Discussion

Den EHPC plattformen har ett antal potentiella användningar innefattande användning som en mukosal vaccin modell och som ett surrogat för skydd testa vacciner nya protein. Metoden är beroende på en konsekvent ympning teknik och en hög kvalitet NW.

Reproducerbarhet kan vara ett problem med inokulatet. På grund av den variabla naturen hos de frusna alikvoter bakteriella, kan det vara svårt att replikera den önskade dosen. En halvering eller fördubbling av den önskade dosen anses inom räckhåll. Det är viktigt att den bakteriella kvantifieringen ske omedelbart före-och efter ympning, för att exakt fastställa kvantifiering av bakterier genom CFU räknas. Av denna anledning kan det vara till hjälp om frivilliga möten sker samtidigt så att endast en inokulum behöver beredas och kvantifieringen bordläggningen göras före och efter ympning sker inte mer än 30 minuter från varandra.

NW metod kräver samarringen av frivillig och skulle inte vara en idealisk metod hos barn. Om utbytet är mindre än 5 ml, kan förfarandet upprepas med användning av upp till en extra 20 ml. Bära proteser kan minska NW avkastningen. Om volontären har en blockerad / nästäppa och saltlösning rinner ut anteriort efter insättningen, blås näsan, in sprutan lite längre bak, och luta huvudet bakåt mer om det behövs.

NW är en teknik som blir bättre med övning. Viss volym kommer vanligtvis att försvinna så målet är en avkastning på minst 10 ml. Om volontären kan smaka saltlösning under NW då förbindelsen mellan den bakre nasofarynx och orofarynx inte har tillräckligt stängt av volontärens tunga. Om frivilliga sväljer de flesta av saltlösning, förklarar proceduren igen betona att trycka på tungan mot gommen. Upprepa sedan proceduren för att öka volymen tillbaka.

Om NW innehåller en substantIAL mängd slem, är det bäst att ta bort den innan centrifugering. Vortexblanda provet så att lossa något som kan bindas till slem och sedan bort så mycket av de stora bitar som möjligt medan man avlägsnar så lite saltlösning som möjligt.

En tidigare EHPC studie i USA slutfördes säkert och hade inga biverkningar ^11. Att säkerställa den fortsatta säkerheten för EHPC plattform har vi inrättat en nödsituation protokoll som är uppbyggd kring 24 timmar tillgång till forskargruppen. Volontärer får kontaktuppgifter, ge dem tillgång till forskargruppen 24 timmar om dagen. Någon medicinsk vård som behövs finns i Royal Liverpool University Hospital. Som en ytterligare skyddsåtgärd, får säkerheten bestående av läkare och forskare utanför forskargruppen en vecka säkerhetsrapport. Rapporten innehåller den bakteriella dos varje volontär emot och om några symtom eller sjukdom har rapporterats. Denna rapport kan säkerheten för eE: s undersökning som externt kritiseras utan fördomar. Skyddskommittén finns också 24 timmar en dag i den osannolika händelse av en nödsituation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Fisher	G/0650/08
0.9% Sodium Chloride	B. Braun	3627667
Skim milk powder	Fluka	70166
Tryptone soya broth	Becton Dickinson	211768
Glucose	BDH	284504S
Columbia Agar with chocolated horse blood	Oxoid	PB0124
Pneumotest-latex kit	Statens Serum Institut	51823