Summary
Expérimentale chariot pneumocoque humain offre un modèle naturel de transport et un modèle potentiel pour une utilisation dans le développement de vaccins. Cette technique est utile mais complexe et implique un risque clinique par l'introduction d'un agent pathogène dans un être humain. Nous avons développé un protocole détaillé.
Abstract
Expérimentale chariot pneumocoque humaine (EHPC) est scientifiquement important parce que le portage nasopharyngé de Streptococcus pneumoniae est à la fois la principale source de transmission et la condition sine qua non de la maladie invasive. Un modèle de transport permettra de déterminer avec précision les indicateurs immunologiques de la protection, l'effet immunisant du transport et de l'effet de la pression d'accueil de l'agent pathogène dans le créneau du nasopharynx. En outre, les méthodes de détection de chariot utiles dans les études épidémiologiques, y compris les études sur les vaccins, peuvent être comparés.
Objectif
Nous visons à développer une plate-forme EHPC qui est une méthode sûre et reproductible utile qui pourrait être utilisé pour le bas-sélection des candidats vaccins contre le pneumocoque à la prévention de nouvelles de transport comme un substitut de l'immunité induite par le vaccin. Il travaillera à l'essai de vaccins candidats et les descriptions des mécanismes sous-jacents EHPC et la protection vaccinale de Carriage 1. Les vaccins conjugués contre le pneumocoque actuelles protéger les enfants contre les maladies invasives bien de nouveaux vaccins sont nécessaires d'urgence que le vaccin actuel ne confère pas une protection optimale contre la pneumonie non bactériémique et il ya eu des preuves de remplacement des sérotypes de sérotypes non vaccinaux 2-4.
Méthode
Nous inoculer avec S. pneumoniae en suspension dans 100 ul de solution saline. La sécurité est un facteur majeur dans le développement du modèle EHPC et est réalisé grâce à un dépistage volontaire et de leur contrôle. Un comité de sécurité composé de cliniciens et de scientifiques qui sont indépendantes de l'étude fournit des informations objectives sur une base hebdomadaire.
L'inoculum bactérien est normalisé et exige qu'aucune produits animaux sont inoculés dans des bénévoles (à base de légumes médias et salines). Les doses requises pour la colonisation (10 4 -10 5) sont beaucoup plus faibles than ceux qui sont utilisés dans des modèles animaux (10 7) 5. Détection chariot pneumocoque est renforcée par un volume élevé (idéalement> 10 ml) de lavage nasal de mucus qui est relativement libre. Ce protocole traitera des aspects les plus importants du protocole à son tour. Il s'agit de la sélection des bénévoles (a), (b) préparation de l'inoculum à pneumocoque, (c) l'inoculation, (d) le suivi et la détection de chariot (e).
Résultats
Notre protocole actuel a été en sécurité dans plus de 100 bénévoles à une gamme de doses en utilisant deux différents sérotypes bactériens 6. Une étude dose-ranging utilisant S. pneumoniae 6B et 23F est actuellement menée afin de déterminer la dose optimale d'inoculation pour le transport de 50%. Un taux prévu de 50% du transport permettra le modèle EHPC d'avoir une grande sensibilité pour l'efficacité du vaccin avec un nombre d'études de petite taille.
Protocol
1. Sélection et présélection des bénévoles
- Volontaires sains sont recrutés par le biais d'affiches et de publicités sur le site de l'Université en fonction de la recherche du NHS et d'éthique d'orientation.
- Les critères d'inclusion pour la participation sont les suivantes:
- Adultes de 18-60 ans.
- Il parle couramment l'anglais et est capable de communiquer facilement à la fois par téléphone mobile et la messagerie texte.
- Les critères d'exclusion de la participation sont les suivantes:
- Le contact étroit avec les personnes à risque (enfants, adultes immunodéprimés, personnes âgées, santé maladie chronique).
- Courant des antécédents de tabagisme fumeur ou significative (> 10 paquets-années).
- L'asthme ou autre maladie respiratoire.
- Grossesse.
- Allergie à la pénicilline ou amoxicilline.
- Participation actuelle à un autre essai clinique à moins que l'observation ou la non-intervention de phase.
- Impossible de donner un consentement éclairé.
- Une visite de sélection initiale, environ une semaine avant l'inoculation, comprend une histoire centrée clinique et un examen clinique ciblé.
- Si un non constatés antérieurement anomalie est détectée, le volontaire seront exclus de l'étude et enquête appropriée sera organisé par les soins primaires.
- Au cours de l'examen initial visiter un hémogramme complet est obtenu à veiller à ce que le nombre de globules blancs est dans la plage normale avant l'inoculation visite. Un lavage nasal est effectué pour exclure les transporteurs pneumocoque naturelles (voir 6.1).
- Avant l'inoculation, les bénévoles reçoivent une formation sur les risques inhérents à la participation à l'étude et sont fournis avec une notice destinée aux patients d'urgence, thermomètre numérique, des numéros de téléphone d'urgence et 3 jours de cours de l'amoxicilline.
2. Préparation des stocks d'inoculation
- Préparation des stocks d'inoculation doit être faite dans un environnement propre. Les pipettes utilisées ne doit être utiliserpour la préparation d 'inoculum. Tout verrerie et les articles en plastique doivent être stériles. Nous recommandons que les stocks d'inoculation être préparé dans une salle dédiée, en utilisant une hotte dédiée et un incubateur.
- Souches de pneumocoques sont ensemencées sur une gélose au sang. Les plaques sont incubées à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant la nuit. Le lendemain de toutes les bactéries est raclée de la gélose au sang et inoculé dans un système de préservation des stocks de perles. Ces stocks perles sont utilisées pour l'inoculation préparation de la pâte. Testez les stocks de perles pour la contamination et l'uniformité colonie avant de préparer un stock inoculation.
- Pour préparer le bouillon inoculation, inoculer une gélose au sang de deux perles du sérotype pneumococcique stock souhaité perle qui s'étirent pour couvrir la totalité de la plaque. Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant la nuit. Toutes les incubations d'autres utiliseront ces mêmes conditions. Aussi incuber les médias Vegitone nuit pour assurer la stérilité.
- L'écouvillon lendemain matinla moitié de la plaque, en prenant soin de ne pas enlever la gélose au sang, et ajouter à 12 ml de bouillon Vegitone préchauffé. Répéter en utilisant l'autre moitié de la plaque. Laisser les 12 deux flacons ml à 37 ° C pendant 2 heures ou jusqu'à ce qu'un changement de turbidité apparaît, selon la première éventualité.
- Ajouter le ml 12 à 40 ml de bouillon Vegitone préchauffé et bien mélanger. Répétez l'opération pour l'autre flacon de 12 ml. Il s'agit point dans le temps = 0. Prélever 100 ul de lire la densité optique (DO) à 600 nm. Retirer 20 ul pour la quantification des bactéries par unité formant colonie (UFC) Nombre moyen d'une variante de la méthode de Miles et Misra (M & M) 7. Incuber les deux flacons.
- Pour le M & M, diviser une gélose au sang en six sections. Ajouter 180 ul de PBS stérile à six puits d'une plaque de 96 puits à fond en U (). Ajouter 20 ul de bouillon pour le bien haut et bien mélanger. Diluer en série des échantillons 01h10 six fois et jeter 20 pl du puits sixième. Placer trois gouttes 10 pl du puits haut dans la première section de l'gélose au sang. Répétez l'opération pour les cinq autres puits. S'assurer que la plaque est sèche avant qu'il ne soit renversé et mis à incuber.
- Le lendemain, compter le nombre de colonies visibles dans chaque section de dilution et d'enregistrement. Utilisation de la section de dilution avec un nombre entre 30 et 300, il faut diviser le nombre de colonies visibles par trois pour obtenir une moyenne.
- Multipliez le nombre moyen de colonies par le facteur de dilution, puis divisez par 10 (le montant de la baisse de 10 pi). Cela donne UFC / ul.
- Multipliez ce nombre par 1000 pour obtenir UFC / ml.
- Effectuer DO 600 lectures et la quantification des bactéries par M & M méthode chaque heure avant le début de phase semi-logarithmique est atteint, une DO de 0,25.
- Une fois cette DO est atteint, ajouter 10% de glycérol stérile à un flacon et préparer aliquotes de 1 ml. Boutique aliquotes à -80 ° C.
- Pour un stock plus concentré, centrifuger la fiole autre à 3345 xg pendant 15 min et éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 22,5 ml d'Vegitone moyen et ajouter 10% de glycérol. Préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à -80 ° C.
- Laisser les stocks à -80 ° C pendant au moins 48 heures avant la décongélation et la quantification.
- Quantifier le stock congelé bactérienne par la méthode M & M. Testez trois tubes actions individuellement pour assurer la reproductibilité. Utilisez la valeur obtenue pour diluer le stock à la concentration désirée d'inoculum dans une solution saline, comme décrit ci-dessous.
- Pour l'inoculation, la quantité de pneumocoques dans l'inoculum est calculée avant et après l'inoculation. Cette quantification des bactéries par la méthode M & M est utilisé pour déterminer le nombre moyen de pneumocoques dans l'inoculum qui représente le temps qu'il faut pour terminer la procédure.
- Préparer un inoculum, diluer à la concentration voulue, et d'effectuer la quantification par la méthode M & M pour la "pré-inoculation" count.
- Dans notre centre de recherche clinique prend l'équipe de 30 min pour terminer la procédure d'inoculation entier. Pnsuspensions eumococcal dans une solution saline se montrent habituellement une diminution du nombre dans cet intervalle. Pour tenir compte de cela, nous laissez l'inoculum dilué à température ambiante pendant 30 min, puis effectuer un "post-inoculation" quantification des bactéries par la méthode M & M.
- Prendre la moyenne de l'avant et après afin de déterminer la concentration finale inoculé. Réglez la «séance» le temps en fonction de votre protocole clinique mais gardez l'intervalle aussi bref que possible.
- Tous les nouveaux stocks doivent être envoyés à un laboratoire de référence pour la confirmation de la pureté des stocks et d'identité.
3. Préparation d'inoculum
- Préparation de l'inoculum doit commencer 30 minutes avant le rendez-inoculation volontaire prévue.
- Prenez l'un des tubes d'actions déjà effectués sur le congélateur à -80 ° C, le décongeler et faire tourner le tube dans la microcentrifugeuse à 17.000 xg pendant 3 min.
- Gélose au sang chaud dans l'incubateur à 37 ° C. Préparerune plaque à 96 puits pour la quantification bactérienne par la méthode M & M et préparer les tubes de dilution en fonction de la dose souhaitée.
- Retirer le surnageant de bouillon du tube centrifugé et remettre en suspension le culot dans 1 ml de solution saline. Cette étape supprime le bouillon de l'inoculum.
- Répétez l'étape de centrifugation.
- Retirer le surnageant saline et reprendre le culot dans 1 ml de solution saline.
- Effectuez ensemble taux de dilution de la concentration d'inoculum désiré et quantifier par M & M méthode.
- Prenez l'inoculum à la nomination des bénévoles et des volontaires après l'inoculation, répéter la quantification au laboratoire. Etiqueter le tube avec la date et la dose de l'inoculum et conserver à -80 ° C.
- Pour assurer la cohérence de l'inoculation à l'inoculation, il est important d'utiliser les mêmes pipettes et matériel de laboratoire dédié à chaque fois.
4. Inoculation
- Les bénévoles doivent être assis confortablement dans une position semi-allongée.
- Lentement expulser l'inoculum sur la muqueuse nasale en utilisant un mouvement circulaire.
- Il est essentiel que la pointe de pipette n'entre pas en contact avec la muqueuse nasale comme une rupture dans l'intégrité de l'épithélium pourrait se traduire par des bactéries dans la circulation sanguine.
- Il est également essentiel que l'inoculum n'est pas placé trop loin ou elle se déroulera dans la gorge, il doit se trouver à l'intérieur de la cavité nasale.
- Répétez l'opération pour la narine autre.
- Ayez le bénévolat rester dans la position semi-couchée pendant 10 min sans renifler ou se moucher. Cette alternance permet aux bactéries de se disperser à travers la muqueuse.
5. Surveillance
- Les bénévoles sont surveillés par jour après l'inoculation. Cela inclut un message texte envoyé par le quotidien bénévole aux enquêteurs avant 14 heures.
- Si le texte que jen'est pas reçue par 14 heures le volontaire sera contacté pour assurer sa / son bien-être. Si il / elle ne répond pas, la prochaine alloué parent sera contacté pour assurer le volontaire du bien-être.
- Les bénévoles sont invités à rendre compte des symptômes des voies respiratoires supérieures à tous les rendez-vous. Le personnel clinique demandez au volontaire de décrire ses symptômes et ses / assurera le suivi des plaintes.
- Les antibiotiques donnés aux volontaires ne doivent être prises dans trois circonstances: dans le cas où ils sont malades et sont chargés de les prendre par l'équipe de recherche, s'ils sont porteurs pneumocoque à la fin de l'étude, ou si elles sont mal et incapable de communiquer avec l'équipe de recherche. Le volontaire est encouragé à maintenir cette trousse de secours avec eux pendant toute la durée de l'étude et est prié de contacter l'équipe de recherche sur une base quotidienne pour les 7 prochains jours.
- Notre équipe est disponible 24/7 avec contact infirmière pendant les heures de travail et de deux médecins disponibles sur des hours. Toutes les requêtes sont traitées par appel téléphonique et / ou un examen immédiat. Dispositions sont disponibles pour immédiate, admission directe dans un service des maladies infectieuses, en cas de besoin.
6. Lavage nasal (NW) Procédure
- Lavages nasaux (NO) sont effectuées lors d'une visite de dépistage initial, ainsi que 48 heures, 7 et 14 jours après l'inoculation. La méthode utilisée NO est tiré de Naclerio et al. 8 volontaires naturellement colonisés par S. pneumoniae sont exclus de l'inoculation et le suivi.
- Le volontaire doit être confortablement assis et la tête est inclinée vers l'arrière à 30 ° de la verticale.
- Demandez au volontaire de prendre une profonde inspiration et retiennent leur souffle tout en poussant leur langue et vers l'arrière contre le toit de la bouche. Alors que dans cette position, le volontaire est invité à indiquer qu'ils sont prêts.
- Une seringue remplie avec 20 ml de solution saline est inséré dans l'espace nasal antérieur et 5 ml de solution saline est expulsé. Le volunteepuis se penche en avant r immédiatement et expulse le fluide en expirant par le nez rapidement dans un bol en aluminium.
- Répétez cette procédure 3 fois plus de sorte que chaque narine a été lavées deux fois et la totalité des 20 ml a été utilisée.
- Piscine tous les échantillons ensemble dans un tube de centrifugeuse et l'envoyer au laboratoire à température ambiante pendant le traitement.
7. Nasal Wash traitement
- Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 3345 x g.
- Enlever le surnageant et conserver en aliquotes de 1 ml dans des tubes Eppendorf étiquetés à -80 ° C.
- Ajouter 100 ul de milieu 9 StGG au culot et mélanger soigneusement. Assurez-vous que le volume total dans le tube à ce stade est déterminé. Cette dilution sera utilisé dans le calcul de l'UFC d'un chariot positif NO.
- Plaque une baisse de 20 ul de la StGG contenant l'extrait concentré sur une gélose au sang contenant de la gentamicine et de série de la plaque.
- Si le NO est post-inoculation, 10 pl retirer de la StGG contenant le culot remis en suspension et l'utilisation pour la quantification bactérienne par M & M méthode.
- Ajouter une autre de 800 ul StGG au tube NO et bien mélanger.
- Plaque de 25 pi sur une plaque de gélose au sang et 25 pi sur une plaque de gélose chocolat, rayures toute la plaque.
- Divisez les bactéries en suspension dans l'montants restants StGG moyenne en 2 cryotubes et conserver à -80 ° C.
- Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit dans 5% de CO 2.
- Examiner les plaques le lendemain pour le pneumocoque et d'autres pathogènes respiratoires potentiels.
- Les pneumocoques sont identifiés sur des plaques par la morphologie des colonies. Colonies hémolytiques alpha ayant une morphologie dessinateur sont repiqués sur gélose au sang avec un disque optochine et incubées pendant la nuit.
- Les colonies suspectes pneumocoque qui sont sensibles sont optochine coloration de Gram pour confirmer diplocoques à Gram positif et le sérotypage en utilisant le Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.
Representative Results
Nous avons l'expérience inoculer 159 personnes, dont 35 ont effectué le pneumocoque. La dose la plus faible nous avons atteint chariot avec l'aide de sérotype 6B était 11.100 pi par narine UFC/100, la dose la plus élevée était de 313 000 UFC/100 ul par narine. La dose la plus faible nous avons atteint chariot avec l'aide de sérotype 23F est 9000 UFC/100 ul par narine, la dose la plus élevée était de 84 500 pi par narine UFC/100.
Notre méthode d'évaluation chariot est un lavage nasal, choisi parce qu'une étude récente 10 a montré que 91% des volontaires ont trouvé lavage nasal à être plus à l'aise que écouvillonnage du nasopharynx, le lavage nasal était également plus susceptibles de détecter des agents pathogènes en utilisant la culture microbiologique. La flore microbienne récupérés sur des plaques de gélose au sang inoculés avec NO peut être variable et difficile à lire. La gentamicine est utilisé sur la gélose au sang d'abord sélectionner pour le pneumocoque. La gélose chocolat et la plaque de gélose sang deuxième sont utilisés pour détecter d'autres parcours respiratoire potentielOgens qui peuvent aider ou entraver la colonisation pneumococcique. Un exemple d'une plaque de gélose au sang inoculé avec NO qui est facile à lire est illustré à la figure 1a; une plaque difficile contenant de nombreux types de flore est montré dans la figure 1b.
À tous les bénévoles de rendez-vous a été demandé de décrire les symptômes des voies respiratoires supérieures, s'il est présent, et les comparaisons entre les transporteurs et les non-porteurs ont été mis en évidence. Sur les 145 personnes récemment inoculés avec le pneumocoque, 28 se plaignaient de symptômes (tableau 1). Huit d'entre eux étaient porteurs, vingt étaient pas. Les symptômes les plus fréquents étaient des symptômes non spécifiques nasales (tableau 1). Parmi les cas pour lesquels il a été signalé des symptômes systémiques, y compris la fièvre et / ou de malaise, aucune des enquêtes menées ont montré des signes de maladie à pneumocoques et les symptômes étaient compatibles avec une infection virale concomitante sauf dans un cas d'amygdalite. Deux pneumocoque positivvolontaires ont été e traitée avec des antibiotiques. L'un se plaignait de maux de gorge et des maux d'oreille et, après avoir rencontré le médecin de l'étude, a été conseillé de prendre des antibiotiques à titre préventif. L'autre volontaire a été diagnostiqué cliniquement avec une amygdalite. Tous les bénévoles ont eu une résolution rapide des symptômes.
Figure 1. Gélose au sang inoculé avec NO. Géloses inoculées avec du sang NO peut être difficile à lire. 1a est un exemple d'une plaque qui est facile à lire avec des pneumocoques clairement visible. 1b est une plaque avec beaucoup de co-colonisateurs flore rendant plus difficile à détecter si les pneumocoques est présent.
| Symptômes | Chariot (n = 32) | Pas de transport (n = 112) | |
| Toussymptômes | 24% | 18% | |
| Systémique | Fièvre | 3% | 4% |
| * Malaise | 9% | 4% | |
| Local | Ouïe | 9% | 3% |
| Nez | 0 | 10% | |
| Gorge | 12% | 3% |
Tableau 1. Caractérisation des bénévoles ont signalé des symptômes après S. pneumoniae 6B inoculation. Toutes les plaintes ont été examinées par le comité de sécurité externe et, à la suite des enquêtes approfondies, aucun symptôme n'a été attribués à la maladie pneumococcique. Les symptômes les plus communs sont le mal de gorge, nez et farcies syndrome pseudo-grippal.
Discussion
La plate-forme EHPC a un certain nombre d'utilisations possibles, y compris l'utilisation comme un modèle vaccin muqueux et comme substitut de protection pour tester des vaccins de protéines nouvelles. La méthode dépend d'une technique d'inoculation uniforme et une haute qualité NO.
La reproductibilité peut être un problème avec l'inoculum. En raison de la nature variable des aliquotes congelées bactériennes, il peut être difficile de reproduire la dose souhaitée. Une réduction de moitié ou doubler la dose désirée est considéré à sa portée. Il est essentiel que la quantification bactérienne se faire immédiatement avant et suivant l'inoculation, afin de déterminer avec précision la quantification des bactéries en UFC compte. Pour cette raison, il peut être utile si les nominations de bénévoles se produire simultanément de sorte que seul un inoculum besoin d'être préparé et le placage quantification réalisée avant et après l'inoculation se passe pas plus de 30 minutes d'intervalle.
Procédé NO nécessite la coopéraration du volontaire et ne serait pas une méthode idéale chez les enfants. Si le rendement est inférieur à 5 ml, la procédure peut être répétée jusqu'à l'utilisation d'une remise de 20 ml. Port de prothèses dentaires peuvent réduire le rendement NW. Si le bénévole a une bloqué / nez bouché et la solution saline est compté antérieurement après l'insertion, de se moucher, insérez la seringue un peu plus loin en arrière, et incliner la tête en arrière plus si nécessaire.
Le NO est une technique qui s'améliore avec la pratique. Certains volumes seront généralement perdu tant l'objectif est un rendement d'au moins 10 ml. Si le volontaire peut déguster une solution saline pendant le NO, la connexion entre le nasopharynx et de l'oropharynx postérieur n'a pas été suffisamment fermé par la langue du volontaire. Si la plupart des bénévoles avale de la solution saline, expliquer la procédure, en insistant sur la poussée de la langue contre le palais de la bouche. Ensuite, répétez la procédure pour augmenter le volume retourné.
Si le NO contient une substantial montant de mucus, il est préférable de l'enlever avant la centrifugation. Vortex de l'échantillon de façon à desserrer tout ce qui pourrait être lié au mucus, puis enlever autant de grands morceaux que possible tout en retirant une solution saline peu que possible.
Une étude précédente EHPC aux Etats-Unis a été effectué en toute sécurité et a eu aucun événement indésirable 11. Pour assurer la sécurité permanente de la plate-forme EHPC, nous avons mis en place un protocole d'urgence qui est basé sur un accès 24 h à l'équipe de recherche. Les bénévoles reçoivent les coordonnées, leur permettant d'accéder à l'équipe de recherche de 24 heures par jour. Tous les soins médicaux nécessaires est fournie à l'Hôpital Royal Liverpool University. Comme mesure supplémentaire de protection, un comité de sécurité composé de cliniciens et de scientifiques provenant de l'extérieur du groupe de recherche reçoit un rapport de sécurité hebdomadaire. Le rapport contient la dose bactérienne chaque bénévole a reçu et si des symptômes de la maladie ont été signalés. Ce rapport permet la sécurité des èmee étude à l'extérieur critiqué sans parti pris. Le comité de sécurité sont également disponibles 24 heures par jour dans le cas improbable d'une urgence.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation Bill et Melinda Gates Foundation (prix du Grand Défi d'exploration SBG), les National Institutes for Health Research (INDH), Centre de recherche biomédicale sur les maladies microbiennes, et l'INDH Réseau global de recherche locale. Nous reconnaissons l'NWDA de soutien aux infrastructures. Nous remercions le Professeur J. N Weiser, Université de Pennsylvanie et le professeur P Hermans, Université de Nijmegen pour les isolats de pneumocoques. Merci au comité de sécurité EHPC pour leur soutien et de conseils, à tous nos bénévoles pour leur participation et à Mathieu Bangert pour prendre les photos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Fisher | G/0650/08 | |
| 0.9% Sodium Chloride | B. Braun | 3627667 | |
| Skim milk powder | Fluka | 70166 | |
| Tryptone soya broth | Becton Dickinson | 211768 | |
| Glucose | BDH | 284504S | |
| Columbia Agar with chocolated horse blood | Oxoid | PB0124 | |
| Pneumotest-latex kit | Statens Serum Institut | 51823 |
References
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