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Medicine

Sperimentale trasporto pneumococco umano

doi: 10.3791/50115 Published: February 15, 2013

Summary

Sperimentale trasporto pneumococcica umana offre un modello naturale di trasporto e un possibile modello per l'uso nello sviluppo dei vaccini. Questa tecnica è utile ancora complessa e comporta un rischio clinico introducendo un agente patogeno in un essere umano. Abbiamo sviluppato un protocollo dettagliato.

Abstract

Sperimentale trasporto pneumococcica umano (EHPC) è scientificamente importante perché il trasporto nasofaringeo di Streptococcus pneumoniae è sia la fonte principale di trasmissione e la condizione di malattia invasiva. Un modello di trasporto permetterà accurata determinazione dei correlati immunologici della protezione, l'effetto immunizzante di trasporto e l'effetto della pressione host sul patogeno nella nicchia nasofaringeo. Inoltre, i metodi di rilevamento di trasporto utile per studi epidemiologici, compresi gli studi di vaccini, può essere paragonato.

Puntare

Il nostro obiettivo è sviluppare una piattaforma EHPC che è un metodo sicuro e utile riproducibile che potrebbe essere utilizzato per sotto-selezionare nuovi vaccini contro lo pneumococco candidati con la prevenzione di trasporto come un surrogato di immunità indotta dal vaccino. Essa si adopererà per la sperimentazione di vaccini e le descrizioni dei meccanismi alla base EHPC e protezione del vaccino da Carriage 1. Attuali vaccini coniugati contro lo pneumococco proteggere i bambini dalle malattie invasive, anche se i nuovi vaccini sono urgentemente necessari come l'attuale vaccino non conferisce una protezione ottimale contro i non-batteriemica polmonite e non vi è stata evidenza di sostituzione sierotipo con sierotipi non contenuti nel vaccino 2-4.

Metodo

Abbiamo inoculare con S. pneumoniae sospesi in 100 pl di soluzione salina. La sicurezza è un fattore importante nello sviluppo del modello EHPC ed è realizzato attraverso lo screening volontario intensivo e monitoraggio. Un comitato di sicurezza composto da medici e scienziati che sono indipendenti dallo studio fornisce un feedback obiettivo su base settimanale.

L'inoculo batterico è standardizzato e richiede che i prodotti animali vengono inoculati in volontari (a base vegetale media e saline). Le dosi necessarie per la colonizzazione (10 4 -10 5) sono molto più bassi than quelli utilizzati in modelli animali (10 7) 5. Rilevamento di trasporto pneumococco è arricchita da un volume elevato (idealmente> 10 ml) lavaggio nasale muco che è relativamente libera. Questo protocollo si occuperà delle parti più importanti del protocollo, a sua volta. Questi sono (a) selezione dei volontari, (b) la preparazione dell'inoculo pneumococco, (c) inoculazione, (d) il follow-up e (e) individuazione trasporto.

Risultati

Il nostro attuale protocollo è stato sicuro in più di 100 volontari in un range di dosi utilizzando due diversi sierotipi batterici 6. Uno studio dose-ranging con S. pneumoniae 6B e 23F è attualmente in corso per determinare la dose ottimale inoculazione per il 50% il trasporto. Un tasso previsto del 50% di trasporto permetterà al modello EHPC di avere alta sensibilità per l'efficacia del vaccino con numeri di studio di piccole dimensioni.

Protocol

1. Volontari di selezione e screening

  1. Volontari sani sono reclutati attraverso poster pubblicitari e sul sito di Ateneo in base alla ricerca NHS ed etica orientamento Comitato.
  2. I criteri di inclusione per la partecipazione sono:
    1. Adulti di età compresa tra 18-60 anni.
    2. Parla correntemente l'inglese ed è in grado di comunicare facilmente sia da telefono cellulare e messaggi di testo.
  3. I criteri di esclusione per la partecipazione sono:
    1. Stretto contatto con le persone a rischio (bambini, adulti immunodepressi, anziani, salute malattie croniche).
    2. Attuale fumatore o significativa storia di fumo (> 10 anni confezione).
    3. Asma o di altre malattie respiratorie.
    4. Gravidanza.
    5. Allergia alla penicillina o amoxicillina.
    6. Coinvolgimento ufficiale in un altro studio clinico osservazionale o in meno non interventistici fase.
    7. Impossibile dare un consenso pienamente informato.
  4. Una visita di screening iniziale, circa una settimana prima dell'inoculazione, include una storia clinica mirata e mirato esame clinico.
  5. Se una sconosciuta anomalia viene trovato, il volontario saranno esclusi dallo studio e di indagine del caso, saranno organizzati tramite le cure primarie.
  6. Durante la proiezione iniziale visitare un emocromo completo si ottiene per garantire che il numero di globuli bianchi è nel range di normalità prima della visita inoculazione. Un lavaggio nasale viene eseguita per escludere vettori pneumococco naturali (vedi 6.1).
  7. Prima di inoculazione, i volontari sono istruiti sui rischi connessi con la partecipazione nello studio e sono dotati di un foglietto illustrativo di emergenza, termometro digitale, i numeri d'emergenza e 3 giorni di corso di amoxicillina.

2. Preparazione degli stock di inoculazione

  1. Preparazione delle scorte inoculazione deve essere fatto in un ambiente pulito. Le pipette devono essere utilizzared per la preparazione dell'inoculo. Tutto in vetro e oggetti in plastica devono essere sterili. Si raccomanda che le scorte di inoculazione essere preparato in una sala dedicata, con un fumehood dedicato e incubatore.
  2. Ceppi di pneumococco sono inoculate su una piastra di agar sangue. Le piastre vengono incubate a 37 ° C in 5% CO 2 durante la notte. Il giorno dopo tutti i batteri viene raschiata dalla piastra di agar sangue e inoculata in un sistema di conservazione cordone magazzino. Queste scorte tallone vengono utilizzati per la preparazione inoculazione magazzino. Verificare le scorte tallone di contaminazione e l'uniformità colonia prima di preparare uno stock inoculazione.
  3. Per preparare il brodo inoculo, inoculare una piastra di agar sangue con due perle del magazzino desiderato sierotipo pneumococcico tallone, striature per coprire l'intera piastra. Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO 2 durante la notte. Tutte le incubazioni altri utilizzeranno queste stesse condizioni. Anche i mezzi di comunicazione Vegitone incubare overnight per garantire la sterilità.
  4. Il tampone mattina dopola metà del piatto, facendo attenzione a non rimuovere qualsiasi agar sangue, e aggiungere 12 ml di pre-riscaldato brodo Vegitone. Ripetere con l'altra metà della piastra. Lasciare i due 12 fiale ml a 37 ° C per 2 ore o fino a quando un cambiamento di torbidità diventa evidente, quello che viene prima.
  5. Aggiungere il 12 ml a 40 ml di pre-riscaldato Vegitone brodo e mescolare accuratamente. Ripetere l'operazione per gli altri 12 ml Fiala. Questo punto è tempo = 0. Rimuovere 100 pl a leggere la densità ottica (OD) a 600 nm. Rimuovere 20 pl per la quantificazione dei batteri per unità formanti colonie (CFU) conteggio utilizzando una variante del metodo da Miles e Misra (M & M) 7. Incubare entrambi i flaconcini.
    1. Per la M & M, dividere una piastra di agar sangue in sei sezioni. Aggiungere 180 microlitri di PBS sterile a sei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (U-bottom). Aggiungere 20 ml di brodo al pozzo alto e mescolare. Serialmente diluire i campioni 1:10 sei volte ed eliminare 20 pl dal pozzo sesto. Inserire tre gocce 10 microlitri da ben superiore nella prima sezione delpiastra di agar sangue. Ripetere l'operazione per gli altri cinque pozzi. Assicurarsi che la piastra sia asciutto prima che si inverte e si incuba.
    2. Il giorno successivo contare il numero di colonie visibili in ogni sezione di diluizione e record. Utilizzando la sezione di diluizione con un conteggio tra 30 e 300, dividere il numero di colonie visibili per tre per ottenere una media.
    3. Moltiplicare il numero medio di colonie per il fattore di diluizione e dividere per 10 (la quantità di caduta di 10 pl). Questo dà CFU / pl.
    4. Moltiplicate questo numero per 1000 per ottenere CFU / ml.
  6. Eseguire OD 600 letture e quantificazione dei batteri da M & M metodo ogni ora fino ai primi di metà-log fase viene raggiunto, un OD di 0,25.
  7. Una volta che questo viene raggiunto OD, aggiungere sterilizzati glicerolo 10% ad un flaconcino e preparare aliquote da 1 ml. Aliquote Conservare a -80 ° C.
  8. Per un magazzino più concentrato, centrifugare la fiala a 3345 xg per 15 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 22,5 ml di Vegitone medio e aggiungere il 10% di glicerolo. Preparare aliquote da 1 ml e conservare a -80 ° C.
  9. Lasciare le scorte a -80 ° C per almeno 48 ore prima che lo scongelamento e la quantificazione.
  10. Quantificare il brodo congelato batterica dalla M & M metodo. Prova tre tubi di archivi fotografici singolarmente per garantire la riproducibilità. Usare il valore ottenuto per diluire il magazzino alla concentrazione desiderata inoculo in soluzione salina, come descritto di seguito.
  11. Per un inoculo, la quantità di pneumococchi nel inoculo viene calcolato prima e dopo l'inoculazione. Questa quantificazione dei batteri della M & M metodo viene utilizzato per determinare il numero medio di pneumococchi nell'inoculo che rappresenta il tempo necessario per completare l'intera procedura.
    1. Preparare un inoculo, diluendo la concentrazione desiderata, ed eseguire quantificazione mediante il metodo M & M per il conteggio "pre-inoculo".
    2. Nel nostro centro di ricerca clinica ci vuole la squadra 30 minuti per completare l'intera procedura di inoculazione. Pnsospensioni eumococcal in soluzione salina di solito mostrano una ridotta conta in questo intervallo. Per tenere conto di questo, lasciare l'inoculo diluito a temperatura ambiente per 30 minuti e quindi eseguire una quantificazione "post-inoculazione" dei batteri dalla M & M metodo.
    3. Fare la media della prima e dopo per determinare la concentrazione finale inoculato. Regolare il tempo di "seduta" in base al protocollo clinico, ma mantenere l'intervallo più breve possibile.
  12. Tutti i supporti nuovi devono essere inviati ad un laboratorio di riferimento per la conferma della purezza stock e identità.

3. Preparazione dell'inoculo

  1. Preparazione dell'inoculo dovrebbe iniziare 30 minuti prima dell'appuntamento in programma volontario inoculazione.
  2. Prendete uno dei tubi di archivi precedentemente effettuati fuori dal congelatore a -80 ° C, scongelare e far girare il tubo in microcentrifuga a 17.000 xg per 3 min.
  3. Warm piastre di agar sangue nel 37 ° C incubatore. Preparareuna piastra a 96 pozzetti per la quantificazione dei batteri con il metodo M & M e preparare provette di diluizione in base alla dose desiderata.
  4. Rimuovere il surnatante brodo dal tubo centrifugato e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione salina. Questa fase rimuove il brodo dall'inoculo.
  5. Ripetere la fase di centrifugazione.
  6. Rimuovere il surnatante salina e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione salina.
  7. Eseguire serie di diluizione per la concentrazione dell'inoculo desiderato e quantificare da M & M metodo.
  8. Prendere l'inoculo alla nomina volontario e dopo inoculando i volontari, ripetere la quantificazione al laboratorio. Etichettare la provetta con la data e la dose di inoculo e conservare a -80 ° C.
  9. Per assicurare la coerenza dall'inoculazione alla inoculazione, è importante usare le stesse pipette e apparecchiature di laboratorio dedicato ogni volta.

4. Inoculazione

  1. I volontari deve essere seduto comodamente in una posizione semi-sdraiata.
  2. Lentamente espellere l'inoculo sulla mucosa nasale con un movimento circolare.
  3. È fondamentale che la punta della pipetta non venga a contatto con la mucosa nasale come una rottura nel integrità dell'epitelio potrebbe causare i batteri che entrano nel flusso sanguigno.
  4. È inoltre indispensabile che l'inoculo non è posizionato troppo lontano o si potrebbe scaricare la gola, che dovrebbe risiedere all'interno della cavità nasale.
  5. Ripetere l'operazione per l'altra narice.
  6. Avere il volontario rimangono nella posizione semi-sdraiata per 10 minuti senza sniffing o soffiando il naso. Questo permette di tempo per i batteri per disperdere attraverso la mucosa.

5. Monitoraggio

  1. I volontari sono monitorati giornalmente dopo l'inoculazione. Questo include un messaggio giornaliero di testo inviato dal volontario agli investigatori prima di 02:00.
  2. Se il testo is non ricevuto dal 02:00 il volontario sarà contattato per assicurare la sua / il suo benessere. Se lui / lei non risponde, il prossimo assegnato parente sarà contattato per garantire il volontario benessere.
  3. I volontari sono tenuti a segnalare in qualsiasi sintomo del tratto respiratorio superiore ad ogni appuntamento. Personale clinico chiederà al volontario di descrivere il suo / i suoi sintomi e seguirà eventuali reclami.
  4. Gli antibiotici somministrati ai volontari sono solo da prendere in tre circostanze, nel caso in cui non sta bene e sono incaricati di portarli dal gruppo di ricerca, se si stanno portando pneumococco alla fine dello studio, o se non sta bene e in grado di contattare il team di ricerca. Il volontario è incoraggiato a mantenere questo gruppo di emergenza con loro in ogni momento nel corso dello studio, ed è invitato a contattare il team di ricerca su base giornaliera per i prossimi 7 giorni.
  5. Il nostro team è disponibile 24/7 con contatto infermiere durante l'orario di lavoro e due medici disponibili su hours. Tutte le query sono trattate da chiamata telefonica e / o revisione immediata. Le disposizioni sono disponibili per l'immediata, ammissione diretta ad un reparto di malattie infettive, se necessario.

6. Lavaggio nasale (NW) Procedura

  1. Lavaggi nasali (NW) vengono eseguiti in una visita di screening iniziale, così come 48 ore, 7, e 14 giorni dopo l'inoculazione. Il metodo utilizzato NW è tratto da Naclerio et al. 8 volontari colonizzata naturalmente, da S. pneumoniae sono esclusi dalla inoculazione e follow-up.
  2. Il volontario è seduto comodamente e la testa è inclinata indietro di 30 ° rispetto alla verticale.
  3. Chiedere al volontario di fare un respiro profondo e trattenere il respiro mentre spingendo la loro lingua su e indietro contro il tetto della bocca. Mentre in questa posizione, il volontario viene chiesto di segnalare che sono pronti.
  4. Una siringa riempita con 20 ml di soluzione salina viene inserito nello spazio nasale anteriore e 5 ml di soluzione fisiologica viene espulso. Il volunteer poi si china in avanti immediatamente ed espelle il fluido da espirare rapidamente attraverso il naso in una ciotola di alluminio.
  5. Ripetere questa procedura tre volte in modo che ciascuna narice è stato lavato due volte e l'intero 20 ml è stato usato.
  6. Pool insieme tutti i campioni in una provetta da centrifuga e inviare al laboratorio a temperatura ambiente per l'elaborazione.

7. Lavaggio nasale Elaborazione

  1. Centrifugare i campioni per 10 minuti a 3345 x g.
  2. Rimuovere il surnatante e negozio come aliquote da 1 ml in provette Eppendorf etichettati a -80 ° C.
  3. Aggiungere 100 ml di STGG media 9 al pellet e mescolare accuratamente. Assicurarsi che il volume totale nel tubo a questo punto è determinato. Questa diluizione sarà utilizzato nel calcolo CFU di una carrozza positiva NW.
  4. Piastra a 20 microlitri della goccia STGG contenente il sedimento risospeso su una piastra di agar sangue contenente gentamicina e strisciare l'intera piastra.
    1. Se il NW è post-inoculazione, Rimuovere 10 ml dal STGG contenente il sedimento risospeso e l'utilizzo per la quantificazione batterica da M & M metodo.
  5. Aggiungere altri 800 ml di STGG al tubo NW e mescolare accuratamente.
  6. Tavola 25 pl su una piastra di agar sangue e 25 pl su una piastra di agar cioccolato, striature l'intera piastra.
  7. Dividere i batteri quantità rimanenti sospese in STGG medio in 2 cryovials e conservare a -80 ° C.
  8. Incubare le piastre a 37 ° C per una notte in 5% CO 2.
  9. Esaminare le piastre il giorno successivo per pneumococco e altri patogeni respiratori potenziali.
  10. Pneumococchi sono identificati su piastre da morfologia delle colonie. Alpha colonie emolitiche con morfologia relatore sono sub-coltura su agar sangue con un disco all'optochina e incubate per una notte.
  11. Presunti colonie pneumococco che sono all'optochina sensibili Gram sono macchiati di confermare diplococchi Gram-positivi e sierotipizzato utilizzando il Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.

Representative Results

Abbiamo esperienza di inoculo 159 persone, di cui 35 hanno portato pneumococco. La dose più bassa abbiamo raggiunto il trasporto con l'utilizzo di sierotipo 6B era 11.100 ufc/100 microlitri per narice, la dose massima è 313 mila ufc/100 microlitri per ogni narice. La dose più bassa abbiamo raggiunto il trasporto con l'utilizzo di sierotipo 23F era 9000 ufc/100 microlitri per narice, la dose massima è 84.500 ufc/100 microlitri per ogni narice.

Il nostro metodo di valutazione il trasporto è un lavaggio nasale, scelto perché un recente studio 10 ha mostrato che il 91% dei volontari trovato lavaggio nasale per essere più comodo di tampone nasofaringeo, il lavaggio nasale era anche più probabilità di rilevare gli agenti patogeni mediante coltura microbiologica. Flora microbica recuperati su piastre di agar sangue inoculati con NO può essere variabile e difficile da leggere. Gentamicina viene utilizzato sulla prima piastra di agar sangue per selezionare per pneumococco. La piastra di agar cioccolato e la seconda piastra di agar sangue sono utilizzati per rilevare altri potenziale percorso respiratoriaOgens che possono aiutare o ostacolare la colonizzazione da pneumococco. Un esempio di una piastra di agar sangue inoculato con NO che è facile da leggere è mostrato in Figura 1a; una piastra difficile contenente numerosi tipi di flora è mostrato in Figura 1b.

Ad ogni appuntamento i volontari è stato chiesto di descrivere i sintomi del tratto respiratorio superiore, se presente, e il confronto tra vettori e non sono stati evidenziati vettori. Delle 145 persone recentemente inoculati con pneumococco, 28 lamentato sintomi (Tabella 1). Otto di questi erano portatori, 20 non erano. I sintomi più comuni sono stati i sintomi nasali non specifici (Tabella 1). Tra i casi in cui sono stati segnalati sintomi sistemici, quali febbre e / o malessere, nessuna delle indagini avviate hanno mostrato evidenza di malattie da pneumococco e sintomi erano coerenti con concomitante infezione virale, tranne in un caso di tonsillite. Due pneumococcica positivvolontari elettronici sono stati trattati con antibiotici. Uno si lamentava del mal di gola e mal di orecchio e, dopo l'incontro con il medico dello studio, è stato consigliato di prendere antibiotici per precauzione. Il volontario altra è stata diagnosticata clinicamente con tonsillite. Tutti i volontari avevano una rapida risoluzione dei sintomi.

Figura 1
Figura 1. Agar sangue piastra inoculata con NW. Piastre di agar sangue inoculate con NO può essere difficile da leggere. 1a è un esempio di una piastra che è facile da leggere con ben visibile pneumococchi. 1b è una piastra con un sacco di co-colonizzatrici flora rendendo più difficile rilevare se è presente pneumococchi.

Sintomi Trasporto (n = 32) No trasporto (n = 112)
Tuttisintomi 24% 18%
Sistemico Febbre 3% 4%
Malessere * 9% 4%
Locale Orecchie 9% 3%
Naso 0 10%
Gola 12% 3%

Tabella 1. Caratterizzazione dei volontari ha riferito sintomi dopo S. pneumoniae 6B inoculazione. Tutti i reclami sono stati esaminati dal comitato di sicurezza esterno e, a seguito di indagini complete, nessun sintomo sono stati attribuiti a malattie da pneumococco. I sintomi più comuni sono mal di gola, naso e farcito malattia simil-influenzale.

Discussion

La piattaforma EHPC ha una serie di potenziali utilizzi, compreso l'uso come modello vaccino mucosale e come surrogato di protezione per testare vaccini nuova proteina. Il metodo dipende da una tecnica di inoculazione coerente e di alta qualità NW.

La riproducibilità può essere un problema con l'inoculo. A causa della natura variabile delle aliquote congelate batteriche, può essere difficile da replicare la dose desiderata. Un dimezzamento o raddoppio della dose desiderata viene considerato nel raggio d'azione. È fondamentale che la quantificazione batterica essere fatto immediatamente prima e dopo l'inoculazione, per determinare con precisione la quantificazione dei batteri da CFU conteggio. Per questo motivo può essere utile se appuntamenti volontari verificarsi simultaneamente in modo che solo un inoculo occorre elaborare e la placcatura quantificazione, prima e dopo l'inoculazione avviene non più di 30 min a parte.

Il metodo richiede la coope NWrazione del volontario e non sarebbe un metodo ideale nei bambini. Se la resa è inferiore a 5 ml, la procedura può essere ripetuta utilizzando fino a un extra 20 ml. Indossare protesi può ridurre la resa NW. Se il volontario ha un bloccata / naso congestionato e la soluzione salina sta per scadere anteriormente dopo l'inserimento, soffiare il naso, inserire la siringa un po 'più indietro, e inclinare la testa indietro di più se necessario.

Il NO è una tecnica che migliora con la pratica. Certo volume di solito essere perso così l'obiettivo è per un ritorno di almeno 10 ml. Se il volontario può gustare salina durante il NW quindi la connessione tra il rinofaringe e dell'orofaringe posteriore non è stato adeguatamente chiusa dalla lingua del volontario. Se il volontario ingoia la maggior parte della soluzione salina, spiegare di nuovo la procedura, sottolineando la spinta della lingua contro il palato. Ripetere la procedura per aumentare il volume restituito.

Se il NW contiene un substantial quantità di muco, è consigliabile rimuoverla prima della centrifugazione. Vortex il campione in modo da allentare tutto ciò che potrebbe essere legato al muco e quindi rimuovere il maggior numero di pezzi di grandi dimensioni il più possibile durante la rimozione come soluzione salina meno possibile.

Un precedente studio EHPC negli Stati Uniti è stato completato in modo sicuro e non ha avuto eventi avversi 11. Per garantirne la sicurezza permanente della piattaforma EHPC, abbiamo messo a punto un protocollo di emergenza che si basa intorno a 24 ore l'accesso al gruppo di ricerca. I volontari sono date informazioni di contatto, consentendo loro l'accesso al gruppo di ricerca 24 ore al giorno. Tutte le cure mediche necessarie sono fornite in la Royal Liverpool University Hospital. Come ulteriore misura di protezione, un comitato di sicurezza composto da medici e scienziati al di fuori del gruppo di ricerca riceve un rapporto settimanale di sicurezza. Il rapporto contiene la dose batterica ogni volontario ha ricevuto e se alcuni sintomi o malattia sono stati segnalati. Questo rapporto consente la sicurezza del secolostudio e di essere criticato dall'esterno senza pregiudizi. Il comitato di sicurezza sono disponibili anche 24 ore al giorno nel caso improbabile di emergenza.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalla Bill e Melinda Gates Foundation (premio Grand Challenge esplorazione a SBG), il National Institutes for Health Research (NIHR), Centro di ricerca biomedica in Malattie microbiche, e il Comprehensive Research Network NIHR locale. Riconosciamo il NWDA per il supporto infrastrutturale. Ringraziamo il Prof. J. N Weiser, University of Pennsylvania e il Prof. P Hermans, Università di Nijmegen per i pneumococchi isolati. Grazie al Comitato per la sicurezza EHPC per il loro sostegno e consulenza, a tutti i nostri volontari per la loro partecipazione e per Mathieu Bangert per scattare le foto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Fisher G/0650/08
0.9% Sodium Chloride B. Braun 3627667
Skim milk powder Fluka 70166
Tryptone soya broth Becton Dickinson 211768
Glucose BDH 284504S
Columbia Agar with chocolated horse blood Oxoid PB0124
Pneumotest-latex kit Statens Serum Institut 51823

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References

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