Summary
Transporte Experimental neumocócica humanos ofrece un modelo natural de carro y un modelo potencial para su uso en el desarrollo de vacunas. Esta técnica es valiosa aún complejo y conlleva un riesgo clínico mediante la introducción de un agente patógeno en un ser humano. Hemos desarrollado un protocolo detallado.
Abstract
Transporte Experimental neumocócica humano (EHPC) es científicamente importante porque portador nasofaríngeo de Streptococcus pneumoniae es a la vez la principal fuente de transmisión y el requisito previo de la enfermedad invasiva. Un modelo de transporte permitirá la determinación precisa de las correlaciones inmunológicas de protección, el efecto inmunizante de transporte y el efecto de la presión de host en el patógeno en el nicho de la nasofaringe. Además, los métodos de detección de transporte útil en estudios epidemiológicos, incluyendo los estudios de vacunas, se pueden comparar.
Objetivo
Nuestro objetivo es desarrollar una plataforma EHPC que es un método reproducible segura y útil que se podría utilizar para selecciona a las vacunas neumocócicas nuevo candidato con la prevención de transporte como un sustituto de la inmunidad inducida por la vacuna. Se trabajará para pruebas de vacunas y la descripción de los mecanismos que subyacen EHPC y protección de la vacuna de Carriage 1. Las actuales vacunas conjugadas contra el neumococo proteger a los niños contra la enfermedad invasiva aunque las vacunas se necesitan urgentemente nuevas como la actual vacuna no confiere protección óptima contra la neumonía no bacteriémica y no ha habido evidencia de sustitución de serotipos por serotipos no vacunales 2-4.
Método
Nos inocular con S. pneumoniae en suspensión en 100 l de solución salina. La seguridad es un factor importante en el desarrollo del modelo de EHPC y se logra mediante el cribado voluntario intensivo y seguimiento. Un comité de seguridad formado por médicos y científicos que son independientes del estudio proporciona información objetiva sobre una base semanal.
El inóculo bacteriano estandarizado y requiere que ningún producto animal se inoculan en los voluntarios (de origen vegetal medios de comunicación y de solución salina). Las dosis necesarias para la colonización (10 4 -10 5) son muy inferiores THAn las utilizadas en modelos animales (7 10) 5. Detección de carga neumocócica se ve reforzada por un alto volumen (lo ideal es> 10 ml) de lavado nasal de moco que es relativamente libre. Este protocolo se ocupará de los aspectos más importantes del mismo a su vez. Estos son: (a) la selección de voluntarios, (b) la preparación del inóculo neumocócica, la inoculación (c), (d) el seguimiento y (e) la detección de carro.
Resultados
Nuestro protocolo actual ha sido seguro en más de 100 voluntarios en un rango de dosis utilizando dos diferentes serotipos bacterianos 6. Un estudio de rango de dosis con S. pneumoniae 6B y 23F se está realizando actualmente para determinar la dosis óptima para la inoculación de 50% de carro. Una tasa prevista del 50% del transporte permitirá que el modelo EHPC tener una alta sensibilidad para la eficacia de la vacuna con un número pequeño estudio.
Protocol
1. Voluntarios de Selección y Evaluación
- Los voluntarios sanos son reclutados a través de anuncios y carteles en la web de la Universidad de acuerdo con la investigación del NHS y la orientación del Comité de Ética.
- Los criterios de inclusión para la participación son:
- Los adultos de 18-60 años.
- Habla con fluidez Inglés y es capaz de comunicarse con facilidad tanto por teléfono móvil y mensajes de texto.
- Los criterios de exclusión de participación son las siguientes:
- El contacto estrecho con individuos en riesgo (niños, adultos inmunosuprimidos, la salud ancianos, enfermos crónicos).
- Actual fumador o significativa historia de tabaquismo (> 10 paquetes).
- El asma u otras enfermedades respiratorias.
- Embarazo.
- La alergia a la penicilina o amoxicilina.
- Participación actual en otro ensayo clínico observacional o menos en la no-intervencionista fase.
- Incapaz de dar un consentimiento plenamente informado.
- Una visita de selección inicial, aproximadamente una semana antes de la inoculación, incluye una historia clínica y exploración enfocada clínicas específicas.
- Si previamente no reconocido se encuentra algo anormal, el voluntario será excluido del estudio y la investigación correspondiente se organizarán a través de la atención primaria.
- Durante el cribado inicial visitar un conteo sanguíneo completo se obtiene para asegurar que el recuento de glóbulos blancos está dentro del rango normal antes de la visita de la inoculación. Un lavado nasal se realiza para excluir portadores naturales de neumococo (ver 6.1).
- Antes de la inoculación, los voluntarios están educados sobre los riesgos que implica la participación en el estudio y se les proporciona un prospecto de emergencia, termómetro digital, teléfonos de emergencia y 3 días de curso de la amoxicilina.
2. Preparación de las poblaciones de inoculación
- Preparación de las poblaciones de inoculación debe realizarse en un ambiente limpio. Las pipetas usadas sólo se deben utilizard para la preparación del inóculo. Todo el vidrio y artículos de plástico deben ser estériles. Se recomienda que las poblaciones de inoculación se preparó en una sala específica, utilizando una campana de humos y dedicado incubadora.
- Cepas neumocócicas se inocularon en una placa de agar sangre. Las placas se incubaron a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. El día después de que todas las bacterias se rasparon de la placa de agar sangre y se inocularon en un sistema de stock preservación talón. Se trata de poblaciones de cuentas se utilizan para la preparación de la inoculación de valores. Prueba de los stocks de perlas para la contaminación y la uniformidad colonia antes de preparar un stock de inoculación.
- Para preparar el stock de la inoculación, inocular una placa de agar sangre con dos talones de la serotipo deseado Imágenes neumocócica talón, en estrías para cubrir toda la placa. Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. Todas las incubaciones posteriores se utilizan estas mismas condiciones. También se incuban los medios de comunicación Vegitone durante la noche para garantizar la esterilidad.
- El hisopo mañana siguientela mitad de la placa, no teniendo cuidado de eliminar cualquier agar sangre, y añadir a 12 ml de caldo Vegitone pre-calentado. Repita con la otra mitad de la placa. Agregar los dos viales de 12 ml a 37 ° C durante 2 horas o hasta que un cambio en la turbidez se hace evidente, lo que ocurra primero.
- Añadir los 12 ml a 40 ml de caldo Vegitone pre-calentado y mezclar bien. Repita para el otro 12 ml frasco. Este es el punto de tiempo = 0. Eliminar 100 l para leer la densidad óptica (DO) a 600 nm. Eliminar 20 l para la cuantificación de las bacterias a la unidad formadora de colonias (CFU) recuento utilizando una variación del método de Miles y Misra (M & M) 7. Incubar ambos viales.
- Para el M & M, dividir una placa de agar sangre en seis secciones. Añadir 180 l de PBS estéril a seis pocillos de una placa de 96 pocillos (de fondo en U). Añadir 20 l de caldo a la parte superior del pozo y mezclar. Diluciones seriadas de las muestras 1:10 en seis ocasiones y descartar 20 l del pozo sexto. Coloque tres gotas 10 mu l de la parte superior del pozo en la sección primera de laplaca de agar sangre. Repita el procedimiento para los cinco otros pozos. Asegúrese de que la placa está seca antes de que se invirtieron y se incubaron.
- Al día siguiente, contar el número de colonias visibles en cada sección de dilución y el registro. Usando la sección de dilución con un recuento de entre 30 y 300, se divide el número de colonias visibles por tres para obtener una media.
- Multiplicar el número medio de colonias por el factor de dilución y se divide por 10 (la cantidad de la caída de 10 l). Esto da UFC / l.
- Multiplique este número por 1.000 para obtener UFC / ml.
- Realizar lecturas de DO 600 y cuantificación de bacterias por M & M método cada hora hasta principios de fase semilogarítmica se alcanza una DO de 0,25.
- Una vez que se alcanza este OD, añadir glicerol esterilizado 10% a un vial y preparar alícuotas de 1 ml. Tienda de alícuotas a -80 ° C.
- Para una acción más concentrada, centrifugar el otro vial en 3.345 xg durante 15 min y separar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 22,5 ml de Vegitone medio y agregar 10% de glicerol. Preparar alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C.
- Deja existencias a -80 ° C durante al menos 48 horas antes de descongelar y cuantificar.
- Cuantificar la población bacteriana congelado por el método M & M. Pon a prueba tres tubos de valores de forma individual para asegurar la reproducibilidad. Utilizar el valor obtenido para diluir la acción a la concentración de inóculo deseada en solución salina, como se describe a continuación.
- Para la inoculación, la cantidad de neumococos en el inóculo es calculado antes y después de la inoculación. Esta cuantificación de bacterias por el método de M & M se utiliza para determinar el número medio de neumococos en el inóculo que representa el tiempo que tarda en completar todo el procedimiento.
- Preparar un inóculo, diluir a la concentración deseada, y llevar a cabo la cuantificación por el método de M & M para el "pre-inoculación" recuento.
- En nuestro Centro de Investigación Clínica que tarda el equipo de 30 minutos para completar el procedimiento de inoculación entero. Pneumococcal suspensiones en solución salina por lo general muestran una disminución en el recuento en este intervalo. Para dar cuenta de esto, deje encendido el inóculo diluido a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego realizar una "post-inoculación" cuantificación de las bacterias por el método M & M.
- Tomar el promedio de la antes y después para determinar la concentración final inoculado. Ajuste el "sentadas" tiempo de acuerdo con el protocolo clínico, pero mantener el intervalo tan breve como sea posible.
- Todos los stocks nuevos deben enviarse a un laboratorio de referencia para la confirmación de la pureza y la identidad de stock.
3. Preparación del inóculo
- Preparación del inóculo debe comenzar 30 min antes de la cita programada voluntario inoculación.
- Tomar una de las trompas de valores previamente hechas de la -80 ° C congelador, se descongela y gire el tubo en la microcentrífuga a 17.000 xg durante 3 min.
- Warm placas de agar sangre en la incubadora a 37 ° C. Prepararuna placa de 96 pocillos para la cuantificación bacteriana por el método de M & M y preparar los tubos de dilución de acuerdo con la dosis deseada.
- Quitar el sobrenadante del tubo de caldo centrifugado y resuspender el sedimento en 1 ml de solución salina. Este paso elimina el caldo del inóculo.
- Repetir el paso de centrifugación.
- Eliminar el sobrenadante salina y resuspender el sedimento en 1 ml de solución salina.
- Realizar conjunto dilución de la concentración de inóculo deseado y cuantificar por M & M método.
- Tome el inóculo para la designación voluntaria y después de la inoculación de los voluntarios, repita la cuantificación en el laboratorio. Marque el tubo con la fecha y la dosis de inóculo y se almacena a -80 ° C.
- Para garantizar la coherencia de la inoculación de la inoculación, es importante utilizar las mismas pipetas y equipo de laboratorio dedicado cada vez.
4. Inoculación
- Los voluntarios deben estar sentados cómodamente en una posición semi-reclinada.
- Lentamente expulsar el inóculo en la mucosa nasal con un movimiento circular.
- Es crucial que la punta de la pipeta no entre en contacto con la mucosa nasal como una interrupción en la integridad del epitelio podría resultar en las bacterias que entran en el torrente sanguíneo.
- También es vital que el inóculo no está demasiado lejos o se ejecutará en la garganta, sino que debe residir en el interior de la cavidad nasal.
- Repita para el otro naris.
- Haga que el voluntario permanezca en la posición semi-sentado por 10 minutos sin aspirar o soplar por la nariz. Esto permite tiempo para que las bacterias se dispersan a través de la mucosa.
5. Monitoreo
- Los voluntarios son supervisados diariamente después de la inoculación. Esto incluye un mensaje de texto enviado por el diario voluntario a los investigadores antes de las 2 pm.
- Si el texto is no ha recibido de las 2 pm el voluntario será contactado para asegurar su / su bienestar. Si él / ella no responde, el próximo asignado familiares serán contactados para asegurar el voluntario de bienestar.
- Los voluntarios se les pidió que informaran sobre cualquier síntomas del tracto respiratorio superior en cada cita. El personal clínico le pedirá al voluntario para describir sus / sus síntomas y realizará un seguimiento de las denuncias.
- Los antibióticos administrados a los voluntarios sólo deben tomarse bajo tres circunstancias: en caso de que no se sienten bien y tienen instrucciones de llevarlos por el equipo de investigación, si llevan neumococo al final del estudio, o si no se sienten bien y no puede comunicarse con el equipo de investigación. El voluntario se le anima a mantener este paquete de emergencia con ellos en todo momento durante el estudio y está en contacto con el equipo de investigación sobre una base diaria para los próximos 7 días.
- Nuestro equipo está disponible 24/7 con contactos enfermera durante las horas de trabajo y disponibles dos médicos de hours. Todas las consultas son atendidas por llamada telefónica y / o revisión inmediata. Las disposiciones están disponibles para la admisión inmediata y directa a una sala de Enfermedades Infecciosas, si es necesario.
6. Nasal Wash (NW) Procedimiento
- Los lavados nasales (NW) se realizan a una visita de cribado inicial, así como de 48 hr, 7, y 14 días después de la inoculación. El método utilizado NW se toma de Naclerio et al. 8 Voluntarios naturalmente colonizados por S. pneumoniae se excluyen de la inoculación y seguimiento.
- El voluntario se sienta cómodamente y la cabeza inclinada hacia atrás 30 ° respecto a la vertical.
- Pida al voluntario que tomar una respiración profunda y aguantar la respiración mientras empuja la lengua hacia arriba y hacia atrás contra el techo de la boca. Mientras en esta posición, el voluntario se le pide a la señal de que están listos.
- Una jeringa llena con 20 ml de solución salina se inserta en el espacio nasal anterior y 5 ml de solución salina es expulsado. El volunteer luego se inclina hacia adelante inmediatamente y expulsa el líquido exhalando rápidamente por la nariz en un recipiente de aluminio.
- Repita este procedimiento 3 veces más para que cada fosa nasal ha sido lavadas dos veces y el completo de 20 ml se ha utilizado.
- Piscina todas las muestras juntas en un tubo de centrífuga y se envía al laboratorio a temperatura ambiente para su procesamiento.
7. Nasal Wash Procesamiento
- Centrifugar las muestras durante 10 min a 3.345 x g.
- Eliminar el sobrenadante y almacena como alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf etiquetados a -80 ° C.
- Añadir 100 l de medio LTGG 9 al sedimento y mezclar bien. Asegúrese de que el volumen total en el tubo en este punto se determina. Esta dilución se utiliza en el cálculo de la UFC de un carro positivo NW.
- Placa de una caída de 20 l de la LTGG que contiene el sedimento resuspendido en una placa de agar sangre que contiene gentamicina y racha de toda la placa.
- Si el NO es posterior a la inoculación, Retirar 10 l de la LTGG que contiene el precipitado resuspendido y de uso para la cuantificación de bacterias por M & M método.
- Añadir otra l 800 de LTGG al tubo NW y mezclar bien.
- Placa de 25 l en una placa de agar sangre y 25 l en una placa de agar chocolate, rayando la placa entera.
- Divida la bacteria cantidad restante en suspensión en medio LTGG en 2 crioviales y almacenar a -80 ° C.
- Incubar las placas a 37 ° C durante la noche en 5% de CO 2.
- Examinar las placas al día siguiente por neumococo y otros patógenos respiratorios potenciales.
- Los neumococos son identificados en las placas de morfología de las colonias. Alpha colonias hemolíticas con morfología ponente se subcultivan en agar sangre con un disco optoquina y se incubaron durante la noche.
- Presuntos colonias neumocócicas que son sensibles optoquina se tiñen Gram para confirmar diplococos Gram positivos y serotipificación con el Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.
Representative Results
Tenemos experiencia inoculando 159 personas, de las cuales 35 han llevado a neumococo. La dosis más baja que hemos logrado con el uso de transporte serotipo 6B era 11.100 UFC/100 l por fosa nasal, la dosis más alta era 313.000 UFC/100 l por fosa nasal. La dosis más baja que hemos logrado con el uso de transporte serotipo 23F fue 9.000 UFC/100 l por fosa nasal, la dosis más alta era 84.500 UFC/100 l por fosa nasal.
Nuestro método de evaluación del transporte es un lavado nasal, elegido por un estudio reciente 10 demostró que el 91% de los voluntarios encontraron lavado nasal a ser más cómodo que hisopado nasofaríngeo, el lavado nasal fue también más probabilidades de detectar patógenos mediante cultivo microbiológico. Flora microbiana recuperados en placas de agar sangre inoculadas con NO puede ser variable y difícil de leer. La gentamicina se utiliza en la placa de agar sangre primero para seleccionar el neumococo. La placa de agar chocolate y la segunda placa de agar sangre se utilizan para detectar otro camino respiratorio potencialOgens que pueden ayudar o dificultar la colonización neumocócica. Un ejemplo de una placa de agar sangre inoculadas con NW que es fácil de leer se muestra en la Figura 1a; una placa difícil que contiene numerosos tipos de flora se muestra en la Figura 1b.
En cada cita los voluntarios se les pidió que describa los síntomas del tracto respiratorio superior, si está presente, y las comparaciones entre los portadores y no portadores se destacó. De las 145 personas recientemente inoculados con neumococo, 28 se quejaron de los síntomas (Tabla 1). Ocho de ellos eran portadores, veinte no lo eran. Los síntomas más comunes fueron síntomas no específicos nasales (tabla 1). De los casos en que no se informaron síntomas sistémicos, como fiebre y / o malestar general, ninguna de las investigaciones llevadas a cabo mostraron evidencia de enfermedad neumocócica y los síntomas eran compatibles con la infección viral concurrente, salvo en un caso de amigdalitis. Dos neumocócica positivVoluntarios fueron tratados con antibióticos. Uno se quejaba de dolor de garganta y dolor de oído y, después de reunirse con el médico del estudio, se les recomienda tomar antibióticos como medida de precaución. El otro voluntario fue diagnosticado clínicamente con amigdalitis. Todos los voluntarios tuvieron una rápida resolución de los síntomas.
Figura 1. Placa de agar sangre inoculadas con NW. Placas de agar sangre inoculadas con NO puede ser difícil de leer. 1a es un ejemplo de una placa que es fácil de leer claramente visible con neumococos. 1b es una placa con un montón de co-colonizadoras flora por lo que es más difíciles de detectar si está presente neumococos.
| Síntomas | Transporte (n = 32) | No Carriage (n = 112) | |
| Todossíntomas | 24% | 18% | |
| Sistémico | Fiebre | 3% | 4% |
| Malestar * | 9% | 4% | |
| Local | Orejas | 9% | 3% |
| Nariz | 0 | 10% | |
| Garganta | 12% | 3% |
Tabla 1. Caracterización de los voluntarios reportaron síntomas después de S. pneumoniae 6B inoculación. Todas las quejas fueron revisados por el comité de seguridad externo y, a raíz de una investigación exhaustiva, sin síntomas se atribuyen a la enfermedad neumocócica. Los síntomas más comunes fueron dolor de garganta, congestión nasal y la enfermedad similar a la gripe.
Discussion
La plataforma EHPC tiene un número de usos potenciales, incluyendo su uso como un modelo de vacuna mucosa y como un sustituto de la protección para el ensayo de vacunas nuevas proteínas. El método depende de una técnica de inoculación consistente y una alta calidad NW.
La reproducibilidad puede ser un problema con el inóculo. Debido a la naturaleza variable de las alícuotas congeladas bacterianas, puede ser difícil de replicar la dosis deseada. Una reducción a la mitad o duplicación de la dosis deseada se considera dentro del alcance. Es crucial que la cuantificación bacteriana hacerse inmediatamente antes y después de la inoculación, con el fin de determinar con precisión la cuantificación de las bacterias mediante recuento de CFU. Por esta razón, puede ser útil si las citas voluntarios ocurrir simultáneamente de modo que sólo un inóculo necesita ser preparado y el forro cuantificación hecho antes y después de la inoculación ocurre no más de 30 min aparte.
El método NO requiere la cooperación del voluntario y no sería un método ideal en niños. Si el rendimiento es menor que 5 ml, el procedimiento se puede repetir utilizando hasta un extra de 20 ml. Dentadura postiza puede reducir el rendimiento NW. Si el voluntario tiene un bloqueo / nariz congestionada y la solución salina se acaba anterior después de la inserción, sonarse la nariz, inserte la jeringa un poco más atrás, e incline la cabeza hacia atrás más si es necesario.
El NO es una técnica que mejora con la práctica. Algunos volumen por lo general se pierde de modo que el objetivo es lograr un rendimiento de al menos 10 ml. Si el voluntario puede degustar salina durante el NW entonces la conexión entre la nasofaringe y orofaringe posterior no ha sido adecuadamente cerraron por la lengua del voluntario. Si el voluntario se traga la mayoría de la solución salina, explicar el procedimiento de nuevo, haciendo hincapié en el empuje de la lengua contra el paladar de la boca. A continuación, repita el procedimiento para aumentar el volumen devuelto.
Si el NW contiene una substantial cantidad de moco, lo mejor es quitarlo antes de la centrifugación. Vortex la muestra así como para aflojar cualquier cosa que pueda unirse a la mucosa y luego eliminar la mayor cantidad de las piezas grandes como sea posible mientras se quita como solución salina poco como sea posible.
Un estudio previo EHPC en los EE.UU. se completó de manera segura y no tuvieron eventos adversos 11. Para garantizar la seguridad permanente de la plataforma EHPC, hemos puesto en marcha un protocolo de emergencia que se basa en el acceso las 24 horas al equipo de investigación. Los voluntarios reciben datos de contacto, permitiéndoles el acceso al equipo de investigación de 24 horas al día. Cualquier cuidado médico necesario se proporciona en el Royal Liverpool University Hospital. Como medida adicional de protección, un comité de seguridad formado por médicos y científicos de fuera del grupo de investigación recibe un informe de seguridad semanal. El informe contiene la dosis bacteriana cada voluntario recibió y si existen síntomas o enfermedades se informó. Este informe permite la seguridad de thestudio e para ser criticada externamente sin prejuicios. El comité de seguridad también están disponibles 24 horas al día en el improbable caso de una emergencia.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates Foundation (Gran Desafío Exploración premio a SBG), el Instituto Nacional para la Investigación en Salud (NIHR), el Centro de Investigación Biomédica en Enfermedades microbianas, y la Red de Investigación NIHR Integral Local. Queremos agradecer el apoyo de infraestructura para NWDA. Damos las gracias al Prof. J. Weiser N, de la Universidad de Pennsylvania y el Prof. P Hermans, de la Universidad de Nijmegen en los aislamientos de neumococo. Gracias al Comité de Seguridad EHPC por su apoyo y asesoramiento, a todos nuestros voluntarios por su participación y Mathieu Bangert para tomar las fotos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Fisher | G/0650/08 | |
| 0.9% Sodium Chloride | B. Braun | 3627667 | |
| Skim milk powder | Fluka | 70166 | |
| Tryptone soya broth | Becton Dickinson | 211768 | |
| Glucose | BDH | 284504S | |
| Columbia Agar with chocolated horse blood | Oxoid | PB0124 | |
| Pneumotest-latex kit | Statens Serum Institut | 51823 |
References
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