Summary
Мы опишем метод для отслеживания endomembrane вызванной разрывом внутриклеточных бактерий
Abstract
Шигеллы Флекснера являются патогенными бактериями, которые вторгаются в клетки-хозяева, входящих в эндоцитотический вакуоли. Впоследствии этот разрыв мембраны, закрытое отделение позволяет бактериям перемещаться в цитозоль, пролиферируют и дальнейшего вторжения соседних ячеек. Микобактерий туберкулеза фагоцитоз клетками иммунной системы, и недавно было показано, что разрыв мембраны phagosomal в макрофагах. Мы разработали надежный анализ для отслеживания phagosomal нарушения мембраны клетки-хозяина после вступления шигеллы Флекснера или микобактериями туберкулеза. Подходе используется CCF4, лад репортер чувствительны к β-лактамазы, что уравновешивает в цитозоле клеток-хозяев. После вторжения в клетки-хозяева, бактериальными патогенами, зонд остается неизменным, пока бактерии находятся в мембране закрытых отсеков. После разрушения вакуоль, β-лактамазу активность на поверхности внутриклеточных патогенов расщепляет CCF4 немедленно приведетING к потере FRET сигнала и переключение спектр ее излучения. Это надежное радиометрический анализ дает точную информацию о времени вакуоли разрыв индуцированной вторжения бактерий, и он может быть соединен с автоматизированной микроскопии и обработки изображений специализированных алгоритмов обнаружения излучения сигналов FRET донора и акцептора. Кроме того, оно позволяет исследовать динамику вакуоли разрушение вызванное внутриклеточных бактерий в режиме реального времени в отдельные клетки. Наконец, он идеально подходит для высокопроизводительного анализа с пространственно-временным разрешением, превышающим предыдущие методы. Здесь мы предоставляем экспериментальные детали примерных протоколов для CCF4 вакуолярных разрыва анализа на клетках HeLa и ТНР-1 макрофагами для покадровой экспериментов или конечными точками экспериментов с использованием шигеллы Флекснера, а также несколько штаммов микобактерий, таких как Mycobacterium Маринум, Mycobacterium Bovis, и микобактерий туберкулеза.
Introduction
Многочисленные бактериальных патогенов усваиваются в мембране закрытых отсеках эукариотических клеток во время их течения инфекции. Проникновение в клетку происходит либо путем фагоцитоза специализированных клетках-хозяевах, как это имеет место для микобактерий туберкулеза, которые поглощаются макрофагами, или патогенов вызывают их активное поглощение обычно в не-фагоцитов. В случае индуцированное поглощение, например, для шигелл Флекснера, патоген впрыскивает эффекторных белков в цитозоле, что хост захвата наряду с другими функциями клетки жестко регулируется машины endomembrane сортировки в результате локализации бактерий в эндосомного 1,2 отсека. Впоследствии, Shigella нарушает ограждающих мембраны приводит к разрыву и вакуолярных цитозольные доступ возбудителя вмешательства хозяина торговлей мембраны и избежать доставки в лизосомы. Совсем недавно phagolysosomal разрыв Также было обнаружено как инфекции улategy используются микобактерий туберкулеза, патогенный микроорганизм, который считался в течение длительного времени, чтобы быть локализован исключительно в пределах мембраносвязанные отсека 3,17.
Исследовать динамику торговли субклеточных мембран инвазивных патогенов, большие успехи были достигнуты с просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на основе исследований в конце 1980 4,5. Например, флуоресцентной микроскопии на основе методов, использующих красители, антитела против бактериальных компонентов поверхности или маркеров для совместной локализации с субклеточных отсеков взяла на 6,7. Тем не менее, они по-прежнему не дают точной пространственно-временной и надежности для измерения вакуолярных разрыва бактериальными патогенами количественно.
Это препятствие, была встречена с анализ, основанный на полученных цефалоспоринов CCF4-AM FRET репортера, который впервые был использован для изучения экспрессии генов 8. Затем он был использован в контексте инфперегиба биологии для расследования эффекторных секреции и следовать поглощение Neisseria в клетки-хозяева 9,10,11. Мы разработали анализ воспользовавшись этим репортером для изучения вакуолярных разрыва индуцированных шигеллы Флекснера 12 и микобактерий туберкулеза 17. Принцип нашего метода представлена на рисунке 1, используя шигеллы Флекснера. Во-первых, клетки-хозяева, которые загружаются с FRET CCF4-AM субстрат, который в ловушке внутри цитоплазмы после отщепления AM сложноэфирные остатки. Затем клетки инфицируют шигеллы Флекснера. β-лактамазы, присутствующих на поверхности бактерий способен расщеплять CCF4 подложки, как только вакуоли трещин. Это приводит к потере FRET сигнал переключения пик излучения от 535 нм до 450 нм при возбуждении зонда при 405 нм. Радиометрические измерения 450/535 нм интенсивность подчеркивает вакуолярных целостности: низкие коэффициенты отражают мембрана-анзакрытые или внутриклеточных бактерий, в то время как высокие коэффициенты отражают контакт между бактериями и хозяином цитозоле. Мы также сообщаем адаптации этого метода для изучения phagosomal разрыва индуцированных микобактерий туберкулеза в ТНР-1 макрофагами. Экспериментальные принципы остаются теми же хотя последовательность обратная, CCF4-AM загрузки применяется только после бактериальной инфекции.
Таким образом, количественный радиометрические измерения флуоресценции на уровне одной клетки, вакуоли разрыва шигелл Флекснера можно отслеживать в реальном времени и в фиксированных образцов из различных типов клеток 12,13,14. Кроме того, этот способ может быть адаптирован к ряду других инвазивных патогенов, как показано в этом исследовании с использованием Mycobacterium Bovis и микобактерий туберкулеза. Наконец, миниатюризация наш протокол до 96 хорошо (или 384 а) форматов позволяет скрининг многочисленных условий с высокой пропускной способностью.
Protocol
Анализ работ в различных форматах, однако мы рекомендуем сворачивают объему образца для сохранения реагентов, в частности CCF4-AM. Таким образом, следующие протокол описан в фиксированные клетки HeLa или ТНР-1 макрофагами, как клетки в 96-луночном формате, то для живых клеток HeLa в 35 мм чашки со стеклянным дном. Анализ может быть адаптирован для других патогенов. Кроме инфекцией Shigella, мы описываем анализ для ТНР-1 phagocytosing различных м у cobacterial штаммов.
Важно отметить, что после CCF4-АМ загрузки, все реагенты и буферы, включая стиральную буферы требуют присутствия пробенецида в концентрации 1 мМ. Пробенецид является ингибитором анионных каналов, что способствует удержанию цитозольного CCF4 в течение всех этапов протокола. Фиксированные образцы должны быть получены в течение нескольких часов после эксперимента с CCF4 сигнал не является стабильной в течение длительного периода времени.
1. CCF4 анализа на образцах с использованием фиксированной Shigella Flexneri (96-луночные планшеты)
- Подготовка бактерий для ночных культур. Посев бактериальной предварительно культур дикого типа (M90T AfaI) и мутантной (BS176 AfaI) штаммов 1 дня до заражения в 8 мл казеина триптического соевого бульона (TCSB), дополненной ампициллином (50 мкг / мл) в шейкере при 37 ° С в течение ночи .
- Покрытие клетки для инфекции. Семенной HeLa клеток в 96-луночных планшетах за 1 день до инфекции при плотности 5 × 10 3 клеток на лунку в среде DMEM, содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS) и 1% пенициллин-стрептомицин в 5% CO 2 инкубаторе в конечном объеме 100 мкл. В случае ТНР-1 макрофаг-подобные клетки, клеточные покрытие сделано два дня до заражения при плотности 5 × 10 4 клеток / лунку, и инкубировали с 30 нМ форболмиристатацетата (PMA) в среде RPMI, содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS), 1% пенициллин-стрептомицин и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола.
- Подготовка бактерий для субкультуры. Привить ночной бактериальной культурына разведение 1/100 в TCSB с добавлением 50 мкг / мл ампициллина в шейкере при 37 ° С в течение 2,5 ч (OD600 = от 0,3 до 0,4).
- Загрузка клеток с CCF4-AM. Подготовьте CCF4-АМ загрузки смеси для конечного объема 25 мкл на лунку, содержащем 1 мМ пробенецида (Sigma), 1,5 мкМ CCF4-AM (6 мкМ в случае ТНР-1) и 1,25 мкл загрузочного раствора В (100 мг / мл Pluronic F127-ПАВ в DMSO/0.1%-ной уксусной кислоты, при условии вдоль CCF4-AM LiveBlazer загрузки Комплект по Invitrogen) в EM-буфера (120 мМ NaCl, 7 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl 2, 0,8 мМ MgCl 2, 5 мМ глюкозы, 25 мМ HEPES при рН 7,3). Промыть клетки один раз PBS и добавляют 25 мкл CCF4-АМ загрузки смеси в лунку при комнатной температуре в темноте в течение 2,5 часа.
- Подготовка бактерий для инфекции. Спином 1 мл бактериальной субкультур при 9000 оборотах в минуту в течение 1 мин. Промывают один раз 500 мкл PBS, отжим на 9000 оборотов в минуту в течение 1 мин и ресуспендируют в 500 мкл PBS с добавлением 10 мкг / мл поли-L-лизина (Sigma) и 40 мкг / мл β-лактациитазе (Sigma). Через 10 мин инкубации на вращающемся колесе при комнатной температуре, мыть один раз 500 мкл PBS и ресуспендируют бактерий в 500 мкл буфера EM / 1 мМ пробенецида.
- Сотовые инфекции и фиксации. Промыть клетки один раз 150 мкл PBS мМ пробенецида / 1, готовят смесь 10 мкл бактерий ресуспендировали в конечном объеме 100 мкл буфера EM / 1 мМ пробенецида и распространить его на каждую лунку. После 15 мин инкубации в темноте при комнатной температуре, переключите пластины до 37 ° С в течение 1 часа (90 мин в случае ТНР-1), промывают 150 мкл PBS / 1 мМ пробенецида и исправить с 50 мкл параформальдегиде 4% / 1 мМ пробенецида в течение 10 мин в темноте. Затем, промывают 150 мкл PBS / 1 мМ пробенецида, инкубировать в течение 30 мин с 30 мкл 10 мкМ ядер краситель Draq5 (Biostatus), промывают 150 мкл PBS / 1 мМ пробенецида и оставить образцов в 100 мкл PBS / 1 мМ пробенецида.
- Приобретение основных параметров образцов. Приобретение осуществляется либо с помощью (I), перевернутый эпифлуоресцентной микроскопиисправиться с 20-кратным (0,5 числовая апертура (NA), 2.1 Рабочее расстояние (WD)) или 40x (0.75 NA, 0,72 WD) N-план воздуха объективным или (II) с помощью конфокальной микроскопии с 10x цели. Флуоресцентная микроскопия выполняется с возбуждением при 405 нм (Semrock, FF01-387/11-25) и выбросы обнаружены с помощью 450 нм (Semrock, FF02-447/60-25) и 535 нм фильтра (Semrock, FF01-520/35- 25) с помощью экспозиции 5 мсек (проходящий свет), 1000 мс (535 нм) и 500 мс (450 нм). Конфокальной изображения осуществляется с использованием следующих Выдержка: 240 мс (450 нм) и 360 мс (535 нм) для 405 нм лазер (870 мкВт), 640 мс (Draq5) для 640 нм лазер (2560 мкВт).
- После приобретения анализа. Впоследствии изображения анализируют с помощью компьютерных алгоритмов, что позволяет автоматизировать подсчет сигнала флуоресценции для каждой клетки. Программного обеспечения, таких как Metamorph 7.1 или Acapella может быть использован, чтобы создать сценарий для измерения соотношения между 450 и 535 нм излучения сигналов (по запросу). Следует отметить, что использование устройства фокус калибровки соединены с автоматизированной микроскопии при приобретении позволяет приобретение множества различных позициях в нескольких скважин одновременно.
2. CCF4 анализа на Живом образцов с использованием шигеллы Флекснера (35 мм со стеклянным дном Формат, Маттек)
- Подготовка бактерий для ночных культур. Продолжайте, как описано выше.
- Покрытие клетки для инфекции. Семенной HeLa клеток в 35 мм со стеклянным дном культуры блюд (Маттек 10 мм Microwell, Маттек корпорации) за 1 день до инфекции при плотности 2 × 10 5 клеток / блюдо в конечном объеме 2 мл.
- Подготовка бактерий для субкультуры. Продолжайте, как описано выше.
- Загрузка клеток с CCF4-AM. Подготовьте CCF-AM загрузкой смеси, как описано выше для конечного объема 2 мл на чашку. Перед установкой промыть клетки один раз PBS.
- Подготовка бактерий для инфекции. Продолжайте, как описано выше.
- Acquisitионных параметров живых образцов. Приобретение осуществляется в течение 60 мин каждые 90 сек с перевернутой эпифлуоресцентной микроскопа с использованием 20x (0,5 Н.А., 2.1 WD) или 40x (0.75 NA, 0,72 WD) N-плана Цель воздуха внутри камеры 37 ° C отопления. Флуоресцентная микроскопия выполняется с возбуждением при 405 нм (Semrock, FF01-387/11-25) и выбросы обнаружены с помощью 450 нм (Semrock, FF02-447/60-25) и 535 нм фильтра (Semrock, FF01-520/35- 25) с помощью экспозиции 5 мсек (проходящий свет), 200 мс (535 нм) и 100 мс (450 нм).
- Сотовые инфекции и живой приобретения. Вымойте клетки сразу с 2 мл PBS / 1 мМ пробенецида, добавляют 2 мл ЭМ / 1 мМ пробенецида, смонтировать блюдо на столик микроскопа и начать приобретения. Через 6 минут (время пункт 4), положить приобретение на удержание, добавить 250 мкл ресуспендирование бактериями в верхней части клетки и перезапустить приобретения.
- После приобретения анализа. Фильмы могут быть визуализированы с помощью Metamorph или ImageJ. 450/535 нм соотношение интенсивностей для каждого индивидуальноедвойной клетки могут быть получены с использованием ImageJ. Как упоминалось ранее, использование устройства фокус калибровки соединены с автоматизированной микроскопии при приобретении позволяет приобретение нескольких различных позициях в зависимости от покадровой.
3. CCF4 анализа на образцах с использованием фиксированной Микобактерии (96 луночный)
- Подготовка бактерий. Расти штаммов микобактерий в середине логарифмической фазы в 7H9 содержащего альбумин декстроза каталазы (АЦП) при 30 ° С (для Mycobacterium Маринум) или 37 ° С (для Mycobacterium Bovis БЦЖ и микобактерий туберкулеза).
- Покрытие клетки для инфекции. Пластина ТНР-1 макрофагами 2 дня до заражения инкубации их с 30 нМ РМА в среде RPMI, содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола в 5% CO 2 инкубаторе в конечном объеме 100 мкл при плотности 5 × 10 4 клеток / лунку.
- Подготовка бактерий для инфекции. HarvПредполагаемое культур, мыть и ресуспендируют в PBS перед обработкой ультразвуком и фильтровали через шприц во избежание слипания. Определяют концентрацию каждого штамма OD600 измерения и инфицировать клетки ТНР-1 при MOI 1:1 при 30 ° С (для Mycobacterium Маринум) или 37 ° С (для Mycobacterium Bovis БЦЖ и микобактерий туберкулеза) в среде, среде RPMI с добавлением 5% CO 2. Через 2 часа Удалите среду, промыть 3 раза PBS и добавить полную свежей среды от 1 до 2 дней (в случае Mycobacterium Маринум) или от 3 до 7 дней (в случае Mycobacterium Bovis БЦЖ и микобактерий туберкулеза).
- Загрузка клеток с CCF4-AM и фиксации. Промыть клетки один раз ЗФР и подготовить CCF4-АМ загрузки смеси, как описано выше для конечного объема 25 мкл на лунку использованием CCF4-AM конечной концентрации 6 мкМ. Загрузка происходит при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч, а затем промывали 150 мкл PBS / 1 мМ пробенецида и исправитьAtion с использованием 50 мкл параформальдегидом в 4% дополнена with1 мМ пробенецида в течение 30 мин в темноте. После этого вымойте с 150 мкл PBS пробенецида ммоль / 1 и оставить образцы в 100 мкл PBS / 1 мМ пробенецида.
- Приобретение настройки и после приобретения анализа. Продолжайте, как описано ранее в первом абзаце использованием шигеллы Флекснера.
Справочная протокола
Флуориметрический анализы проводят с целью проверки β-лактамазу активность на поверхности бактерий. Это должно быть сделано для каждого бактериального штамма, предназначенного для использования в описанном анализе. Для этого промытый бактерий в контакт с 100 нМ CCF4-AM (Invitrogen), 50 мкг / мл эстеразы свиной печени экстрактов (сигма) в 1 мл PBS в течение 1 часа при 37 ° С в темноте. Растворимые лактамазы 1 мг / мл (Invitrogen) может быть использован в качестве положительного контроля. Тогда, выбросов сканирования выполняется при 405 нм возбуждение, использующее флуориметра PTI Quantamaster и 1 мл квартаZ кюветы. Потеря FRET при 535 нм и появление высокой 450 нм пик визуализируются на бактерии дополнение к CCF4 зонда.
Representative Results
CCF4-AM/β-lactamase подход является надежным и чувствительным методом для отслеживания вакуолярных разрыва внутриклеточных патогенов, таких как шигеллы Флекснера (рис. 1). Shigella штаммы, используемые в этом исследовании, называют M90T AfaI и BS176 AfaI. M90T AfaI является штаммом шигеллы Флекснера, которая выражает адгезином AFAE, который способен эффективно связывать CD55 на поверхности эпителиальных клеток 15. Поэтому AFAE выражения штаммов отображать намного выше способности вторжение по сравнению с диким типом M90T деформации в эпителиальных клетках. BS176 AfaI является AFAE выражения мутантного штамма Shigella Флекснера лишенные вирулентности Shigella плазмиды. Этот штамм не может вторгнуться в клетки HeLa. Тем не менее этот штамм способен войти клетки ТНР-1, так как поглощение в этой клеточной линии полагаться только на классические фагоцитоза и не требуют функционального типа-3 секреции системы. Оба штамма выразить β-лактамазИ отображение β-лактамазу активность на их поверхности из-за наличия AFAE плазмиды, кодирующей. По клетки HeLa инфекции с неинвазивным BS176 AfaI штамм в течение 1 часа, CCF4 FRET зонд остается неизменным, как показано на рисунке 2а зеленого сигнала (535 нм). Напротив, инфекция с вирулентным штаммом M90T AfaI в течение 1 ч приводит к переключателю сигнала к синим (450 нм), выделяя расщеплением зонда в цитозоле. Для количественной оценки этого, мы разработали сценарий для Metamorph и Acapella программное обеспечение, которое позволяет автоматическое обнаружение клеток и измерение интенсивностей в 535 и 450 нм каналах для определения логометрических сигнала. Как показано на рисунке 2B, ядра и цитозоле клетки сегментируются использованием Draq5 канала. Затем алгоритм способен обнаруживать 450 нм и 535 нм положительных клеточных популяций для вычисления соотношения между интенсивностями для каждой отдельной ячейки, котораяпредставить в виде гистограммы на фиг.2С. Низкие коэффициенты, полученные для мутантного штамма по сравнению с высокими коэффициентами для вирулентных штамма. Хотя это репрезентативного эксперимента инфекция была приобретена с помощью конфокальной микроскопии эпифлуоресцентной микроскопии также подходит для выполнения этой задачи рисунках 3 и 4 показаны примеры с использованием 2 различных типов клеток человека:. Эпителиальных клеток HeLa и ТНР-1 макрофаг-подобные клетки. После инфицирования вирулентными M90T AfaI Shigella деформации в течение 1 ч и 90 мин для HeLa и клетки ТНР-1, переключатель сигнала с зеленым (535 нм), синий (450 нм) наблюдается по сравнению с BS176 AfaI инфицированные клетки (Фиг.3А и 4А). Сценарий был разработан на MetaMorph обеспечение обнаруживает непосредственно CCF4 положительный популяции клеток и расчета отношения интенсивностей в 450 и 535 нм каналах для каждой отдельной клетки. Затем клетки классифицируют в зависимости от их соотношение с использованием макросов развитпед в Excel, получая таким образом гистограммы, показывающие распределения клеток. Как это было в случае с другими сценарий разработан для Acapella, BS176 AfaI инфицированные клетки характеризуются низкими коэффициентами, в то время M90T AfaI инфицированные клетки проявляют высокую отношений с использованием алгоритма MetaMorph на клетках HeLa и ТНР-1 макрофагами (рис. 3В и 4В) . Наконец, адаптации этого метода к изучению микобактерий показано на рисунке 5. Mycobacterium Bovis БЦЖ находится в фагосомы в течение всего хода эксперимента, о чем свидетельствуют сильные 535 нм сигнал, обнаруженный на протяжении всего времени хода эксперимента. В противоположность этому, микобактерии туберкулеза вызывает phagosomal разрыве мембраны в ТНР-1 макрофагами после более чем 3 дней после заражения, были отмечены на 450 нм сигнал на 7 дней после заражения (рис. 5А и 5В). Используя тот же алгоритм для изучения вакуолярных разрыва шигеллами микобактерии туберкулеза инфицированные клетки демонстрируют более 450/535 нм соотношениях, чем Mycobacterium Bovis БЦЖ через 7 дней после заражения (рис. 5C и 5D).
Рисунок 1. Схема, представляющая принцип CCF4-AM/β-lactamase анализа для отслеживания шигелл Флекснера разрыв вакуоли. CCF4-AM свободно диффундирует через плазматическую мембрану в цитоплазму, где сложноэфирные остатки являются отщепляют цитозольных эстераз производства CCF4 анионов. Эта реакция CCF4 предотвращает попадание любого встроенного мембранного отсека. На этом этапе CCF4 вызывает FRET при 535 нм при возбуждении при 405 нм. Зонд не остается нетронутым до β-лактамаз бактерий выразив РуптуРE эндоцитотический вакуоли. На этом этапе FRET сигнал теряется из-за CCF4 расщепляется β-лактамазы срабатывание переключателя излучение от 535 нм до 450 нм при возбуждении при 405 нм.
Рисунок 2. Отслеживание шигеллы Флекснера вакуолярных разрыва с помощью конфокальной микроскопии. (А) Через 2 ч 30 мин CCF4-AM погрузки, клетки HeLa, инфицированных β-лактамазы выразив шигеллы Флекснера BS176 AfaI мутантный штамм или M90T AfaI вирулентным штаммом в течение 1 часа и фиксированной с использованием 4% параформальдегида в течение 10 мин. Затем ядра окрашиваются Draq5 и клетки визуализируют с помощью конфокальной микроскопии с 10x цели. Представитель фотографии были выбраны со следующими объединенной каналами: неповрежденную CCF4 зонда появляется при 535 нм (степеньN), расщепленный CCF4 зонда появляется при 450 нм (синий). (B) Примеры фотографий подчеркнув система обнаружения наших автоматизированных алгоритмов на программное обеспечение Acapella. Сегментация клеток (ядра + цитозоль) получают с использованием Draq5 канала. CCF4 позитивные клетки, полученные с использованием 450 и 535 нм каналы объединяются. (C) гистограмму, показывающую результат нашего автоматизированного анализа на Acapella использованием шигеллы Флекснера BS176 AfaI мутантный штамм или M90T AfaI вирулентным штаммом. Среднее отношение представляет собой соотношение между интенсивностью в 450 и 535 нм каналах. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Отслеживание Shigella ФЛЭxneri вакуолярных разрыва в клетках HeLa эпифлуоресцентной использованием микроскопа. (А) Через 2 ч 30 мин CCF4-AM погрузки, HeLa клетки инфицируют β-лактамазы выразив шигеллы Флекснера BS176 AfaI мутантный штамм или M90T AfaI вирулентным штаммом течение 1 ч и фиксируется с использованием 4% параформальдегида в течение 10 мин. Затем клетки отображаемого использованием эпифлуоресцентной микроскоп с 20-кратным цели. Представитель фотографии были выбраны со следующими каналами:. CCF4 нетронутыми зонда 535 нм (зеленый) и расщепленные CCF4 зонда 450 нм (синий) (B) Гистограмма являющийся итогом нашего автоматизированного анализа на программное обеспечение MetaMorph. Отдельные клетки распределены в зависимости от их соотношения интенсивностей в 450 и 535 нм каналах.
> Рисунок 4. Отслеживание шигеллы Флекснера вакуолярных разрыва в ТНР-1 клеток с использованием эпифлуоресцентной микроскопии. (А) Через 2 ч 30 мин CCF4-AM погрузки, клетки ТНР-1 инфицированных β-лактамазы выразив шигеллы Флекснера BS176 AfaI мутантный штамм или M90T AfaI вирулентным штаммом в течение 1 ч 30 мин и фиксированной использованием 4% параформальдегида в течение 10 мин. Затем клетки отображаемого использованием эпифлуоресцентной микроскоп с 20-кратным цели. Представитель фотографии были выбраны со следующими каналами:. CCF4 нетронутыми зонда 535 нм (зеленый) и расщепленные CCF4 зонда 450 нм (синий) (B) Гистограмма являющийся итогом нашего автоматизированного анализа с помощью программного обеспечения MetaMorph. Отдельные клетки распределены в зависимости от их соотношения интенсивностей в 450 и 535 нм каналах.
ghres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Отслеживание Mycobacterium Bovis БЦЖ и микобактерий туберкулеза phagosomal разрыва в ТНР-1 макрофагами использованием эпифлуоресцентной микроскопии. (A, B) клеток ТНР-1 инфицированных β-лактамазы выразив Mycobacterium Bovis БЦЖ или микобактериями туберкулеза в течение 2 часов и культивировали в течение 3 до 7 дней . После промывки клетки загружают CCF-4-AM течение 2 ч и фиксированный с использованием 4% параформальдегида в течение 30 минут перед визуализации с использованием эпифлуоресцентной микроскопа с 40x цели. Представитель фотографии были выбраны со следующими каналами: целая CCF4 зонд, 535 нм (зеленый); расщепленной CCF4, зонд 450 нм (синий) (C, D) гистограмм представляя результаты нашего анализа с использованием автоматизированной MetaMorph программного обеспечения.. Отдельные клетки распределены зависимости от соотношения между интенсивностью в 450 и 535 нм каналах.
Discussion
Анализ CCF4-AM/β-lactamase является простой метод для отслеживания вакуоли нарушения индуцированных внутриклеточных шигелл Флекснера и микобактерий в различных типах клеток. Это делает использование лактамазы, чувствительные цитоплазматической FRET репортер, который расщепляется ферментом активное на поверхности бактерий.
Потеря CCF4-AM подложки можно легко избежать путем добавления пробенецид, чтобы все решения после загрузки подложки. Как показано, анализ может быть адаптирована к многих типах клеток (эпителиальных клеток, фагоцитирующих клеток) и форматов (96, 35 мм со стеклянным дном посуды, 6/12/24 луночных планшетах). Для использования 6/12/24 луночный планшет, стерильные покровные распределены в нижней части каждой лунке перед посевом клеток. В конце эксперимента, покровные передаются на предметных стеклах в монтажной среде, такой как продлить Золото Реагент Antifade (Invitrogen). Таким образом, сигнал стабилен в течение длительного периода времени после анализапо сравнению с 96 скважин формат, где образцы сохранились в PBS после фиксации. Высокая стоимость CCF4-AM подложки должны быть приняты во внимание, прежде чем определение объема образца. Именно поэтому мы рекомендуем масштабирование их вниз. Эксперименты стоят дороже в формате 6/12/24 хорошо, но сигналы являются стабильными в течение нескольких дней. Напротив, эксперименты дешевле в 96-луночном формате, но образцы должны быть проанализированы в день эксперимента. Следует отметить, что живые эксперименты также может быть выполнена на 96 или 384 луночном формате. Это позволяет выполнять живой эксперимент с использованием десятков условий одновременно (мутантные бактерии, MOI, плазмиды или миРНК трансфекции, химикаты и т.д.) с номерами позиций на лунку. Хотя подходит для шигеллы Флекснера, мы подчеркиваем, что "истинный" реального времени или покадровой экспериментов не представляется возможным для исследования, так как микобактерии инфекционный цикл превышает измеряемых концентраций CCF4, которые могут быть сохранены в цитозоле. ДляПоэтому CCF4-AM подложку наносится на клетки только после того, как вторжение достигнута.
В случае MetaMorph программное обеспечение используется для сбора и анализа, мы рекомендуем использовать модуль "экран приобретения", что позволяет приобретение всей 96/384 луночный планшет с заданным числом картин на лунку. Кроме того, модуль "обзор данных экрана» позволяет (я) визуализации сшитые картины мозаики каждую лунку для любого канала одновременно на большом "сайт", и (II) цикл специализированный алгоритм для измерения интенсивностей в 535 и 450 нм каналах. Хотя, мы были в состоянии измерить вакуолярных разрыве одиночных бактерий использованием покадровой микроскопии, мы бы хотели предупредить Вас, что ферментативная активность на поверхности отдельных бактерий изменяется, что делает его трудно точно соотнести количество внутриклеточных бактерий и эффективность вакуолярных разрыву.
Принимая во внимание надежность анализа, он подходит для чIGH производительном подходе в 96 или 384 и форматов. Мы также успешно адаптировались этот протокол для FACS анализа для изучения инфекции клеток в суспензии 16. Этот анализ также может быть использован для исследования других бактерий или носителей представляет лактамазы на их поверхности, что приводит к широкий диапазон применений. Например, этот подход может быть использован для изучения вакуолярных разрыва индуцированных других патогенов, таких как β-лактамазы выразив легионелл, листерий или Salmonella Typhimurium 12. С листерий имеет короткий цикл инфекции сопоставимы с шигеллы Флекснера, покадровой эксперименты возможны. В противоположность этому, потому что легионелл и сальмонеллы Typhimurium показывать длинные циклы инфекции, мы предлагаем проводить эксперименты конечной точки.
Разнообразие возможных применений делает CCF4-AM/β-lactamase анализаинтересный флуорометрические метод для отслеживания вакуоли разрыв индуцированных внутриклеточных патогенов в фиксированных образцов или в реальном времени.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальным агентством Pour La Recherche и Европейским исследовательским советом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
