Summary
Vi beskriver en metode for å spore endomembransystemet brudd oppstår ved de intracellulære bakterier
Abstract
Shigella flexneri er sykdomsfremkallende bakterier som invaderer vertsceller inngår en endocytic vakuole. Deretter gjør at brudd på denne membranen lukkede kupé bakterier å flytte i cytosol, sprer og videre invadere nabolandet celler. Mycobacterium tuberculosis er phagocytosed av immunceller, og har nylig vist seg å sprekke phagosomal membran i makrofager. Vi utviklet en robust analyse for sporing phagosomal membran avbrudd etter vertscellen oppføring av Shigella flexneri eller Mycobacterium tuberculosis. Fremgangsmåten gjør bruk av CCF4, et FRET reporter følsom for β-laktamase som equilibrates i cytosol av vertsceller. Ved invasjon av vertsceller ved bakterielle patogener, forblir sonden intakt så lenge bakteriene ligge i membran-lukkede rom. Etter avbrudd av vakuole, β laktamase-aktivitet på overflaten av det intracellulære patogene spalter CCF4 øyeblikkelig føreing til tap av FRET signal og bytte sin emisjonsspekteret. Denne robuste proporsjonal analysen gir nøyaktig informasjon om tidspunktet for vacuolar brudd forårsaket av invaderende bakterier, og det kan kobles til automatisert mikroskopi og bildebehandling av spesielle algoritmer for deteksjon av utslipp signalene fra FRET donor og akseptor. Videre tillater det undersøkte dynamikken i vacuolar forstyrrelser fremkalt ved intracellulære bakterier i sanntid i enkeltceller. Til slutt, er det perfekt egnet for high-throughput analyser med en spatio-temporal oppløsning enn tidligere metoder. Her gir vi de eksperimentelle detaljer om eksemplarisk protokoller for CCF4 vacuolar brudd analysen på Jakten celler og THP-1 makrofager for time-lapse eksperimenter eller endepunkt eksperimenter med Shigella flexneri samt flere mykobakterielle stammer som Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, og Mycobacterium tuberculosis.
Introduction
Mange bakterielle patogener er internalisert i membran-lukkede avdelinger av eukaryote celler under løpet av infeksjonen. Celleinnskrift skjer enten gjennom fagocytose av spesialiserte vertsceller, slik tilfellet er for Mycobacterium tuberculosis som er inntatt av makrofager, eller patogener aktivt indusere deres opptak i typisk ikke-fagocytiske celler. I tilfelle av indusert opptak, for eksempel for Shigella flexneri, injiserer patogenet effektor proteiner i verten cytosol at overta blant annet cellefunksjoner den strengt regulert endomembransystemet sortering maskiner resulterer i bakteriell lokalisering innenfor et endosomale kammer 1,2. Deretter Shigella forstyrrer den omsluttende membranen fører til vacuolar brudd og cytosolic tilgang av organismen forstyrrer host membran trafficking og unngå levering til lysosomer. Mer nylig har phagolysosomal ruptur også blitt funnet som infeksjon strategy brukt av Mycobacterium tuberculosis, en patogen som var tenkt for en lang tid for å bli utelukkende lokalisert i en membran-bundet kammer 3,17.
For å undersøke dynamikken i subcellular membran smugling av invasive patogener, har store forbedringer er oppnådd siden transmisjonselektronmikroskopi (TEM) basert studier av slutten av 1980 4,5. For eksempel fluorescens mikroskopi baserte metoder ved hjelp av fargestoffer, tok antistoffer mot bakterielle overflaten komponenter, eller markører for samlokalisering med subcellular avdelinger enn 6,7. Men de fortsatt ikke gir presis tid og rom oppløsning og robusthet til å måle vacuolar ruptur av bakterielle patogener kvantitativt.
Dette hinderet er løst med en analyse basert på cephalosporin avledet CCF4-AM FRET reporter som først ble brukt til å studere genuttrykk åtte. Deretter ble det brukt i sammenheng med infection biologi for å undersøke effector sekresjon, og for å følge opptaket av Neisseria inn vertscellene 9,10,11. Vi utviklet en analyse dra nytte av denne reporter for å studere vacuolar brudd forårsaket av Shigella flexneri 12 og Mycobacterium tuberculosis 17. Prinsippet for foreliggende fremgangsmåte er beskrevet i figur 1 under anvendelse av Shigella flexneri. Først blir vertceller lastet med FRET CCF4-AM substrat som er fanget inne i cytoplasma etter spalte utenfor AM ester moieties. Deretter blir celler infisert med Shigella flexneri. β-laktamase tilstede på overflaten av bakteriene er i stand til å spalte den CCF4 substratet så snart som vacuolar ryker. Dette fører til et tap av FRET signalsvitsjepunktet den emisjonstopp fra 535 nm til 450 nm etter eksitasjon av sonden ved 405 nm. Den proporsjonal måling av de 450/535 nm intensiteter fremhever vacuolar integritet: lave forholdstall reflektere membran-enlukkede eller ekstracellulære bakterier mens høye prosenter gjenspeile kontakt mellom bakterier og verten cytosol. Vi rapporterer også en tilpasning av denne metoden for å studere phagosomal brudd forårsaket av Mycobacterium tuberculosis i THP-1 makrofager. De eksperimentelle prinsippene er de samme selv om sekvensen reverseres, CCF4-AM lasting påføres først etter bakteriell infeksjon.
Således, ved kvantitative Ratiometrisk fluorescens målinger på celle-nivå, kan det vacuolar ruptur av Shigella flexneri spores i sanntid og i faste prøver fra ulike celletyper 12,13,14. Videre kan denne fremgangsmåte tilpasses til en rekke andre invaderende patogener som vist i denne studien ved hjelp av Mycobacterium bovis og Mycobacterium tuberculosis. Endelig tillater miniatyrisering av vår protokollen til 96 brønn (eller 384 brønner) formater screening av en rekke betingelser med høy gjennomstrømning.
Protocol
Analysen fungerer i ulike formater, men vi anbefaler å skalere ned prøvevolum å spare reagenser, spesielt CCF4-AM. Derfor er den følgende protokoll beskrevet for faste HeLa-celler eller THP-1-makrofag-lignende celler i en 96-brønners format, da for live HeLa-celler i 35 mm glassbunn retter. Analysen kan tilpasses for andre patogener. Foruten Shigella-infeksjon, beskriver vi analysen for THP-1 phagocytosing forskjellige moh y cobacterial stammer.
Viktigere, etter CCF4-AM lasting, alle reagenser og buffere inkludert vaske buffere krever tilstedeværelse av probenecid på 1 mm. Probenecid er et anion kanal inhibitor som fremmer cytosolic oppbevaring av CCF4 gjennom alle trinnene i protokollen. Faste prøver skal være kjøpt i løpet av få timer etter forsøket siden CCF4 signalet ikke er stabilt over lengre tidsperioder.
En. CCF4 analysen på Faste prøver ved hjelp Shigella flexneri (96 brønners plater)
- Forbereder bakterier for overnatting kulturer. Inokuler bakterielle pre-kulturer villtype (M90T AfaI) og mutant (BS176 AfaI) stammer en dag før infeksjon i 8 ml tryptisk soyavekstmedium kasein (TCSB) supplert med ampicillin (50 ug / ml) i et risteapparat ved 37 ° C over natten .
- Plating celler for infeksjon. Seed HeLa-celler i 96 brønners plater 1 dag før infeksjon med en tetthet på 5 x 10 3 celler per brønn i DMEM inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% penicillin-streptomycin i en 5% CO2 inkubator i et sluttvolum av 100 pl. I tilfelle av THP-1-makrofag-lignende celler, blir celle plating utført to dager før infeksjon med en tetthet på 5 x 10 4 celler / brønn, og de blir inkubert med 30 nM forbolmyristatacetat (PMA) i RPMI inneholdende 10% kalvefosterserum (FCS), 1% penicillin-streptomycine og 0,05 mM 2-merkaptoetanol.
- Forbereder bakterier for subkultur. Vaksinere overnattingsturer bakteriekulturerved en 1/100 fortynning i TCSB supplert med 50 ug / ml ampicillin i et risteapparat ved 37 ° C i 2,5 time (OD600 = 0,3 til 0,4).
- Lasting celler med CCF4-AM. Klargjør CCF4-am lasting blanding for et endelig volum på 25 ul per brønn inneholdende 1 mM probenecid (Sigma), 1,5 mM CCF4-AM (6 uM i tilfellet av THP-1) og 1,25 mL av lasting oppløsning B (100 mg / ml Pluronic-F127 surfactant i DMSO/0.1% eddiksyre levert sammen CCF4-AM LiveBlazer Laster Kit av Invitrogen) i EM buffer (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glukose, 25 mMHEPES ved pH 7,3). Vask cellene en gang med PBS og tilsett 25 pl av CCF4-AM lasting blanding pr brønn ved romtemperatur i mørke i 2,5 timer.
- Forbereder bakterier for infeksjon. Sentrifugering 1 ml av bakterielle subkulturer ved 9000 opm i 1 min. Vask en gang med 500 pl PBS, sentrifugeres ved 9000 opm i 1 min og resuspender i 500 mL PBS supplert med 10 ug / ml poly-L-lysin (Sigma) og 40 ug / ml β-LACTAmase (Sigma). Etter 10 min med inkubasjon på et roterende hjul ved romtemperatur, vaskes en gang med 500 pl PBS og resuspender bakterier i 500 mL EM buffer / 1 mM probenecid.
- Cell infeksjon og fiksering. Vask cellene én gang med 150 pl PBS / 1 mM probenecid, tilberede en blanding av 10 mL av bakterier resuspendert i et sluttvolum på 100 ul buffer av EM / 1 mM probenecid og fordele det til hver brønn. Etter 15 min inkubering i mørket ved rom-temperatur, bryter platen til 37 ° C i 1 time (90 min i tilfelle av THP-1), vask med 150 pl PBS / 1 mM probenecid og fikse med 50 ul 4% paraformaldehyd / 1 mM probenecid i 10 min i mørket. Deretter vask med 150 mL PBS / 1 mM probenecid, inkuberes i 30 min med 30 pl av 10 mM kjerner fargestoff Draq5 (Biostatus), vask med 150 mL PBS / 1 mM probenecid og la prøvene i 100 mL PBS / 1 mM probenecid.
- Kjøp innstillinger av faste prøver. Kjøpet gjøres enten ved hjelp av (i) en omvendt epifluorescence microstakle en 20x (0.5 Numerisk Aperture (NA), 2,1 arbeidsavstand (WD)) eller 40x (0.75 NA, 0,72 WD) N-Plan luft objektiv eller (ii) med en konfokalmikroskop med et 10x objektiv. Fluorescens bildebehandling er utført med eksitasjon ved 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) og utslipp oppdages via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) og 535 nm filtre (Semrock, FF01-520/35- 25) med eksponeringstider av 5 ms (overført lys), 1000 ms (535 nm) og 500 msek (450 nm). Confocal bildebehandling er utført ved hjelp av følgende eksponeringstid: 240 ms (450 nm) og 360 msek (535 nm) for 405 nm laser (870 μW), 640 ms (Draq5) for 640 nm laser (2560 μW).
- Post-oppkjøp analyse. Deretter blir bildene analysert av en datamaskin algoritme som tillater automatisert scoring av fluorescens signal for hver individuelle celler. Programvare som Metamorph 7.1 eller Acapella kan brukes til å lage et skript for å måle forholdet mellom 450nm og 535nm utslipp signaler (tilgjengelig på forespørsel). Til opplysning, tillater bruk av et fokus kalibrering anordning koblet til mikroskopi under overtakelsen skaffe en rekke forskjellige stillinger i flere brønner samtidig.
2. CCF4 analysen på Live-prøver ved hjelp av Shigella flexneri (35 mm Glass-bottom Format, Mattek)
- Forbereder bakterier for overnatting kulturer. Fortsett som beskrevet tidligere.
- Plating celler for infeksjon. Seed HeLa-celler i 35 mm glassbunn kultur retter (Mattek 10 mm mikrobrønn, Mattek Corporation) 1 dag før infeksjon med en tetthet på 2 x 10 5 celler / oppvask i et endelig volum på 2 ml.
- Forbereder bakterier for subkultur. Fortsett som beskrevet tidligere.
- Lasting celler med CCF4-AM. Klargjør CCF-AM lasting blanding som tidligere beskrevet for et endelig volum på 2 ml pr fatet. Før lasting, vaske cellene gang med PBS.
- Forbereder bakterier for infeksjon. Fortsett som beskrevet tidligere.
- Acquisition innstillinger av levende eksempler. Kjøpet er gjennomført i 60 min hver 90 sek med en invertert epifluorescence mikroskop bruker en 20x (0,5 NA, 2.1 WD) eller en 40x (0.75 NA, 0,72 WD) N-Plan luft mål inne i en 37 ° C oppvarming kammer. Fluorescens bildebehandling er utført med eksitasjon ved 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) og utslipp oppdages via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) og 535 nm filtre (Semrock, FF01-520/35- 25) med eksponeringstider av 5 ms (overført lys), 200 ms (535 nm) og 100 msek (450 nm).
- Cell infeksjon og live oppkjøpet. Vask cellene gang med 2 ml PBS / 1 mM probenecid, tilsett 2 ml av EM / 1 mM probenecid, montere parabolen på scenen av mikroskopet og begynne oppkjøpet. Etter 6 min (tid punkt 4), legger oppkjøpet på vent, tilsett 250 mL av bakterier resuspendering på toppen av cellene og starter oppkjøpet.
- Post-oppkjøp analyse. Filmer kan bli visualisert ved hjelp Metamorph eller ImageJ. 450/535 nm intensitet forholdstall for hvert enkeltdual celle kan oppnås ved hjelp ImageJ. Som nevnt tidligere, tillater bruk av et fokus kalibrering anordning koblet til mikroskopi under overtakelsen anskaffe flere forskjellige posisjoner avhengig av time-lapse.
3. CCF4 analysen på Faste prøver ved hjelp Mykobakterier (96 brønns)
- Forbereder bakterier. Grow mykobakterielle stammer til mid-log fase i 7H9 inneholder albumin druesukker katalase (ADC) ved 30 ° C (for Mycobacterium marinum) eller 37 ° C (for Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis).
- Plating celler for infeksjon. Plate THP-1 makrofager to dager før infeksjon inkubere dem med 30 nM PMA i RPMI inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin og 0,05 mM 2-merkaptoetanol i en 5% CO2 inkubator i et sluttvolum på 100 ul ved en densitet på 5 x 10 4 celler / brønn.
- Forbereder bakterier for infeksjon. Harvest kulturer, vaske og resuspender med PBS før sonikering og filtrering gjennom en sprøyte for å unngå klumping. Bestemme konsentrasjonen av hver stamme ved OD600 måling og infisere THP-1-celler ved en MOI på 1:1 ved 30 ° C (for Mycobacterium marinum) eller 37 ° C (for Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis) i RPMI-medium med 5% CO 2. Etter 2 timer, fjern mediet, vask 3 ganger med PBS og tilsett friskt komplett medium i 1 til 2 dager (i tilfelle av Mycobacterium marinum) eller 3-7 dager (i tilfelle av Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis).
- Lasting celler med CCF4-AM og fiksering. Vask cellene en gang med PBS og forberede den CCF4-AM lasting blanding som tidligere beskrevet for et endelig volum på 25 ul per brønn med CCF4-AM endelig konsentrasjon på 6 pM. Laster finner sted ved romtemperatur i mørket i 2 timer før vask med 150 pl PBS / 1 mM probenecid og fikseasjon ved anvendelse av 50 pl 4% paraformaldehyd ved supplert with1 mM probenecid i 30 min i mørket. Deretter vask med 150 mL PBS / 1 mM probenecid og la prøvene i 100 mL PBS / 1 mM probenecid.
- Kjøp innstillinger og etter oppkjøpet analyse. Fortsett som tidligere beskrevet i første avsnitt ved hjelp av Shigella flexneri.
Supplerende protokollen
Fluorimetrisk assay blir utført for å sjekke β laktamase-aktivitet på overflaten av bakterier. Dette må gjøres for hver bakteriestamme ment å bli brukt i den beskrevne analyse. For dette formål blir vasket bakterier settes i kontakt med 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml porcine esterase lever-ekstrakter (Sigma) i 1 ml PBS i 1 time ved 37 ° C i mørke. Løselig laktamase 1 mg / ml (Invitrogen) kan anvendes som en positiv kontroll. Deretter blir et utslipp scan utført ved 405nm eksitasjon ved hjelp av en PTI Quantamaster fluorimeter og en 1 ml Quartz cuvette. Tapet av FRET ved 535 nm og utseendet til en høy 450 nm topp er visualisert på bakterier tillegg til den CCF4 sonde.
Representative Results
Den CCF4-AM/β-lactamase tilnærmingen er en robust og følsom metode for sporing vacuolar ruptur av intracellulære patogener som Shigella flexneri (figur 1). De Shigella stammer som er brukt i denne studien betegnes M90T AfaI og BS176 AfaI. M90T AfaI er en Shigella flexneri stamme som uttrykker adhesin AfaE, som er i stand til effektivt å binde CD55 på overflaten av epitelceller 15. Derfor AfaE uttrykkende stammer viser mye høyere invasjon egenskaper sammenlignet med villtype M90T belastning i epitelceller. BS176 AfaI er en AfaE uttrykke mutant Shigella flexneri belastning blottet for Shigella virulensplasmid. Denne belastningen er ikke i stand til å invadere HeLa-celler. Likevel er denne stammen er i stand til å gå inn THP-1-celler ettersom opptaket i denne cellelinje stole bare på klassisk fagocytose og krever ikke en funksjonell type-3 sekresjon system. Begge stammer uttrykke β-lactamase, Og displayet β-laktamase aktivitet på sin overflate på grunn av tilstedeværelsen av den AfaE koding plasmidet. Ved HeLa celle infeksjon med non-invasiv BS176 AfaI belastning i 1 time, den CCF4 FRET sonde forblir intakt, som vist i figur 2A ved den grønne signal (535 nm). Tvert imot fører infeksjon med virulent M90T AfaI belastning i 1 time til en bryter av signal mot blått (450 nm) fremhever spalting av sonden i cytosol. For å kvantifisere dette, har vi utviklet et script for Metamorph og Acapella programvare som lar automatisert deteksjon av celler og måling av intensitet i 535 og 450 nm kanaler for fastsettelse av proporsjonal signal. Som vist i figur 2B, kjerner og cytosol av cellene er segmentert ved hjelp av Draq5 kanal. Deretter, er algoritmen i stand til å gjenkjenne de 450 nm og 535 nm positive celle populasjoner for beregning av forhold mellom de to intensiteter for hver enkelt celle som errepresentert som et histogram i figur 2C. Lave forholdstall er innhentet for mutant belastningen versus høye prosenter for ondartet stamme. Mens denne representative infeksjon eksperiment ble oppnådd ved anvendelse av konfokal mikroskopi, er epifluorescence mikroskopi også egnet for denne oppgaven figurene 3 og 4 viser eksempler hvor to forskjellige humane celletyper:. HeLa epitelceller og THP-1-makrofag-lignende celler. Ved infeksjon med virulente M90T AfaI Shigella belastning for 1 time og 90 min for HeLa og THP-1 celler, en bryter for signal fra grønt (535 nm) til blå (450 nm) er observert i forhold til BS176 AfaI infiserte celler (figur 3A og 4A). Manuset vi utviklet på MetaMorph programvare oppdager direkte CCF4 positiv populasjon av celler og beregne forholdet mellom intensitet i 450 og 535 nm kanaler for hver individuelle celler. Deretter celler er klassifisert som en funksjon av forholdet mellom deres ved hjelp av en makro utvikledeped i Excel, og dermed gir histogrammer som viser cellen distribusjon. Som det har vært tilfelle for den andre script utviklet for Acapella, er BS176 AfaI infiserte celler preget av lave forholdstall, mens M90T AfaI infiserte celler viser høye prosenter ved hjelp av MetaMorph algoritmen på Jakten celler og THP-1 makrofager (figur 3B og 4B) . Til slutt, er en tilpasning av denne metoden til studiet av mykobakterier vist i figur 5.. Mycobacterium bovis BCG ligger i phagosome for hele løpet av forsøket, som reflekteres av den sterke 535 nm signalet detektert gjennom hele tidsforløpet av eksperimentet. I kontrast, utløser Mycobacterium tuberculosis phagosomal membran ruptur i THP-1 makrofager etter mer enn tre dager etter smitte som fremhevet av en 450 nm signal på 7 dager etter smitte (figur 5A og 5B). Ved hjelp av den samme algoritme som den som for å studere vacuolar ruptur av Shigella Mycobacterium tuberculosis infiserte celler viser høyere 450/535 nm prosenter enn Mycobacterium bovis BCG etter 7 dager etter smitte (Tall 5C og 5D).
Figur 1. Ordningen representerer prinsippet om CCF4-AM/β-lactamase analysen for sporing Shigella flexneri vacuolar ruptur. CCF4-AM diffunderer fritt gjennom plasma membranen inn i cytoplasma hvor ester grupper blir spaltet av ved cytosolic esterases produserer CCF4 anioner. Denne reaksjonen hindrer CCF4 å gå inn på membranen innebygd kupé. På dette trinnet utløser CCF4 FRET på 535 nm ved eksitasjon ved 405 nm. Sonden forblir intakt inntil β betalaktamaseproduserende uttrykker bakterier rupturE er endocytic vakuole. På dette trinn, FRET-signalet går tapt da CCF4 spaltes ved β-laktamase utløse en bryter i utslipp fra 535 nm til 450 nm ved eksitasjon ved 405 nm.
Figur 2. Sporing Shigella flexneri vacuolar ruptur hjelp konfokalmikroskopi. (A) Etter 2 t 30 min av CCF4-AM lasting, er HeLa celle infisert med β-lactamase uttrykke Shigella flexneri BS176 AfaI mutant belastningen eller M90T AfaI ondartet stamme for en time og fast ved anvendelse av 4% paraformaldehyd i 10 min. Deretter er atomkjerner farget med Draq5 og cellene blir avbildes med en konfokalmikroskop med et 10x objektiv. Representative bildene ble valgt med følgende sammenslåtte kanaler: intakt CCF4 probe vises på 535 nm (green), vises kløyvde CCF4 probe ved 450 nm (blå). (B) Eksempler på bilder som tydelig viser detection system av vårt automatiske algoritmen på Acapella programvare. Segmentering av cellene (atomkjerner + cytosol) blir oppnådd ved hjelp av Draq5 kanal. CCF4 positive celler er oppnådd ved å bruke 450 og 535 nm kanaler sammenslåtte sammen. (C) histogrammet viser resultatet av vår automatiserte analyser på Acapella hjelp Shigella flexneri BS176 AfaI mutant belastning eller M90T AfaI ondartet stamme. Gjennomsnittlig forhold utgjør forholdet mellom intensiteten i 450 og 535 nm kanaler. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Sporing Shigella flexneri vacuolar brudd i Hela celler ved hjelp epifluorescence mikroskopi. (A) Etter 2 t 30 min av CCF4-AM lasting, blir Jakten celler infisert med β-lactamase uttrykke Shigella flexneri BS176 AfaI mutant belastningen eller M90T AfaI ondartet stamme for 1 time og festes ved hjelp av 4% paraformaldehyd i 10 min. Deretter blir cellene avbildes med en epifluorescence mikroskop med 20x objektiv. Representative bildene ble valgt med følgende kanaler:. CCF4 intakt probe 535 nm (grønn) og CCF4 kløyvde probe 450 nm (blå) (B) histogrammet representerer utfallet av vår automatiserte analyser på MetaMorph programvare. De enkelte celler er fordelt i funksjon av deres forholdet mellom intensitetene i 450 og 535 nm kanaler.
> Figur 4. Sporing Shigella flexneri vacuolar brudd i THP-1 celler ved hjelp epifluorescence mikroskopi. (A) Etter 2 t 30 min av CCF4-AM lasting, THP-1 celler er infisert med β-lactamase uttrykke Shigella flexneri BS176 AfaI mutant belastningen eller M90T AfaI virulent stamme i 1 t 30 min og festes ved hjelp av 4% paraformaldehyd i 10 min. Deretter blir cellene avbildes med en epifluorescence mikroskop med 20x objektiv. Representative bildene ble valgt med følgende kanaler:. CCF4 intakt probe 535 nm (grønn) og CCF4 kløyvde probe 450 nm (blå) (B) histogrammet representerer utfallet av vår automatiserte analyser ved hjelp av MetaMorph programvare. De enkelte celler er fordelt i funksjon av deres forholdet mellom intensitetene i 450 og 535 nm kanaler.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
Figur 5. Sporing av Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis phagosomal brudd i THP-1 makrofager ved hjelp epifluorescence mikroskopi. (A, B) THP-1-celler infiseres med β-laktamase uttrykke Mycobacterium bovis BCG eller Mycobacterium tuberculosis i 2 timer og dyrket i 3 til 7 dager . Etter vask, er celler lastet med CCF-4-AM for 2 timer og fast bruker 4% paraformaldehyde i 30 min før bildebehandling ved hjelp av en epifluorescence mikroskop med 40x objektiv. Representative bildene ble valgt med følgende kanaler: intakt CCF4 probe, 535 nm (grønn), kløyvde CCF4, 450 probe nm (blå) (C, D) Histograms presentere utfallet av vår automatiserte analyser ved hjelp MetaMorph programvare.. Individuelle celler er fordelt som funksjon av forholdet mellom intensiteten i 450 og 535 nm kanaler.
Discussion
Den CCF4-AM/β-lactamase analysen er en grei metode for å spore vacuolar avbrudd forårsaket av intracellulære Shigella flexneri og mykobakterier i ulike celletyper. Den gjør bruk av en følsom laktamase cytoplasmisk FRET reporter som blir spaltet av et enzym som er aktivt på overflaten av bakteriene.
Tap av den CCF4-AM substrat kan lett unngås ved å tilsette probenecid for alle løsningene etter lasting av substratet. Som vist, kan analysen tilpasses flere celletyper (epitelceller, fagocyttiske celler) og formater (96 brønner, 35 mm glassbunn retter, 6/12/24 brønnplater). For bruk av den 6/12/24 brønn plate, blir sterile dekkglass fordelt på bunnen av hver brønn før såing av cellene. På slutten av forsøket, er Dekkglass overført på lysbilder i montering medium, for eksempel forlenge Gold Antifade Reagens (Invitrogen). På denne måten signalet er stabil i lengre tidsperioder etter at analysensammenlignet med 96 brønner format hvor prøvene er bevart i PBS etter fiksering. Den høye kostnaden for CCF4-AM underlaget bør tas i betraktning før fastsettelse av prøvevolum. Dette er grunnen til at vi anbefaler å skalere dem ned. Eksperimenter er dyrere i 6/12/24 godt format, men signalene er stabile i flere dager. Tvert imot, eksperimenter er billigere i 96 brønn format, men prøvene må analyseres på dagen for eksperimentet. Det er bemerkelsesverdig at virkelige eksperimenter kan også utføres ved 96 brønn eller 384 brønns format. Dette gjør opptre live eksperiment ved hjelp dusinvis av forholdene på samme tid (muterte bakterier, MOI, plasmid eller siRNA transfeksjon, kjemikalier etc.) med antall stillinger per brønn. Selv egnet for Shigella flexneri, merker vi at "true" sanntid eller time-lapse eksperimenter er ikke gjennomførbart for mykobakterier studier siden infeksjonen syklusen overstiger målbare konsentrasjoner av CCF4 som kan beholdes i cytosol. ForAv denne grunn er den CCF4-AM substrat påføres på cellene først etter invasjon er oppnådd.
I tilfelle MetaMorph programvare brukes for innhenting og tolkning, anbefaler vi at du bruker modulen "skjerm kjøpet" som gjør det mulig å anskaffe en hel 96/384 brønners plate med et bestemt antall bilder per brønn. Videre er modulen "gjennomgang skjermdata" lar (i) å visualisere den sammensatte bilde mosaikk av hver brønn for en hvilken som helst kanal på samme tid på en stor "plakat" og (ii) å feste en spesialisert algoritme for å måle intensiteten på 535 og de 450 nm kanaler. Selv om vi har vært i stand til å måle vacuolar ruptur av single bakterier ved hjelp av time-lapse mikroskopi, ønsker vi å advare at den enzymatiske aktiviteten på overflaten av enkelte bakterier varierer rendering det vanskelig å nøyaktig relatere antall intracellulære bakterier og effektiviteten av vacuolar ruptur.
Gitt robustheten av analysen, er det egnet for high gjennomstrømming nærmer seg i 96 eller 384 vel formater. Vi har også med hell tilpasset denne protokollen for FACS analyse for å studere infeksjon av celler i suspensjon 16. Målingen kan også anvendes for undersøkelse av andre bakterier eller bærere som presenterer laktamase på deres overflate, som fører til et bredt spekter av anvendelser. For eksempel kan denne tilnærming brukes til å studere vacuolar ruptur indusert av andre patogener som β-laktamase uttrykke Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes eller Salmonella typhimurium 12.. Siden Listeria monocytogenes har en kort infeksjon syklus sammenlignes med Shigella flexneri, time-lapse eksperimenter er mulige. I kontrast, fordi Legionella pneumophila og Salmonella typhimurium vise lange infeksjon sykluser, foreslår vi å utføre endepunktdata eksperimenter.
Mangfoldet av mulige bruksområder gjør CCF4-AM/β-lactamase analysen eninteressant fluorometrisk metode for sporing vacuolar brudd forårsaket av intracellulære patogener i faste prøver eller i sanntid.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Agence Nationale pour la Recherche og ved European Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
