Summary
Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya çıkarılan
Abstract
Shigella flexneri bir endositik vakuol içine giren ev sahibi hücrelerin istila patojen bakterilerdir. Bundan sonra, bu membran-kapalı bir bölme arasında kopma, bakteri sitoplazmada içinde hareket etmesine olanak sağlar çoğalır ve daha fazla komşu hücreleri istila. Mycobacterium tuberculosis bağışıklık hücreleri tarafından fagositozunu, ve yakın zamanda makrofajlarda kopma phagosomal membran gösterilmiştir. Biz Shigella flexneri veya Mycobacterium tuberculosis konak hücre girmesinden sonra phagosomal membran bozulması izlemek için sağlam bir test geliştirdi. Bu yaklaşım CCF4 kullanan bir ev sahibi hücrelerin sitoplazmasında dengeye β-laktamaz duyarlı muhabir FRET. Bakteri zarının-kapalı bölümlerinde bulunan gibi bakteriyel patojenler host hücreler ile işgal üzerine prob sürece bozulmadan kalır. Anında hücre içi patojen bölmektedir CCF4 yüzeyinde vakuol, β-laktamaz aktivitesinin bozulmasına yol sonrasinyal FRET kaybına ing ve emisyon spektrumu geçiş. Bu sağlam oranlı metrik test işgalci bakteriler tarafından oluşturulan vakuolar rüptürü zamanlaması hakkında doğru bilgi verir, ve en emisyon sinyallerinin tespiti için özel algoritmalar tarafından otomatik mikroskopi ve görüntü işleme için bağlanabilir verici ve alıcı FRET. Bunun da ötesinde, tek bir hücre içinde, gerçek zamanlı olarak hücre içi bakterilerin ortaya çıkardı vakuolar bozulma dinamiklerin incelenmesi sağlar. Son olarak, sahip olduğu önceki yöntemlerden aşan bir uzay-zaman çözünürlüğü ile yüksek verimlilik analizi için de uygundur. Burada, Shigella flexneri yanı sıra, Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, birden çok mikobakteriyel suşları kullanılarak zaman atlamalı deneyler ve bitiş noktaları deneyler için HeLa hücreleri ve THP-1, makrofajlar üzerindeki CCF4 vakuolar yırtılma testi için örnek teşkil eden protokoller deneysel ayrıntıları sunmaktadır ve Mycobacterium tuberculosis.
Introduction
Çok sayıda bakteriyel patojenler enfeksiyon ders sırasında ökaryot hücrelerin membran-kapalı bölümlerinde içselleştirilmiş vardır. Makrofajlar tarafından alındığında ya da patojen aktif tipik olmayan fagositik hücreler içine alımı meydana edilir, Mycobacterium tuberculosis için olduğu gibi hücre girişi, özel bir konakçı hücreler tarafından fagositoz yoluyla gerçekleşir. Bağlı alımı durumunda, Shigella flexneri örneğin, patojen diğer hücre fonksiyonlarının bir Endozomal bölgenin 1,2 olan bakteriyel yer belirleme sonuçlanan sıkı bir şekilde düzenlenmektedir endomembran sınıflandırıcı makineler arasında kaçırmak ana sitozolüne efektör protein enjekte eder. Daha sonra, Shigella vakuolar rüptürü ve ev sahibi membran ticareti ve lizozom kaçınılmalıdır teslim müdahale patojenin sitozolik erişim yol açan çevreleyen membran bozar. Daha yakın zamanlarda, phagolysosomal rüptürü da enfeksiyon str olarak bulunmuşturategy Mycobacterium tuberculosis, özel bir zar bağlı bölmesi 3,17 içinde yerelleştirilmesi için uzun bir süre için düşünülen bir patojen tarafından kullanılır.
Invaziv patojenlerin hücre içi membran kaçakçılığı dinamiğini incelemek için, büyük gelişmeler 4,5 1980'lerin çalışmaları göre transmisyon elektron mikroskobu (TEM) beri elde edilmiştir. Örneğin, boyalar kullanarak floresan mikroskop tabanlı yöntemler, bakteriyel yüzey bileşenler veya hücre içi bölmeli co-lokalizasyon için işaretleri karşı antikor 6,7 devraldı. Ancak, yine de hassas uzaysal çözünürlüğü ve kantitatif bakteriyel patojenler tarafından vakuolar rüptürü ölçmek için sağlamlık verim yok.
Bu engel ilk gen ekspresyon 8 incelemek için kullanılan sefalosporin FRET CCF4-AM elde muhabiri dayalı bir test ile ele alınmıştır. Daha sonra, bu inf bağlamında kullanılanection biyoloji efektör salgı araştırmak ve ev sahibi hücrelerin 9,10,11 içine Neisseria alımını takip etmek. Biz Shigella flexneri 12 ve Mycobacterium tuberculosis 17 ile oluşturulan vakuolar rüptürü çalışmak için bu muhabir yararlanarak bir test geliştirdi. Bizim metodun prensibi Shigella flexneri ile Şekil 1 'de tarif edilmektedir. İlk olarak, konak hücreler ve AM esterden kapalı parçalama sonrasında sitoplazması içine sıkışmış FRET CCF4-AM, alt-tabaka ile yüklenir. Daha sonra, hücreleri Shigella flexneri bulaşmış. bakteri yüzeyinde β-laktamaz mevcut en kısa sürede vakuolar kopma meydana gibi tutunmaya CCF4 yüzey yapabiliyor. Bu 405 nm'de prob uyarım üzerine 450 nm 535 nm emisyon pik anahtarlama FRET sinyal kaybına yol açar. 450/535 nm yoğunluklarının oranlı metrik ölçüm vakuoler bütünlüğünü vurgulamaktadır: düşük oranları membran-en yansıtacakyüksek oranda ise kapalı ya da hücre dışı bakteriler ve bakteri ana sitosol arasındaki temas yansıtmaktadır. Ayrıca THP-1 makrofaj içinde Mycobacterium tuberculosis tarafından uyarılan phagosomal rüptürü çalışmak için bu yöntemin bir uyum raporu. Sekansı CCF4-AM yükleme sadece bakteriyel enfeksiyon sonrası uygulanır, tersine çevrilir, ancak deney prensipler aynı kalır.
Böylece, tek hücre düzeyinde nicel rasyometrik floresan ölçümleri ile, Shigella flexneri en vakuolar rüptürü gerçek zamanlı olarak ve farklı hücre tipleri 12,13,14 gelen sabit örneklerinde izlenebilir. Ayrıca, bu yöntem, Mycobacterium bovis ve Mycobacterium tuberculosis kullanılarak bu çalışmada gösterildiği gibi, diğer invaziv patojenlerin bir dizi adapte edilebilir. Son olarak, iyi 96 (veya iyi 384) için protokol biçimleri minyatür yüksek kapasiteli çok sayıda koşulları tarama sağlar.
Protocol
Tahlil çeşitli biçimlerde çalışır, ancak biz özellikle reaktifler, CCF4-AM kaydetmek için örnek hacmi aşağı ölçeklendirme tavsiye ederiz. Bu nedenle, aşağıdaki protokol 35 mm ebadındaki bir cam alt yemekler canlı HeLa hücreleri, daha sonra da, 96 gözlü bir formatta, sabit ya da HeLa hücreleri THP-1 makrofaj-benzeri hücreler için açıklanmıştır. Tahlil, diğer patojenlerin için adapte edilebilir. Shigella enfeksiyonları yanı sıra, THP-1 phagocytosing farklı m-Y cobacterial suşları için analiz tarif eder.
Önemlisi, CCF4-AM yükleme sonra, yıkama tamponları dahil olmak üzere tüm reaktifler ve tamponlar 1 mM Probenesid varlığını gerektirir. Probenesid protokolünün tüm adımları boyunca CCF4 sitozolik tutma teşvik eden bir anyon kanalı inhibitörüdür. CCF4 sinyal uzun süreler için kararlı olmadığı için sabit örnekleri deney sonra birkaç saat içinde elde edilmelidir.
1. Shigella f kullanarak Sabit Örnekleri üzerinde CCF4 Testilexneri (96 Peki Tabaklar)
- Gece kültürler için bakteri hazırlanması. Bakteriyel ön-kültürler vahşi tip (M90T AfaI) ve mutant (BS176 AfaI) suşu 37 ° C'de gece boyunca bir çalkalayıcı ampisilin (50 ug / ml) ile desteklenmiş 8 ml triptik soya suyu kazein (TCSB) enfeksiyon 1 gün önce inoküle .
- Bulaşmasına Kaplama hücreleri. DMEM bir son hacim içinde,% 5 CO2 inkübatör içinde% 10 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren içinde oyuk başına 5 x 10 3 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalar, enfeksiyondan önce 1. gün Tohum HeLa hücrelerinde 100 ul. THP-1 makrofaj benzeri hücre durumunda, hücre kaplama 5 x 10 4 hücre / iyi bir yoğunlukta 2 gün enfeksiyondan önce yapılır, ve% 10 ihtiva eden RPMI içinde 30 nM'lik Forbol Miristat Asetat (PMA) ile inkübe edilir Fetal Buzağı Serumu (FCS),% 1 penisilin-streptomisin ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol.
- Alt kültür için bakteri hazırlanması. Gece bakteri kültürleri inoküle2.5 saat (OD600 = 0,3 ila 0,4) için 37 ° C de 50 mg / bir çalkalayıcı ml ampisilin ile desteklenmiş TCSB bir 1/100 dilüsyon.
- CCF4-AM ile hücreleri yükleniyor. De 1 mM probenesit (Sigma), 1.5 uM CCF4-AM (THP-1 durumunda, 6 mm) ve yükleme B çözeltisi, 1.25 ml (100 mg başına 25 ul'lik bir son hacim CCF4-AM yükleme karışımı hazırlamak EM / ml Invitrogen CCF4-AM LiveBlazer yükleme takımı boyunca temin DMSO/0.1% asetik asit içinde, Pluronic F 127-yüzey aktif madde) tampon maddesi (120 mM NaCl, 7 mM KCI, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) içinde de 25 mM HEPES. Bir kez PBS ile yıkayın ve hücreler, 2.5 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında oyuk başına CCF4-AM yükleme karışımı 25 ul ekleyin.
- Bakteri enfeksiyonu için hazırlanması. 1 dakika 9.000 rpm'de bakteriyel alt kültür 1 ml Spin. 10 ug / ml poli-L-lisin (Sigma) ve 40 ug / ml β-lacta ile takviye edilmiş 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve 1 dakika için 9000 rpm'de 500 ul PBS ile bir kez yıkayın sıkma(Sigma) mase. , Oda sıcaklığında, bir dönen bir tekerlek üzerinde inkübasyondan 10 dakika sonra, 500 ul EM tampon / 1 mM probenesit 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve bakteri ile bir kez yıkayın.
- Hücre enfeksiyon ve fiksasyon. 150 ul PBS / 1 mM probenesit ile bir kez yıkama hücreleri, EM tampon 100 ul / 1 mM probenesit bir son hacim içinde tekrar süspanse bakteri 10 ul bir karışımını hazırlamak ve her bir kuyuya dağıtın. , Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübasyondan sonra, 1 saat (THP-1 durumunda, 90 dakika) için 37 ° C ile plaka geçiş, 150 ul PBS / 1 mM probenesid ile yıkama ve 50 ul% 4 paraformaldehit ile düzeltmek / 1 mM, karanlıkta 10 dakika boyunca probenesid. Daha sonra, 10 uM çekirdekleri boya Draq5 (Biostatus) 30 ul ile 30 dakika inkübe edilir ve 150 ul PBS / 1 mM probenesit, ile yıkayın, 150 ul PBS / 1 mM probenesid ile yıkama ve 100 ul PBS / 1 mM probenesit örnekleri bırakın.
- Sabit örnekler alındıktan ayarları. Toplama ya (i), bir ters Epifloresans mikro kullanılarak gerçekleştirilir20x (0.5 Sayısal Diyafram (NA), 2.1 Çalışma Mesafesi (WD)) veya 40x (0.75 NA, 0.72 WD) N-Planı hava objektif ya da (ii) 10x objektif ile bir konfokal mikroskop kullanılarak baş. Floresan görüntüleme 405 nm uyarma ile yapılan (Semrock, FF01-387/11-25) ve emisyon 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) ve 535 nm filtreler (Semrock, yoluyla tespit edilir FF01-520/35- 5 msn (iletilen ışık), 1000 msn (535 nm) ve 500 msn (450 nm) pozlama süreleri kullanarak 25). 240 msn (450 nm) ve 640 nm lazer için 405 nm lazer (870 μW), 640 msn (Draq5) (2.560 μW) için 360 msn (535 nm): konfokal görüntüleme aşağıdaki pozlama süresi kullanılarak yapılır.
- Alım sonrası analizi. Bunun ardından, resim her bir hücre için floresans sinyalinin otomasyonlu bir puanlama sağlayan bir bilgisayar algoritması tarafından analiz edilmiştir. Bu Metamorph 7.1 veya Acapella olarak Yazılım (isteğe bağlı) 450nm ve 535nm emisyon sinyalleri arasındaki oranı ölçmek için bir komut dosyası oluşturmak için kullanılabilir. Not, satın alma sırasında otomatik mikroskopi bağlanmış bir odak kalibrasyon cihazının kullanımı aynı anda birden kuyularda farklı pozisyonlarda onlarca elde sağlar.
2. Shigella flexneri (35 mm Cam-alt Biçimi, Mattek) kullanarak Canlı Örnekleri üzerinde CCF4 Testi
- Gece kültürler için bakteri hazırlanması. Daha önce tarif edildiği gibi devam edin.
- Bulaşmasına Kaplama hücreleri. 2 x 10 5 hücre / 2 ml 'lik bir son hacim içinde, çanak bir yoğunlukta 35 mm ebadındaki bir cam alt kültür kaplarına (Mattek 10 mm Microwell, Mattek Corporation), enfeksiyondan önce 1. gün Tohum HeLa hücreleri.
- Alt kültür için bakteri hazırlanması. Daha önce tarif edildiği gibi devam edin.
- CCF4-AM ile hücreleri yükleniyor. Daha önce tabak başına 2 ml 'lik bir son hacim için tarif edildiği gibi CCF-AM yükleme karışım hazırlayın. Yüklemeden önce, bir kez PBS ile hücreleri yıkayın.
- Bakteri enfeksiyonu için hazırlanması. Daha önce tarif edildiği gibi devam edin.
- AcquisitCanlı örneklerinin iyon ayarlar. Toplama bir 37 ° C ısıtma odasının içine bir 20x (0.5 NA, 2.1 WD) veya 40x (0.75 NA, 0.72 WD) N-Planı hava objektif kullanarak ters Epifloresans mikroskop ile 60 dakika her 90 saniye için yapılır. Floresan görüntüleme 405 nm uyarma ile yapılan (Semrock, FF01-387/11-25) ve emisyon 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) ve 535 nm filtreler (Semrock, yoluyla tespit edilir FF01-520/35- 5 msn (iletilen ışık), 200 msn (535 nm) ve 100 msn (450 nm) pozlama süreleri kullanarak 25).
- Hücre enfeksiyon ve canlı satın alma. 2 ml PBS / 1 mM probenesid ile bir kez hücreleri yıkayın,, EM 2 ml / 1 mM probenesid ekleyin mikroskop sahnede çanak monte ve satın alma başlar. 6 dakika (zaman noktasında 4), beklemeye satın alma koymak sonra, hücreler üstünde bakteri tabanda 250 ul ekleyin ve satın alma yeniden başlatın.
- Alım sonrası analizi. Filmler Metamorph veya ImageJ kullanarak görüntülenebilir. Her vermemek için 450/535 nm şiddet oranlarıçift hücre ImageJ kullanılarak elde edilebilir. Daha önce de belirtildiği gibi, satın alma sırasında otomatik mikroskopi bağlanmış bir odak kalibrasyon cihazının kullanımı zaman atlamalı bağlı olarak birden fazla farklı pozisyonlarda edinme sağlar.
3. Kullanımı Sabit Örnekleri üzerinde CCF4 Testi Mikobakteriler (96 Peki Biçimi)
- Bakteri hazırlanması. Büyümek 30 ° C (Mycobacterium marinum için) veya 37 ° C (Mycobacterium bovis BCG ve Mycobacterium tuberculosis için) katalaz albümin dekstroz (ADC) içeren 7H9 içinde orta-log fazı için mikobakteri suşları.
- Bulaşmasına Kaplama hücreleri. 2 gün enfeksiyon önceki Levha THP-1 makrofajlar RPMI içinde 30 nM PMA% 10 içeren kuluçka Fetal Buzağı Serumu (FCS), bir nihai hacim içinde,% 5 CO2 inkübatör içinde% 1 penisilin-streptomisin ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol 5 x 10 4 hücre / iyi bir yoğunlukta 100 ul.
- Bakteri enfeksiyonu için hazırlanması. Harvest kültürleri, yıkama ve topaklanma önlemek amacıyla, bir şırınga aracılığıyla sonikasyon ve filtrasyon öncesi PBS ile tekrar süspansiyon haline getirin. OD600 ölçümü ile, her bir suş konsantrasyonunu belirlemek ve% 5 ile 30 ° C (Mycobacterium marinum için) veya RPMI ortamı içinde 37 ° C (Mycobacterium bovis BCG ve Mycobacterium tuberculosis için) bir MOI 1:1 az THP-1 hücreleri enfekte CO 2. 2 saat sonra, orta kaldırmak PBS ile 3 defa yıkanır ve 1-2 gün (Mycobacterium marinum olması durumunda) ya da 3-7 gün (Mycobacterium bovis BCG ve Mycobacterium tuberculosis durumunda) için tam taze ortam ilave edin.
- CCF4-AM ve tespit ile hücreleri yükleniyor. Bir kez PBS ile yıkayın ve hücreler daha önce 6 uM'lik bir CCF4-AM nihai konsantrasyon kullanarak oyuk başına 25 ul son hacim olması için tarif edildiği gibi CCF4-AM yükleme karışımı hazırlamak. Yükleme 150 ul PBS / 1 mM probenesit ile yıkanmadan önce 2 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında gerçekleşir ve düzeltmek% 4 paraformaldehid ile 50 ul ation karanlıkta 30 dakika boyunca with1 mM probenesid desteklenmiştir. Daha sonra, 150 ul PBS / 1 mM probenesid ile yıkayın ve 100 ul PBS / 1 mM probenesid örnekleri bırakın.
- Toplama ayarları ve alım sonrası analizi. Daha önce Shigella flexneri kullanarak ilk paragrafta açıklandığı gibi devam edin.
Ek protokolü
Fluorimetrik bakterilerin yüzeyinde β-laktamaz kontrol etmek için gerçekleştirilir. Bu tarif edilen analizde kullanılmak üzere tasarlanmış her bir bakteri suşu için yapılmalıdır. Bu amaç için, yıkanmış bakterilerin karanlık içinde 37 ° C 'de 1 saat süreyle 1 ml PBS içinde 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml domuz karaciğer esteraz özü (Sigma) ile temas halinde yerleştirilir. Çözünür laktamaz 1 mg / ml (Invitrogen), bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Daha sonra, bir emisyon taraması, bir PTI Quantamaster florimetresi ve 1 ml'lik bir litre kullanılarak 405nm uyarma gerçekleştirilirz küvet. Kaybı 535 nm'de FRET ve yüksek bir 450 nm tepe görünümünü CCF4 prob için bakteri ilave edildikten sonra görüntülenmiştir.
Representative Results
CCF4-AM/β-lactamase yaklaşım, Shigella flexneri (Şekil 1) olarak hücre içi patojenlerin vakuolar rüptürü takip etmek için sağlam ve hassas bir yöntemdir. Bu çalışmada kullanılan Shigella M90T AfaI ve BS176 AfaI adlandırılır. M90T AfaI verimli epitel hücrelerinin yüzeyinde 15 CD55 bağlamak yapabiliyor adhesin AfaE, ifade bir Shigella flexneri türdür. Bu nedenle AfaE ifade suşları epitel hücrelerinde vahşi tip M90T suşu ile karşılaştırıldığında çok daha yüksek bir istila özellikler gösterir. BS176 AfaI plazmid Shigella virülans yoksun mutant Shigella flexneri gerginlik ifade bir AfaE olduğunu. Bu gerginlik HeLa hücreleri işgal edemiyor. Yine de bu gerginlik bu hücre doğrultusunda alımı klasik fagositoz sadece güveniyor ve işlevsel bir tip-3 salgı sistemi gerektirmez çünkü THP-1 hücreleri girebilir. Her iki susun β-laktamaz ifadeVe plazmid AfaE kodlama bölgesinin varlığı nedeniyle, yüzey görüntülenmesinde β-laktamaz aktivitesi. 1 saat boyunca non-invazif BS176 AfaI suşu ile HeLa hücre enfeksiyonu üzerine, CCF4 yeşil sinyal (535 nm), Şekil 2A'da gösterildiği gibi, prob, FRET bozulmadan kalır. Aksine, 1 saat boyunca şiddetli M90T AfaI suşu ile enfeksiyon, sitoplazmada prob bölünme vurgulayarak mavi (450 nm'de) 'ya doğru sinyalin bir anahtar yol açar. Bu ölçmek için, biz otomatik hücrelerin saptanması ve rasyometrik sinyalinin belirlenmesi için 535 ve 450 nm kanallarında yoğunluğu ölçümü sağlar Metamorph ve Acapella yazılım için bir komut dosyası geliştirdi. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, çekirdek ve hücrelerin sitoplazmasında Draq5 kanalı kullanılarak bölümlenmiştir. Daha sonra, algoritma her bir hücre için, iki şiddetleri arasındaki oranlar hesaplamak için 450 nm ve 535 nm pozitif bir hücre popülasyonu tespit için yetenekliŞekil 2C bir histogram olarak temsil. Düşük oranlarda virülent için yüksek oranlarına göre mutant suş için elde edilmiştir. Bu temsili enfeksiyon deneme konfokal mikroskopi kullanılarak elde ederken, Epifloresans mikroskop incelemesi, bu iş için uygundur 2 farklı insan hücre türleri kullanılarak, Şekil 3 ve 4, örnek:. HeLa epitel hücreleri ve THP-1 makrofaj benzeri hücre. Virülan M90T AfaI Shigella, 1 saat boyunca gerilme ve HeLa ve THP-1 hücreleri, yeşil ve mavi (535 nm) sinyalinin bir geçiş için 90 dakika ile enfeksiyon durumunda, (450 nm'de) BS176 AfaI enfekte olmuş hücrelerde (Şekil 3A ile karşılaştırıldığında görülmektedir ve 4A). Biz MetaMorph yazılım geliştirilen komut dosyası hücrelerin doğrudan CCF4 olumlu nüfus algılar ve 450 yoğunlukları ve her hücre için 535 nm kanallar arasındaki oranı hesaplar. Daha sonra hücreler, bir makro develo kullanarak oranının bir fonksiyonu olarak sınıflandırılırExcel'de ped, böylece hücre dağılımı gösteren histogram elde edilmiştir. Bu Acapella için geliştirilmiş diğer komut için durum olduğu gibi M90T AfaI enfekte olmuş hücrelerde HeLa hücreleri ve THP-1 makrofajlar (Şekiller 3B ve 4B) üzerinde MetaMorph algoritması kullanılarak yüksek oranda görüntülemek, oysa BS176 AfaI enfekte hücreleri, düşük oranlarda ile karakterize edilir . Son olarak, mikobakterilerin incelemek için bu yöntemin bir adaptasyonu Şekil 5 'de gösterilmiştir. Mycobacterium bovis BCG olarak deney zaman süreci boyunca tespit güçlü 535 nm sinyali tarafından yansıtılan, deney bütün ders için fagosom bulunur. Buna karşılık, Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonu 7 gün (Şekil 5A ve 5B) bir 450 nm sinyal ile belirtildiği gibi enfeksiyon fazla 3 gün sonra THP-1 makrofaj içinde phagosomal membran rüptürü ortaya çıkarır. Shigella tarafından vakuolar rüptürü eğitim için aynı algoritma kullanılarak Mycobacterium tuberculosis enfekte olmuş hücreleri enfeksiyon 7 gün (Şekil 5C ve 5D) sonra Mycobacterium bovis BCG daha yüksek 450/535 nm oranları görüntülemek bulundu.
Şekil 1. Izleme Shigella flexneri vakuolar rüptürü için CCF4-AM/β-lactamase testinin prensibi. Temsil şeması CCF4-AM serbestçe ester gruplarından CCF4 anyon üreten sitozolik esteraz tarafından kapalı yarılmış olan sitoplazma içine plazma zarından yayılır. Bu reaksiyon, herhangi bir zar gömülü bölmesine girmesini CCF4 engeller. Bu aşamada, CCF4 405 nm uyarma üzerine 535 nm de FRET ortaya çıkarır. Prob β-laktamaz ifade bakteri rüptür kadar bozulmadan kalırendositik vakuol e. Bu adımda, CCF4 β-laktamaz 405 nm uyarma üzerine 450 nm 535 nm emisyon bir anahtar tetikleyerek bölünmüş olduğu için sinyali kaybolduğunda FRET.
Şekil 2. Konfokal mikroskopi kullanılarak Shigella flexneri vakuolar rüptürü İzleme. (A) CCF4-AM yükleme 2 saat 30 dakika sonra, HeLa hücre 1 saat ve sabit için β-laktamaz ifade Shigella flexneri BS176 AfaI mutant suşu veya M90T AfaI öldürücü suşu ile enfekte 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid ile. Daha sonra, çekirdekleri Draq5 ile boyanmış ve hücreler bir 10x objektif ile bir konfokal mikroskop kullanarak görüntülü. Temsilcisi resimleri aşağıdaki birleştirilmiş kanalları ile seçildi: sağlam CCF4 prob 535 nm (Gree görünürn), bölünmüş CCF4 prob 450 nm (mavi) görünür. Acapella yazılımı bizim otomatik algoritması algılama sistemi vurgulayarak resim (B) Örnekler. Hücreleri (çekirdekleri + sitoplazmada) segmentasyon Draq5 kanal kullanılarak elde edilir. CCF4 pozitif hücreler bir araya toplanmış 450 ve 535 nm kanallarını kullanarak elde edilir. (C) Histogram Shigella flexneri BS176 AfaI mutant suşu veya M90T AfaI virülent kullanarak Acapella bizim otomatik analiz sonuçlarını gösteren. Ortalama oranı 450 ve 535 nm kanallarında yoğunluğu arasındaki oran temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Shigella fle TakipEpifloresans mikroskopi kullanılarak HeLa hücrelerinde xneri vakuolar kopma. (A), yükleme CCF4-AM, 2 saat 30 dakika sonra, HeLa hücreleri, 1 saat için ve β-laktamaz ifade Shigella flexneri BS176 AfaI mutant suşu veya M90T AfaI virülent bulaşmış 10 dakika için% 4 paraformaldehid kullanarak sabit. Daha sonra, hücreler, bir 20x objektif ile bir Epifloresans mikroskop kullanarak görüntülü. Temsilcisi resimleri aşağıdaki kanalları ile seçildi:. CCF4 sağlam prob 535 nm (yeşil) ve CCF4 bölünmüş prob 450 nm (mavi) (B) MetaMorph yazılım bizim otomatik analiz sonuçlarını temsil Histogram. Tek tek hücreler, 450 ve 535 nm kanallarında yoğunluklarının bunların oranı fonksiyonu olarak dağıtılır.
> Şekil 4. Epifloresans mikroskopi kullanılarak THP-1 hücrelerinde Shigella flexneri vakuolar kopma Takip. (A) CCF4-AM, yükleme, 2 saat 30 dakika sonra, THP-1 hücrelerinde β-laktamaz ifade Shigella flexneri BS176 AfaI mutant suşu veya M90T AfaI bulaşmış 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid ile 30 dakika, 1 saat ve sabit için virülent. Daha sonra, hücreler, bir 20x objektif ile bir Epifloresans mikroskop kullanarak görüntülü. Temsilcisi resimleri aşağıdaki kanalları ile seçildi:. CCF4 sağlam prob 535 nm (yeşil) ve CCF4 bölünmüş prob 450 nm (mavi) (B) MetaMorph yazılımı kullanarak otomatik analiz sonuçlarını temsil Histogram. Tek tek hücreler, 450 ve 535 nm kanallarında yoğunluklarının bunların oranı fonksiyonu olarak dağıtılır.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
Şekil 5,. Takip Mycobacterium bovis BCG ve Epifloresans mikroskobu. (A, B) kullanarak THP-1 makrofaj Mycobacterium tuberculosis phagosomal rüptürü THP-1 hücreleri 2 saat β-laktamaz ifade Mycobacterium bovis BCG veya Mycobacterium tuberculosis ile enfekte ve 3 ile 7 gün boyunca kültüre . Yıkamadan sonra, hücreler ile yüklenir CCF-4-AM, 2 saat ve sabit bir 40x objektif ile Epifloresans bir mikroskop kullanılarak görüntüleme önce 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid kullanmak için. ., Bölünmüş CCF4, prob 450 nm (mavi) (C, D) MetaMorph yazılımı kullanarak otomatik analiz sonuçlarını gösteren Histogramları sağlam CCF4 probu, 535 nm (yeşil): Temsilcisi resimleri aşağıdaki kanalları ile seçildi. Bireysel hücre, 450 ve 535 nm kanallarda yoğunluğu arasındaki oranın bir fonksiyonu olarak dağıtılır.
Discussion
CCF4-AM/β-lactamase testi hücre içi Shigella flexneri ve farklı hücre tiplerinde micobakteriyumlar neden vakuolar bozulma izlemek için basit bir yöntemdir. Bu bakteri yüzeyi üzerindeki aktif bir enzim tarafından parçalanabilen bir laktamaz duyarlı sitoplazmik FRET raportör kullanır.
CCF4-AM substrat kaybı kolayca tabaka yükleme yapılmasından sonra tüm çözümler probenesid eklenmesi ile önlenebilir. Gösterildiği gibi, tahlil, birden fazla hücre tipleri (epitel hücreleri, fagositik hücreler) ve format (96, 35 mm ebadındaki bir cam alt yemekler, 6/12/24 kuyucuğu) adapte edilebilir. 6/12/24 plakanın kullanımı için, steril lamelleri hücreleri ekim önce her bir alt kısmında dağıtılmaktadır. Deneyin sonunda, lamelleri Altın Antifade Reaktifi (Invitrogen) uzatmak gibi, montaj orta slaytlar üzerine aktarılır. Bu şekilde sinyal tahlil sonra uzun süreler için kararlıörnekleri tespit sonra PBS içinde korunur 96 kuyu biçimine göre. CCF4-AM substrat yüksek maliyetli numune hacminin belirlenmesi önce dikkate alınmalıdır. Biz onları ölçeklendirme tavsiye nedeni budur. Deneyler 6/12/24 iyi biçimde daha pahalı ama sinyalleri gün boyunca stabildir. Aksine, deney 96 kuyulu formatta ucuzdur, ancak örnekler deney gününde analiz edilmesi gerekir. Bu canlı deneyler de 96 veya 384 formatında yapılabilir dikkat çekicidir. Bu iyi başına pozisyonların numaraları ile aynı zamanda (mutant bakteri, İçişleri Bakanlığı, plazmid veya siRNA transfeksiyon, kimyasal maddeler vb) de koşullar onlarca kullanarak canlı deney performans sağlar. Shigella flexneri için uygun olsa da, biz enfeksiyon döngüsü sitoplazmada muhafaza edilebilir CCF4 ölçülebilir konsantrasyonları yüksek olması nedeniyle "gerçek" gerçek zamanlı ya da hızlandırılmış deneyler mikobakteriler çalışmaları için uygun olmadığını vurgulayın. IçinBu nedenle, CCF4-AM tabaka elde edilir işgal ettikten sonra hücreler üzerinde uygulanır.
MetaMorph yazılım toplama ve analiz için kullanılır durumda, biz de başına resim belirli bir sayıda ile bütün bir 96/384 plaka edinme sağlar modülü "ekran satın alma" kullanmanızı öneririz. Ayrıca, modül "yorum ekran veri" sağlar (i) büyük bir "et" aynı zamanda herhangi bir kanal için de her birinin dikişli resmi mozaik görselleştirme ve (ii) 535 yılında yoğunlukları ölçmek için özel bir algoritma döngü ve 450 nm kanalları. Olsa da, biz zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak tek bakterilerin vakuolar rüptürü ölçmek mümkün olmuştur, biz render bireysel bakteri yüzeyinde enzimatik aktivite zor tam hücre içi bakteri ve vakuolar etkinliğinin sayısı ilişkilendirmek için değişir dikkatli istiyorum rüptürü.
Tahlil sağlamlığı göz önüne alındığında, bu h için uygundurüksek üretilen 96 veya 384 biçimlerde yaklaşır. Ayrıca, başarılı bir süspansiyon 16, hücrelerin enfeksiyonu incelemek için FACS analizi için bu protokol adapte edilmiştir. Deney, aynı zamanda, geniş bir uygulama aralığı için lider, kendi yüzeyi üzerinde laktamaz sunan diğer bakteri veya taşıyıcıların incelenmesi için de kullanılabilir. Örneğin, bu yaklaşım, β-laktamaz ifade Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes veya Salmonella typhimurium 12 gibi diğer patojenlerin neden olduğu vakuolar rüptürü incelemek için kullanılabilir. Listeria monocytogenes Shigella flexneri karşılaştırılabilir kısa bir enfeksiyon döngüsü vardır bu yana, zaman atlamalı deneyler mümkündür. Buna karşılık, çünkü Legionella pneumophila ve Salmonella typhimurium ekran uzun enfeksiyonu döngüleri, biz son nokta deneyler öneririz.
Olası uygulamalar çeşitli CCF4-AM/β-lactamase tahlil bir yaparsabit örneklerinde ya da gerçek zamanlı olarak hücre içi patojenlerin neden vakuolar rüptürü izlemek için ilginç florometrik yöntemi.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Agence Nationale pour la Recherche ve Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
