Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre Bakterien
Abstract
Shigella flexneri sind pathogene Bakterien, die Wirtszellen Eingehen einer endozytischen Vakuole eindringen. Anschließend kann der Bruch dieser Membran umschlossenen Kammer Bakterien im Cytosol zu bewegen, vermehren und weiter einzudringen Nachbarzellen. Mycobacterium tuberculosis durch Immunzellen phagozytiert, und vor kurzem zum Bruch phagosomalen Membran in Makrophagen gezeigt. Wir entwickelten einen robusten Assay zur Verfolgung phagosomalen Membranzerstörung nach Wirtszelle Eintrag von Shigella flexneri oder Mycobacterium tuberculosis. Der Ansatz nutzt CCF4 ein FRET Reporter empfindlich auf β-Lactamase, die in das Cytosol der Wirtszelle ausgleicht. Beim Eindringen von Wirtszellen, die durch bakterielle Pathogene, bleibt die Sonde intakt, solange die Bakterien in der Membran-Kompartimente befinden. Nach Unterbrechung der Vakuole, β-Lactamase-Aktivität auf der Oberfläche der intrazellulären Erregers spaltet CCF4 sofort führenING zu einem Verlust von FRET-Signals und der Umstellung seiner Emissionsspektrum. Diese robuste ratiometrischen Assay liefert genaue Informationen über den Zeitpunkt der Vakuole Bruch durch die eindringenden Bakterien induziert, und es kann zu automatisierten Mikroskopie und Bildverarbeitung durch spezialisierte Algorithmen für die Erkennung der Signale der Emission gekoppelt werden FRET-Donor und Akzeptor. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung der Dynamik der Vakuole Störungen, hervorgerufen durch intrazelluläre Bakterien in Echtzeit in einzelne Zellen. Schließlich ist es perfekt für das Hochdurchsatz-Analyse mit einer räumlich-zeitlichen Auflösung als bisherige Methoden geeignet. Hier bieten wir die experimentellen Details beispielhafter Protokolle für die CCF4 vacuolar Bruch Assay auf HeLa-Zellen und THP-1 Makrophagen für Zeitraffer-Experimente oder Endpunkte Experimente mit Shigella flexneri sowie mehrere Mykobakterienstämme wie Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, und Mycobacterium tuberculosis.
Introduction
Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger sind in Membran-Kompartimente von eukaryotischen Zellen während ihrer Verlauf der Infektion verinnerlicht. Eintritt in die Zelle erfolgt entweder durch Phagozytose durch spezialisierte Wirtszellen, wie es der Fall für Mycobacterium tuberculosis, die von Makrophagen aufgenommen werden, oder die Erreger aktiv induzieren ihre Aufnahme in der Regel nicht Fresszellen. Bei der induzierten Aufnahme, beispielsweise zum Shigella flexneri, spritzt das Pathogen Effektorproteinen in den Wirt Cytosol, die unter anderem die Zellfunktionen streng reguliert endomembrane Sortiermaschinen was bakteriellen Lokalisierung innerhalb einer Endosomen 1,2 entführen. Anschließend stört Shigella das umschließende Membran führt zu vacuolar Bruch und cytosolischen Zugang des Erregers stören Wirtmembran Menschenhandel und die Vermeidung Lieferung an den Lysosomen. In jüngerer Zeit hat phagolysosomale Bruch auch als Infektion str gefundenategy von Mycobacterium tuberculosis, dass ein Erreger für eine lange Zeit, um ausschließlich innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment 3,17 lokalisiert gedacht wurde.
Um die Dynamik der subzellulären Membran Menschenhandel invasiver Krankheitserreger zu untersuchen, haben große Verbesserungen seit der Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) basiert Studien der späten 1980er Jahre 4,5 erreicht worden. Zum Beispiel, Fluoreszenzmikroskopie Methoden unter Verwendung von Farbstoffen, nahm Antikörper gegen bakterielle Oberfläche Komponenten oder Marker für die Co-Lokalisation mit subzellulären Kompartimenten über 6,7. Doch sie immer noch nicht erhalten genaue raumzeitliche Auflösung und Robustheit vacuolar Bruch durch bakterielle Erreger quantitativ zu messen.
Diese Hürde wurde mit einem Test auf der Grundlage der Cephalosporin CCF4-AM FRET abgeleitet Reporter, die zum ersten Mal verwendet wurde, um die Genexpression studieren 8 angesprochen. Dann wurde sie in Zusammenhang mit der verwendeten infection Biologie zu untersuchen Effektor-Sekretion und um die Aufnahme von Neisseria in Wirtszellen 9,10,11 folgen. Wir entwickelten einen Test unter Ausnutzung dieser Reporter für das Studium vacuolar Bruch durch Shigella flexneri 12 und Mycobacterium tuberculosis 17 induziert. Das Prinzip unserer Methode ist in Abbildung 1 beschrieben mit Shigella flexneri. Zuerst werden Wirtszellen mit dem FRET CCF4-AM Substrat, das innerhalb des Zytoplasmas nach Abspaltung der Uhr Estereinheiten eingefangen geladen. Dann werden die Zellen mit Shigella flexneri infiziert. β-Lactamase, die auf der Oberfläche der Bakterien kann zur Spaltung des Substrats CCF4 sobald vacuolar Bruch auftritt. Dies führt zu einem Verlust des FRET-Signals Umschalten des Emissionsmaximum von 535 nm bis 450 nm bei Anregung von der Probe bei 405 nm. Die Quotientenmeßschaltung der 450/535 nm Intensitäten hebt vacuolar Integrität: niedrige Verhältnisse widerspiegeln Membran-engeschlossenen oder extrazellulären Bakterien während hohe Verhältnisse widerspiegeln Kontakt zwischen den Bakterien und dem Host Cytosol. Wir berichten auch über eine Anpassung dieser Methode zur Untersuchung phagosomalen Bruch von Mycobacterium tuberculosis in THP-1 Makrophagen induziert. Die experimentellen Prinzipien bleiben die gleichen, obwohl die Reihenfolge umgekehrt, CCF4-AM Belastung erst nach bakterielle Infektion angewendet wird.
Somit kann durch quantitative ratiometrische Fluoreszenzmessungen an der Ebene einer einzelnen Zelle, kann die Vakuole Bruch Shigella flexneri in Echtzeit und in festen Proben aus verschiedenen Zelltypen 12,13,14 verfolgt werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren eine Reihe von anderen invasiven Krankheitserreger wie in dieser Studie mit Mycobacterium bovis und Mycobacterium tuberculosis gezeigt angepasst werden. Schließlich ermöglicht die Miniaturisierung der Protokoll mit 96 Vertiefungen (oder 384-Well-) Formate Screening von zahlreichen Bedingungen bei hohem Durchsatz.
Protocol
Der Test arbeitet in verschiedenen Formaten, jedoch empfehlen wir Verkleinerung das Probenvolumen um Reagenzien, insbesondere CCF4-AM zu speichern. Deshalb wird das folgende Protokoll für feste oder HeLa-Zellen THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen in einer 96-Well-Format beschrieben, dann für lebende HeLa-Zellen in 35 mm Petrischalen mit Glasboden. Der Assay kann für andere Krankheitserreger anzupassen. Neben Shigella-Infektion, beschreiben wir die Assay für THP-1 phagozytierenden verschiedenen m y cobacterial Stämme.
Wichtig ist, dass nach CCF4-AM Laden, verlangen, dass alle Reagenzien und Puffer einschließlich Waschpuffern das Vorhandensein von Probenecid bei 1 mM. Probenecid ein Anion Kanal-Inhibitor, der cytosolischen Beibehaltung CCF4 fördert während aller Schritte des Protokolls. Feste Proben sollten innerhalb von ein paar Stunden nach dem Experiment erworben werden, da die CCF4 Signal ist nicht für lange Zeiträume stabil.
1. CCF4 Assay auf fixierten Proben mit Shigella flexneri (96 Well-Platten)
- Vorbereiten Bakterien für Übernacht-Kulturen. Impfen die bakteriellen Vorkulturen Wildtyp (M90T AFAI) und Mutante (BS176 AFAI) Stämme 1 Tag vor der Infektion in 8 ml Trypsin Casein-Soja-Bouillon (TCSB) mit Ampicillin (50 ug / ml) in einem Shaker ergänzt bei 37 ° C über Nacht .
- Plating Zellen für eine Infektion. Seed HeLa-Zellen in 96-Well-Platten 1 Tag vor Infektion in einer Dichte von 5 × 10 3 Zellen pro Vertiefung in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin-Streptomycin in einer 5% CO 2-Inkubator in einem Endvolumen von 100 ul. Im Fall von THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen wird die Zelle Plattieren 2 Tage vor Infektion in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung durchgeführt, und sie sind mit 30 nM Phorbolmyristatacetat (PMA) in RPMI mit 10% inkubiert fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol.
- Vorbereiten Bakterien für Subkultur. Impfen Nacht Bakterienkulturenbei einer Verdünnung 1/100 in TCSB mit 50 ug / ml Ampicillin in einem Schüttler bei 37 ° C und werden für 2,5 h (OD600 = 0,3 bis 0,4).
- Loading-Zellen mit CCF4-AM. Bereiten Sie die CCF4-AM Laden-Mix für ein Endvolumen von 25 ul pro Well mit 1 mM Probenecid (Sigma), 1,5 uM CCF4-AM (6 pM bei THP-1) und 1,25 ul Laden Lösung B (100 mg / ml Pluronic F127-Tensid in DMSO/0.1% Essigsäure entlang CCF4-AM LiveBlazer geladen Kit von Invitrogen) in EM-Puffer (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 5 mM Glucose, 25 mM HEPES bei pH 7,3). Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 25 ul CCF4-AM Laden Mischung pro Vertiefung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2,5 Stunden.
- Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Spin 1 ml der bakteriellen Subkulturen bei 9.000 rpm für 1 min. Waschen Sie einmal mit 500 ul PBS, Schleudern bei 9000 rpm für 1 min und Resuspendieren in 500 ul PBS mit 10 ug / ml Poly-L-Lysin (Sigma) und 40 ug / ml β-lacta ergänztMase (Sigma). Nach 10 min Inkubation auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur, einmal waschen mit 500 ul PBS resuspendieren und Bakterien in 500 ul EM Puffer / 1 mM Probenecid.
- Handy-Infektion und Fixierung. Waschen Sie die Zellen einmal mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid, bereiten eine Mischung von 10 ul von Bakterien in einem Gesamtvolumen von 100 ul EM Puffer / 1 mM Probenecid resuspendiert und verteilen sie in jede Vertiefung. Nach 15 min Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur, schalten Sie die Platte auf 37 ° C für 1 Stunde (90 min bei THP-1) mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und fix mit 50 ul Paraformaldehyd 4% / 1 mM für 10 min im Dunkeln Probenecid. Dann, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid, für 30 min mit 30 ul 10 uM Kerne Farbstoff DRAQ5 (Biostatus) inkubieren waschen, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und verlassen Proben in 100 ul PBS / 1 mM Probenecid.
- Acquisition Einstellungen festen Proben. Erwerb erfolgt entweder über (i) eine invertierte Epifluoreszenz microszu bewältigen mit einem 20x (0.5 Numerische Apertur (NA), 2.1 Arbeitsabstand (WD)) oder 40x (NA 0,75, 0,72 WD) N-Plan Luftobjektiv oder (ii) mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fach Objektiv. Fluoreszenz-Bildgebung mit Anregung bei 405 nm durchgeführt (Semrock, FF01-387/11-25) und Emission über 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) und 535 nm (Semrock, erkannt FF01-520/35- 25) mit Belichtungszeiten von 5 ms (Durchlicht), 1000 msec (535 nm) und 500 ms (450 nm). Konfokale Bildgebung unter Verwendung des folgenden Belichtungszeit: 240 ms (450 nm) und 360 ms (535 nm) für die 405-nm-Laser (870 uW), 640 ms (DRAQ5) für die 640-nm-Laser (2560 uW).
- Post-Akquisition-Analyse. Anschließend werden die Bilder von einem Computer-Algorithmus, der automatisch Scoring des Fluoreszenz-Signals für jeden einzelnen Zellen ermöglicht analysiert. Software wie Metamorph 7.1 oder Acapella kann verwendet werden, um ein Skript für die Messung des Verhältnisses zwischen den 450nm und 535nm Emission Signale zu schaffen (auf Anfrage). Zu beachten ist, ermöglicht die Verwendung eines Fokuskalibrierung gekoppelt automatisierte Mikroskopie während der Erfassung Erfassen Dutzenden von verschiedenen Positionen in mehreren Mulden gleichzeitig.
2. CCF4 Assay auf Live-Samples mit Shigella flexneri (35 mm Glas-bottom-Format, MatTek)
- Vorbereiten Bakterien für Übernacht-Kulturen. Gehen Sie wie zuvor beschrieben.
- Plating Zellen für eine Infektion. Seed HeLa-Zellen in 35 mm Glasboden Kulturschalen (10 mm MatTek Microwell, MatTek corporation) 1 Tag vor der Infektion bei einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / Schale in einem Gesamtvolumen von 2 ml.
- Vorbereiten Bakterien für Subkultur. Gehen Sie wie zuvor beschrieben.
- Loading-Zellen mit CCF4-AM. Bereiten Sie die CCF-AM Laden Mix wie vorher für ein Endvolumen von 2 ml pro Schale beschrieben. Vor dem Laden, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
- Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Gehen Sie wie zuvor beschrieben.
- AcquisitIonen-Einstellungen von Live-Proben. Die Erfassung wird für 60 min alle 90 sec mit einer invertierten Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x (NA 0.5, 2.1 WD) oder 40x (NA 0,75, 0,72 WD) N-Plan Luftobjektiv in einem 37 ° C Heizkammer durchgeführt. Fluoreszenz-Bildgebung mit Anregung bei 405 nm durchgeführt (Semrock, FF01-387/11-25) und Emission über 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) und 535 nm (Semrock, erkannt FF01-520/35- 25) mit Belichtungszeiten von 5 ms (Durchlicht), 200 ms (535 nm) und 100 ms (450 nm).
- Handy-Infektion und Live-Akquisition. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml PBS / 1 mM Probenecid, 2 ml EM / 1 mM Probenecid, montieren Sie die Schüssel auf dem Tisch des Mikroskops und starten Sie die Übernahme. Nach 6 min (Zeitpunkt 4), setzen Sie den Erwerb zu halten, fügen Sie 250 ul Bakterien Resuspension auf der Oberseite der Zellen und starten Sie den Erwerb.
- Post-Akquisition-Analyse. Filme können visualisiert werden mit Metamorph oder ImageJ. 450/535 nm Intensitätsverhältnissen für jeden einzelnenDual-Zelle unter Verwendung ImageJ werden. Wie bereits erwähnt, ermöglicht die Verwendung eines Fokuskalibrierung gekoppelt automatisierte Mikroskopie während der Erfassung Erfassen mehreren verschiedenen Positionen in Abhängigkeit von dem Zeitabstand.
3. CCF4 Assay auf Fixed Proben unter Verwendung von Mykobakterien (96 Well Format)
- Vorbereiten Bakterien. Wachsen Mykobakterienstämme bis zur mittleren logarithmischen Phase in 7H9 Albumin enthält Dextrose Katalase (ADC) bei 30 ° C (für Mycobacterium marinum) oder 37 ° C (für Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis).
- Plating Zellen für eine Infektion. Platte THP-1 Makrophagen 2 Tage vor Infektion Inkubation mit 30 nM PMA in RPMI mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in einer 5% CO 2-Inkubator in einem Endvolumen von 100 ul mit einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung.
- Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Harvest Kulturen, waschen und mit PBS resuspendieren vor Beschallung und Filtration durch eine Spritze, um zu vermeiden verklumpen. Bestimmen Sie die Konzentration von jedem Stamm von OD600 Messung und infizieren THP-1-Zellen bei einer MOI von 1:1 bei 30 ° C (für Mycobacterium marinum) oder 37 ° C (für Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis) in RPMI-Medium mit 5% CO 2. Nach 2 Stunden, Entfernen Mittel, 3 x waschen mit PBS und füge alle frisches Medium für 1 bis 2 Tage (im Fall von Mycobacterium marinum) oder 3 bis 7 Tagen (im Falle von Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis).
- Loading-Zellen mit CCF4-AM und Fixierung. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und bereiten die CCF4-AM Laden-Mix, wie zuvor für ein Endvolumen von 25 ul pro Well mit einem CCF4-AM Endkonzentration von 6 uM beschrieben. Die Beladung erfolgt bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 Stunden vor dem Waschen mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid und behebenation mit 50 ul Paraformaldehyd bei 4% ergänzt mit1 mM für 30 min im Dunkeln Probenecid. Dann, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und verlassen Proben in 100 ul PBS / 1 mM Probenecid.
- Acquisition Einstellungen und Post-Akquisition-Analyse. Gehen Sie wie bisher in den ersten Absatz mit Shigella flexneri beschrieben.
Supplemental Protokoll
Fluorimetrische Tests werden durchgeführt, um β-Lactamase-Aktivität an der Oberfläche der Bakterien zu überprüfen. Dies sollte für jeden Bakterienstamm bestimmt ist, in dem beschriebenen Test verwendet werden erfolgen. Zu diesem Zweck sind gewaschenen Bakterien in Kontakt mit 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml Schweine-Esterase Leberextrakten (Sigma) in 1 ml PBS setzen für 1 Stunde bei 37 ° C im Dunkeln. Lösliche Lactamase 1 mg / ml (Invitrogen) als positive Kontrolle verwendet werden. Dann wird ein Scan-Emission bei 405 nm Anregung unter Verwendung eines PTI Quantamaster Fluorimeter und 1 ml quartz Küvette. Der Verlust von FRET bei 535 nm und das Auftreten eines hohen Spitzenwert 450 nm sichtbar gemacht auf Bakterien neben der CCF4 Sonde.
Representative Results
Die CCF4-AM/β-lactamase Ansatz ist eine robuste und sensitive Methode für die Verfolgung vacuolar Ruptur intrazelluläre Erreger wie Shigella flexneri (Abbildung 1). Die Shigella-Stämme, die in dieser Studie verwendet werden, sind M90T AFAI und BS176 AFAI bezeichnet. M90T AFAI ein Shigella flexneri Stamm, der das Adhäsin AfaE, die in der Lage, effizient binden CD55 auf der Oberfläche von Epithelzellen 15 drückt. Daher AfaE exprimierenden Stämmen zeigen viel höhere Invasion Fähigkeiten im Vergleich zum Wildtyp-Stamm M90T in Epithelzellen. BS176 AFAI ist ein Ausdruck AfaE mutierte Shigella flexneri Stamm frei von der Shigella Virulenzplasmid. Dieser Stamm ist nicht HeLa-Zellen einzudringen. Dennoch Dieser Stamm ist in der Lage, THP-1-Zellen geben, da die Aufnahme in dieser Zelllinie nur verlassen sich auf klassische Phagozytose und erfordert keine funktionellen Typ-3-Sekretionssystem. Beide Stämme exprimieren β-LactamaseUnd Anzeigen von β-Lactamase-Aktivität an ihrer Oberfläche durch das Vorhandensein des AfaE kodierenden Plasmid. Nach Infektion von HeLa-Zellen mit dem nicht-invasive BS176 AFAI Belastung für 1 h, das FRET CCF4 Sonde intakt, wie in 2A durch die grünes Signal (535 nm) gezeigt. Im Gegenteil führt die Infektion mit dem virulenten Stamm M90T AFAI für 1 Stunde mit einem Schalter des Signals in Richtung blau (450 nm) Hervorhebung der Spaltung der Sonde im Cytosol. Um dies zu quantifizieren, entwickelten wir ein Skript für das Metamorph und Acapella Software, die automatische Erkennung von Zellen und die Messung der Intensitäten in den 535 und 450 nm Kanäle für die Bestimmung der ratiometrische Signals ermöglicht. Wie in 2B gezeigt, sind Kerne und Cytosol von Zellen unter Verwendung des segmentierten DRAQ5 Kanal. Dann wird der Algorithmus in der Lage, die 450 nm und 535 nm die positiven Zellpopulationen zum Berechnen der Verhältnisse zwischen den zwei Intensitäten für jede einzelne Zelle, die erkennendargestellt als Histogramm in 2C. Low-Verhältnisse für den mutierten Stamm gegen hohe Verhältnisse für den virulenten Stamm erhalten. Während dieser repräsentativen Experiment Infektion erworben wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wird Epifluoreszenzmikroskopie auch für diese Aufgabe geeignet Abbildungen 3 und 4 zeigen Beispiele aus 2 verschiedenen menschlichen Zelltypen:. HeLa Epithelzellen und THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen. Nach Infektion mit dem virulenten M90T AFAI Shigella-Stamm für 1 Stunde und 90 min für HeLa und THP-1-Zellen, einen Schalter für das von grünen (535 nm) bis blau (450 nm) im Vergleich zu BS176 AFAI infizierten Zellen (3A beobachtet und 4A). Das Skript wir MetaMorph entwickelte Software erkennt unmittelbar die CCF4 positive Zellpopulation und berechnet das Verhältnis zwischen den Intensitäten in 450 und 535 nm Kanäle für jeden einzelnen Zellen. Dann werden Zellen, in Abhängigkeit von deren Verhältnis mit einem Makro entwi eingestuftped in Excel, wodurch man Histogramme, die die Verteilung der Zellen. Wie es der Fall gewesen ist für den anderen Skript für Acapella entwickelt werden BS176 AFAI infizierten Zellen durch niedrige Verhältnisse gekennzeichnet, während M90T AFAI infizierte Zellen hohe Übersetzungen mit der MetaMorph Algorithmus auf HeLa-Zellen und THP-1 Makrophagen (3B und 4B) anzuzeigen . Schließlich wird eine Anpassung dieser Methode auf die Untersuchung von Mykobakterien in Abbildung 5 dargestellt. Mycobacterium bovis BCG liegt in der phagosome für den gesamten Verlauf des Experiments, wie durch die starke 535 nm Signal während des zeitlichen Verlaufs des Experiments detektierten reflektierten. Im Gegensatz dazu löst Mycobacterium tuberculosis phagosomalen Membranreißen in THP-1 Makrophagen nach mehr als 3 Tagen nach der Infektion, wie durch einen 450 nm-Signal an 7 Tagen nach Infektion (5A und 5B) hervorgehoben. Mit dem gleichen Algorithmus wie für das Studium vacuolar Bruch durch Shigella Mycobacterium tuberculosis infizierte Zellen höher 450/535 nm-Verhältnis als Mycobacterium bovis BCG Anzeige nach 7 Tagen der Infektion (5C und 5D).
Abbildung 1. Schema repräsentiert das Prinzip der CCF4-AM/β-lactamase Assay für die Verfolgung von Shigella flexneri vacuolar Bruch. CCF4-Uhr frei diffundiert durch die Plasmamembran in das Zytoplasma, wo Estereinheiten durch cytosolische Esterasen Herstellung CCF4 Anionen gespalten werden. Diese Reaktion verhindert das Eindringen von CCF4 jede Membran eingebettet Fach. Bei diesem Schritt löst CCF4 FRET bei 535 nm nach Anregung bei 405 nm gemessen. Die Sonde bleibt bis β-Lactamase-exprimierenden Bakterien Zerplatzen intakte Die endozytischen Vakuole. Bei diesem Schritt wird das FRET-Signal verloren geht, weil CCF4 von β-Lactamase Auslösung eines Schalters in Emission von 535 nm bis 450 nm nach Anregung bei 405 nm gespalten wird.
Abbildung 2. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden, HeLa-Zellen werden mit dem β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm für 1 Stunde und festen infiziert mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden Kerne mit DRAQ5 angefärbt und die Zellen werden aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fach Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden fusionierten Kanäle gewählt: die intakte Sonde CCF4 erscheint bei 535 nm (grünn), wird die Sonde gespalten CCF4 bei 450 nm (blau). (B) Beispiele von Bildern Hervorhebung das Detektionssystem der automatisierten Algorithmus auf der Acapella Software. Die Segmentierung der Zellen (Kerne + Cytosol) wird nach der DRAQ5 Kanal. CCF4 positive Zellen werden unter Verwendung der 450 und 535 nm Kanäle gebündelt zusammen. (C) Histogramm der Ergebnisse unserer automatisierten Analyse auf Acapella mit Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm zeigt. Der Mittelwert stellt das Verhältnis zwischen der Intensität in der 450 und 535 nm Kanäle. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch in HeLa-Zellen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden werden HeLa-Zellen mit der β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm für 1 Stunde und infiziert fixiert mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden die Zellen abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt:. CCF4 intakte Sonde 535 nm (grün) und CCF4 geschnittenen Sonde 450 nm (blau) (B) Histogramm repräsentiert das Ergebnis unseres automatisierten Analyse auf MetaMorph Software. Die einzelnen Zellen werden in Abhängigkeit von ihrem Verhältnis der Intensitäten in den 450 und 535 nm Kanäle.
> Abbildung 4. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch in THP-1-Zellen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden, THP-1-Zellen mit dem β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI infiziert virulenten Stamm für 1 h 30 min und fest mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden die Zellen abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt:. CCF4 intakte Sonde 535 nm (grün) und CCF4 geschnittenen Sonde 450 nm (blau) (B) Histogramm repräsentiert das Ergebnis unseres automatisierten Analyse mit dem MetaMorph Software. Die einzelnen Zellen werden in Abhängigkeit von ihrem Verhältnis der Intensitäten in den 450 und 535 nm Kanäle.
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Abbildung 5. Tracking Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis phagosomalen Bruch in THP-1 Makrophagen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A, B) THP-1-Zellen mit β-Lactamase-exprimierenden Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium tuberculosis 2 h infiziert und kultiviert für 3 bis 7 Tage . Nach dem Waschen werden die Zellen mit geladen CCF-4-AM für 2 Stunden oder Fest mit 4% Paraformaldehyd für 30 min vor der Belichtung mit Hilfe eines Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 40x. . Gespalten CCF4, Sonde 450 nm (blau) (C, D) Histogramme präsentiert das Ergebnis unserer automatisierten Analyse mit MetaMorph Software intakt CCF4 Sonde, 535 nm (grün): Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt. Einzelne Zellen als Funktion des Verhältnisses zwischen der Intensität in der 450 und 535 nm Kanäle.
Discussion
Die CCF4-AM/β-lactamase Assay ist eine einfache Methode, um Störungen durch intrazelluläre vacuolar Shigella flexneri und Mykobakterien in verschiedenen Zelltypen induziert verfolgen. Es nutzt eine Lactamase empfindlich zytoplasmatischen FRET Reporter, die von einem aktiven Enzym auf der Oberfläche der Bakterien gespalten wird.
Verlust des CCF4-AM Substrat kann leicht durch Zugabe von Probenecid zu allen Lösungen nach dem Laden des Substrats vermieden werden. Wie gezeigt, kann der Test mehrere Zelltypen (Epithelzellen Phagozyten) und Formate (96 Vertiefungen, 35 mm Petrischalen mit Glasboden, 6/12/24 Well-Platten) angepasst werden. Für die Verwendung der 6/12/24 Well-Platte werden sterile Deckgläser am Boden jeder Vertiefung vor der Aussaat der Zellen verteilt. Am Ende des Versuches werden die Deckgläser auf Objektträger in Montage-Medium überführt, wie zum Beispiel Gold-Verlängern Antifade Reagent (Invitrogen). Auf diese Weise wird das Signal über einen längeren Zeitraum stabil nach dem Testim Vergleich zu den Vertiefungen 96 in dem Format Proben in PBS nach Fixierung erhalten bleiben. Die hohen Kosten der CCF4-AM Substrat sollte berücksichtigt vor der Bestimmung des Volumens der Probe zu entnehmen. Das ist, warum wir Verkleinern sind zu empfehlen. Experimente sind teurer in 6/12/24 Well-Format, aber die Signale sind seit Tagen stabil. Im Gegenteil, sind Versuche billiger in der 96-Well-Format, aber sind die Proben am Tag des Experiments analysiert werden. Bemerkenswert ist, daß Live-Experimente auch an der 96-Well oder 384-Well-Format durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Durchführung Live-Experiment mit Dutzenden von Bedingungen zur gleichen Zeit (Bakterienmutanten, MOI, Plasmid oder siRNA-Transfektion, Chemikalien usw.) mit einer Anzahl von Positionen pro Vertiefung. Obwohl für Shigella flexneri geeignet, markieren wir, dass "echte" Echtzeit oder Zeitraffer-Experimente sind nicht für Mykobakterien Studien möglich, da die Infektion Zyklus übersteigt messbaren Konzentrationen von CCF4, die im Cytosol zurückgehalten werden kann. FürAus diesem Grund ist die CCF4-AM Substrat auf Zellen angewendet erst nach Einfall erreicht wird.
Bei MetaMorph Software für die Erfassung und Analyse verwendet wird, empfehlen wir die Verwendung des Moduls "Bildschirm Übernahme", die den Erwerb eines ganzen 96/384 Well-Platte mit einer bestimmten Anzahl von Bildern pro Vertiefung ermöglicht. Ferner sind die Module "Beurteilung Bildschirm Daten" können (i) die Visualisierung der Stickbild Mosaik von jeweils gut für jeden Kanal zur gleichen Zeit auf einem großen "Plakat" und (ii) eine spezielle Looping Algorithmus zur Messung der Intensitäten in der 535 und die 450 nm-Kanälen. Auch wenn wir in der Lage gewesen zu vacuolar Bruch durch einzelne Bakterien mit Zeitraffer-Mikroskopie zu messen, möchten wir darauf hinweisen, dass die enzymatische Aktivität auf der Oberfläche der einzelnen Bakterien Rendering variiert es schwierig, genau zu korrelieren Anzahl der intrazellulären Bakterien und Wirksamkeit der Vakuole Bruch.
Aufgrund der Robustheit des Assays ist es für h geeignetoch Durchsatz nähert sich in 96 oder 384 Well Format. Wir haben auch erfolgreich dieses Protokoll für die FACS-Analyse, um die Infektion von Zellen in Suspension 16 studieren angepasst. Der Assay kann auch zur Untersuchung anderer Bakterien oder Träger präsentiert Lactamase auf ihrer Oberfläche, die zu einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel kann dieser Ansatz verwendet werden, um vacuolar Bruch durch andere Erreger wie β-Lactamase exprimieren, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes und Salmonella typhimurium 12 induziert untersuchen. Da Listeria monocytogenes hat einen kurzen Zyklus Infektion vergleichbar mit Shigella flexneri sind Zeitraffer-Experimente möglich. Im Gegensatz dazu, weil Legionella pneumophila und Salmonella typhimurium Display lange Zyklen Infektion, empfehlen wir Ihnen Endpunkt Experimente durchzuführen.
Die Vielfalt der möglichen Anwendungen macht das CCF4-AM/β-lactamase Assay eininteressant fluorometrische Verfahren zur Verfolgung vacuolar Bruch durch intrazelluläre Erreger in fixierten Proben oder in Echtzeit induziert.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Agence Nationale pour la Recherche und durch den European Research Council finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
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