Summary
हम आंतरिक झिल्ली टूटना पर नज़र रखने के लिए एक विधि का वर्णन इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया द्वारा हासिल
Abstract
शिगेला flexneri एक endocytic कोटर में प्रवेश मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण कि रोगजनक बैक्टीरिया होते हैं. इसके बाद, इस झिल्ली संलग्न कम्पार्टमेंट का टूटना, बैक्टीरिया साइटोसॉल भीतर ले जाने के लिए अनुमति देता है पैदा करना और आगे पड़ोसी कोशिकाओं पर आक्रमण. माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा phagocytosed है, और हाल ही में मैक्रोफेज में टूटना phagosomal झिल्ली को दिखाया गया है. हम शिगेला flexneri या माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के मेजबान सेल प्रविष्टि के बाद phagosomal झिल्ली विघटन नज़र रखने के लिए एक मजबूत परख विकसित. दृष्टिकोण CCF4 का उपयोग करता है, एक मेजबान कोशिकाओं के cytosol में equilibrates कि β-lactamase के प्रति संवेदनशील संवाददाता झल्लाहट. बैक्टीरिया झिल्ली संलग्न डिब्बों में निवास के रूप में बैक्टीरियल रोगज़नक़ों द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण के लिये, जांच में लंबे समय के रूप में बरकरार है. तुरन्त इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ cleaves CCF4 की सतह पर रिक्तिका, β-lactamase गतिविधि के विघटन के बाद नेतृत्वसंकेत झल्लाहट का नुकसान करने के लिए आईएनजी और उसके उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्विचन. इस मजबूत ratiometric परख हमलावर जीवाणुओं द्वारा प्रेरित vacuolar टूटना के समय के बारे में सटीक जानकारी पैदावार, और यह उत्सर्जन के संकेतों का पता लगाने के लिए विशेष एल्गोरिदम द्वारा स्वचालित माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण के लिए युग्मित किया जा सकता है दाता और स्वीकर्ता झल्लाहट. इसके अलावा, यह एकल कक्षों में वास्तविक समय में intracellular बैक्टीरिया द्वारा हासिल vacuolar विघटन की गतिशीलता की जांच की अनुमति देता है. अंत में, यह पूरी तरह से पिछले विधियों से अधिक स्थानिक-अस्थायी समाधान के साथ उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुकूल है. यहाँ, हम शिगेला flexneri साथ ही ऐसे माइकोबैक्टीरियम marinum, माइकोबैक्टीरियम बोविस, के रूप में कई माइक्रोबैक्टीरियल उपभेदों का उपयोग करते समय चूक प्रयोगों या अंत अंक प्रयोगों के लिए HELA कोशिकाओं और THP-1 मैक्रोफेज पर CCF4 vacuolar टूटना परख के लिए अनुकरणीय प्रोटोकॉल की प्रायोगिक जानकारी प्रदान करते हैं और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग.
Introduction
कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों संक्रमण के अपने पाठ्यक्रम के दौरान कोशिकाओं की झिल्ली संलग्न डिब्बों में भली भाँति रहे हैं. मैक्रोफेज द्वारा किया जाता है, या रोगजनकों सक्रिय रूप से आम तौर पर गैर phagocytic कोशिकाओं में अपने तेज को प्रेरित कर रहे हैं कि माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के लिए मामला है के रूप में सेल प्रविष्टि, विशेष मेजबान कोशिकाओं द्वारा phagocytosis के माध्यम से या तो होता है. प्रेरित तेज के मामले में, शिगेला flexneri के लिए उदाहरण के लिए, रोगज़नक़ अन्य सेल कार्यों एक endosomal डिब्बे 1,2 भीतर बैक्टीरियल स्थानीयकरण में जिसके परिणामस्वरूप कसकर विनियमित एंडोमेम्ब्रेन छँटाई मशीनरी के बीच अपहरण कि मेजबान cytosol में प्रेरक प्रोटीन इंजेक्शन. बाद में, शिगेला vacuolar टूटना और मेजबान झिल्ली तस्करी और लाइसोसोम करने से परहेज वितरण के साथ हस्तक्षेप रोगज़नक़ के साइटोसोलिक उपयोग करने के लिए अग्रणी enclosing झिल्ली बाधित. अभी हाल ही में phagolysosomal टूटना भी संक्रमण str के रूप में पाया गया हैategy माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, विशेष रूप से एक झिल्ली ही सीमित डिब्बे 3,17 भीतर स्थानीयकृत करने के लिए एक लंबे समय के लिए सोचा था कि एक रोगज़नक़ द्वारा प्रयोग किया जाता है.
आक्रामक रोगजनकों के subcellular झिल्ली तस्करी की गतिशीलता की जांच करने के लिए, महान सुधार 4,5 देर से 1980 के दशक के अध्ययन के आधार पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के बाद हासिल किया गया है. उदाहरण के लिए, रंगों का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी आधारित विधियों, बैक्टीरियल सतह घटकों, या subcellular डिब्बों के साथ सह स्थानीयकरण के लिए मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी 6,7 पदभार संभाल लिया है. हालांकि, वे अभी भी सटीक spatiotemporal संकल्प और मात्रात्मक बैक्टीरियल रोगज़नक़ों द्वारा vacuolar टूटना को मापने के लिए मजबूती उपज नहीं है.
इस बाधा को पहला जीन अभिव्यक्ति 8 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि cephalosporin झल्लाहट CCF4-AM के व्युत्पन्न संवाददाता के आधार पर एक परख के साथ संबोधित किया गया है. फिर, यह संसाधनों के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया थाection जीव विज्ञान प्रेरक स्राव की जांच के लिए और मेजबान कोशिकाओं 9,10,11 में नेइसेरिया के तेज पालन करने के लिए. हम शिगेला flexneri 12 और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग 17 से प्रेरित vacuolar टूटना के अध्ययन के लिए इस संवाददाता का लाभ लेने के एक परख विकसित. हमारे विधि के सिद्धांत शिगेला flexneri का उपयोग कर चित्र 1 में वर्णित है. सबसे पहले, मेजबान कोशिकाओं AM एस्टर moieties बंद cleaving के बाद cytoplasm के अंदर फंस गया है कि झल्लाहट CCF4-AM सब्सट्रेट के साथ लोड कर रहे हैं. फिर, कोशिकाओं शिगेला flexneri से संक्रमित हैं. जीवाणुओं की सतह पर β-lactamase उपहार के रूप में जल्द ही vacuolar टूटना होता है के रूप में फोड़ना CCF4 सब्सट्रेट करने में सक्षम है. यह 405 एनएम पर जांच की उत्तेजना पर 450 एनएम के लिए 535 एनएम से उत्सर्जन चोटी स्विचिंग झल्लाहट संकेत का नुकसान होता है. 450/535 एनएम तीव्रता के ratiometric माप vacuolar अखंडता डाला: कम अनुपात झिल्ली एन प्रतिबिंबितउच्च अनुपात जबकि बंद या बाह्य बैक्टीरिया बैक्टीरिया और मेजबान साइटोसॉल के बीच संपर्क को दर्शाते हैं. हम भी THP-1 मैक्रोफेज में माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग से प्रेरित phagosomal टूटना का अध्ययन करने के लिए इस विधि के एक अनुकूलन रिपोर्ट. अनुक्रम CCF4-AM के लदान केवल बैक्टीरिया के संक्रमण के बाद लागू किया जाता है, उलट है, हालांकि प्रायोगिक सिद्धांतों ही रहते हैं.
इस प्रकार, एकल कोशिका के स्तर पर मात्रात्मक ratiometric प्रतिदीप्ति द्वारा माप, शिगेला flexneri की vacuolar टूटना वास्तविक समय में और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 12,13,14 से तय नमूनों में लगाया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि माइकोबैक्टीरियम बोविस और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग का उपयोग करते हुए इस अध्ययन में दिखाया गया के रूप में अन्य इनवेसिव रोगज़नक़ों के एक नंबर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अंत में, अच्छी तरह से 96 (या अच्छी तरह से 384) के लिए हमारे प्रोटोकॉल प्रारूपों के miniaturization उच्च throughput में कई शर्तों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है.
Protocol
परख विभिन्न स्वरूपों में काम करता है, लेकिन हम विशेष रूप से अभिकर्मकों, CCF4-AM बचाने के लिए नमूना मात्रा नीचे स्केलिंग की सलाह देते हैं. इसलिए, निम्न प्रोटोकॉल 35 मिमी गिलास नीचे बर्तन में रहते HELA कोशिकाओं के लिए है, तो एक साथ 96 प्रारूप में निश्चित HELA कोशिकाओं या THP-1 बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं के लिए वर्णित है. परख अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. शिगेला संक्रमण के अलावा, हम THP-1 phagocytosing अलग मी वाई cobacterial उपभेदों के लिए परख का वर्णन है.
महत्वपूर्ण बात है, CCF4-AM लदान के बाद, धोने बफ़र्स सहित सभी अभिकर्मकों और buffers 1 मिमी पर प्रोबेनेसिड की उपस्थिति की आवश्यकता होती है. प्रोबेनेसिड प्रोटोकॉल के सभी चरणों के दौरान CCF4 की साइटोसोलिक प्रतिधारण को बढ़ावा देता है कि एक आयनों चैनल अवरोध करनेवाला है. CCF4 संकेत लंबे समय अवधि के लिए स्थिर नहीं है क्योंकि फिक्स्ड नमूने प्रयोग के बाद कुछ ही घंटों के भीतर प्राप्त हो जाना चाहिए.
1. शिगेला च का उपयोग करना निश्चित नमूने पर CCF4 परखlexneri (96 खैर प्लेट्स)
- रात भर संस्कृतियों के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. बैक्टीरियल पूर्व संस्कृतियों जंगली प्रकार (M90T AfaI) और उत्परिवर्ती (BS176 AfaI) उपभेदों 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर एक प्रकार के बरतन में एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक 8 मिलीग्राम tryptic कैसिइन सोया शोरबा (TCSB) में संक्रमण के 1 दिन पहले टीका लगाना .
- संक्रमण के लिए चढ़ाना कोशिकाओं. DMEM के अंतिम मात्रा में एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त में अच्छी तरह से प्रति 5 एक्स 10 3 कोशिकाओं के घनत्व में 96 अच्छी तरह प्लेटें संक्रमण से पहले 1 दिन में बीज HELA कोशिकाओं 100 μl की. THP-1 बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह के मामले में, सेल चढ़ाना 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह का घनत्व कम 2 दिनों के संक्रमण से पहले किया जाता है, और वे 10% से युक्त RPMI में 30 एनएम Phorbol Myristate एसीटेट (पीएमए) के साथ incubated हैं भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) 1% पेनिसिलिन streptomycine और 0.05 मिमी 2-mercaptoethanol.
- उपसंस्कृति के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृतियों टीका लगाना2.5 घंटे (OD600 = 0.3-0.4) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 माइक्रोग्राम / एक प्रकार के बरतन में मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ पूरक TCSB में एक 1/100 कमजोर पड़ने पर.
- CCF4-AM के साथ कोशिकाओं लोड हो रहा है. अच्छी तरह से 1 मिमी प्रोबेनेसिड (सिग्मा), 1.5 माइक्रोन CCF4-(ए. THP-1 के मामले में 6 माइक्रोन) और लदान समाधान बी के 1.25 μl (100 मिलीग्राम से युक्त प्रति 25 μl के अंतिम मात्रा के लिए CCF4-AM लदान मिश्रण तैयार ईएम में / एमएल Invitrogen द्वारा CCF4-AM LiveBlazer लोड हो रहा है किट के साथ प्रदान की DMSO/0.1% एसिटिक एसिड में Pluronic-F127 पृष्ठसक्रियकारक) बफर (120 मिमी NaCl, 7 मिमी KCl, 1.8 मिमी 2 CaCl, 0.8 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी ग्लूकोज, पीएच 7.3) में 25 मिमी HEPES. पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और 2.5 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से प्रति CCF4-AM लोड हो रहा है मिश्रण के 25 μl जोड़ें.
- संक्रमण के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. 1 मिनट के लिए 9000 rpm पर बैक्टीरियल उप संस्कृतियों के 1 मिलीलीटर स्पिन. 10 माइक्रोग्राम / एमएल पाली एल lysine (सिग्मा) और 40 ग्राम / एमएल β-Lacta साथ पूरक 500 μl पीबीएस में 1 मिनट और resuspend के लिए 9000 rpm पर 500 μl पीबीएस, स्पिन के साथ एक बार धोएं(सिग्मा) mase. कमरे के तापमान पर एक घूर्णन पहिया पर ऊष्मायन के 10 मिनट के बाद, 500 μl ईएम बफर / 1 मिमी प्रोबेनेसिड में 500 μl पीबीएस और resuspend बैक्टीरिया के साथ एक बार धोने.
- सेल संक्रमण और निर्धारण. 150 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें, ईएम बफर के 100 μl / 1 मिमी प्रोबेनेसिड के अंतिम मात्रा में resuspended बैक्टीरिया के 10 μl का मिश्रण तैयार करते हैं और एक अच्छी तरह से इसे वितरित. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, 1 घंटा (THP-1 के मामले में 90 मिनट) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली स्विच, 150 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड से धो लें और 50 μl paraformaldehyde के 4% के साथ तय / 1 मिमी अंधेरे में 10 मिनट के लिए probenecid. फिर, 10 माइक्रोन नाभिक डाई DRAQ5 (Biostatus) के 30 μl के साथ 30 मिनट के लिए सेते 150 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड, साथ धोने, 150 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड से धो लें और 100 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड में नमूने छोड़ दें.
- निश्चित नमूनों का अधिग्रहण सेटिंग्स. अधिग्रहण या तो (i) एक औंधा epifluorescence माइक्रो का उपयोग किया जाता हैएक 20x (0.5 संख्यात्मक एपर्चर (एनए), 2.1 कार्य दूरी (G)) या 40x (0.75 एनए, 0.72 G) एन योजना हवा उद्देश्य या (ii) एक 10x उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर के साथ सामना. प्रतिदीप्ति इमेजिंग 405 एनएम उत्तेजना के साथ प्रदर्शन (Semrock, FF01-387/11-25) और उत्सर्जन 450 एनएम (Semrock, FF02-447/60-25) और 535 एनएम फिल्टर (Semrock, के माध्यम से पता चला है FF01-520/35- 5 मिसे (प्रेषित प्रकाश), 1000 मिसे (535 एनएम) और 500 मिसे (450 एनएम) के प्रदर्शन के समय का उपयोग कर 25). 240 मिसे (450 एनएम) और 640 एनएम लेजर के लिए 405 एनएम लेजर (870 μW), 640 मिसे (DRAQ5) (2560 μW) के लिए 360 मिसे (535 एनएम): confocal इमेजिंग प्रदर्शन के बाद समय का उपयोग किया जाता है.
- अधिग्रहण के बाद विश्लेषण. बाद में, छवियों के प्रत्येक व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए प्रतिदीप्ति संकेत के स्वचालित स्कोरिंग की अनुमति देता है कि एक कंप्यूटर कलन विधि द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. ऐसे Metamorph 7.1 या Acapella के रूप में सॉफ्टवेयर (अनुरोध पर उपलब्ध) 450nm और 535nm उत्सर्जन संकेतों के बीच अनुपात को मापने के लिए एक स्क्रिप्ट बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ध्यान से, अधिग्रहण के दौरान स्वचालित माइक्रोस्कोपी के लिए युग्मित ध्यान केंद्रित अंशांकन डिवाइस का उपयोग एक ही समय में कई कुओं में विभिन्न पदों के दर्जनों प्राप्त करने की अनुमति देता है.
2. शिगेला flexneri (35 मिमी गिलास नीचे स्वरूप, MatTek) का उपयोग करना लाइव नमूने पर CCF4 परख
- रात भर संस्कृतियों के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. पहले से वर्णित के रूप में आगे बढ़ें.
- संक्रमण के लिए चढ़ाना कोशिकाओं. 2 x 10 5 कोशिकाओं / 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में पकवान की एक घनत्व में 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन (MatTek 10 मिमी microwell, MatTek निगम) के संक्रमण से पहले 1 दिन में बीज HELA कोशिकाओं.
- उपसंस्कृति के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. पहले से वर्णित के रूप में आगे बढ़ें.
- CCF4-AM के साथ कोशिकाओं लोड हो रहा है. पहले से पकवान प्रति 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के रूप में वर्णित CCF-AM के लदान मिश्रण तैयार करें. लोड करने से पहले, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोने.
- संक्रमण के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. पहले से वर्णित के रूप में आगे बढ़ें.
- Acquisitजीना नमूने के आयन सेटिंग्स. अधिग्रहण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ताप कक्ष के अंदर एक 20x (0.5 एनए, 2.1 MD) या एक 40x (0.75 एनए, 0.72 G) एन योजना हवा उद्देश्य का उपयोग कर एक औंधा epifluorescence खुर्दबीन के साथ 60 मिनट हर 90 सेकंड के लिए किया जाता है. प्रतिदीप्ति इमेजिंग 405 एनएम उत्तेजना के साथ प्रदर्शन (Semrock, FF01-387/11-25) और उत्सर्जन 450 एनएम (Semrock, FF02-447/60-25) और 535 एनएम फिल्टर (Semrock, के माध्यम से पता चला है FF01-520/35- 5 मिसे (प्रेषित प्रकाश), 200 मिसे (535 एनएम) और 100 मिसे (450 एनएम) के प्रदर्शन के समय का उपयोग कर 25).
- सेल संक्रमण और जीने अधिग्रहण. 2 मिलीलीटर पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें,, ईएम के 2 मिलीग्राम / 1 मिमी प्रोबेनेसिड जोड़ने खुर्दबीन के मंच पर पकवान माउंट और अधिग्रहण शुरू. 6 मिनट (समय 4 अंक), पकड़ पर अधिग्रहण डाल के बाद, कोशिकाओं के शीर्ष पर बैक्टीरिया मेजबान के 250 μl जोड़ने और अधिग्रहण को पुनः आरंभ.
- अधिग्रहण के बाद विश्लेषण. सिनेमा Metamorph या ImageJ का उपयोग देखे जा सकते हैं. प्रत्येक व्यक्तिगत के लिए 450/535 एनएम तीव्रता अनुपातदोहरी सेल ImageJ का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. पहले उल्लेख किया है, अधिग्रहण के दौरान स्वचालित माइक्रोस्कोपी के लिए युग्मित ध्यान केंद्रित अंशांकन उपकरण के उपयोग के समय चूक के आधार पर कई अलग अलग पदों पर प्राप्त करने की अनुमति देता है.
3. का प्रयोग निश्चित नमूने पर CCF4 परख माइक्रोबैक्टीरिया (96 प्रारूप)
- बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. बढ़ो 30 डिग्री सेल्सियस (माइकोबैक्टीरियम marinum के लिए) या 37 डिग्री सेल्सियस (माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के लिए) पर catalase एल्बुमिन डेक्सट्रोज (एडीसी) युक्त 7H9 में मध्य लॉग चरण के लिए माइक्रोबैक्टीरियल उपभेदों.
- संक्रमण के लिए चढ़ाना कोशिकाओं. 2 दिनों के संक्रमण से पहले प्लेट THP-1 मैक्रोफेज RPMI में 30 एनएम पीएमए 10% से युक्त के साथ उन्हें incubating भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के अंतिम मात्रा में एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.05 मिमी 2-mercaptoethanol 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह के घनत्व पर 100 μl.
- संक्रमण के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है. हार्वस्था संस्कृतियों, धोने और clumping से बचने के लिए एक सिरिंज के माध्यम से sonication के और निस्पंदन पहले पीबीएस के साथ resuspend. OD600 माप से प्रत्येक तनाव की एकाग्रता का निर्धारण और 5% के साथ 30 डिग्री सेल्सियस (माइकोबैक्टीरियम marinum के लिए) या RPMI मध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस (माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के लिए) पर एक MOI 1:1 पर THP-1 कोशिकाओं को संक्रमित सीओ 2. 2 घंटे के बाद, मध्यम हटाने पीबीएस के साथ 3 बार धोने और 1 से 2 दिनों (माइकोबैक्टीरियम marinum के मामले में) या 3 से 7 दिनों (माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के मामले में) के लिए पूर्ण ताजा मध्यम जोड़ें.
- CCF4-AM और निर्धारण के साथ कोशिकाओं लोड हो रहा है. पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और पहले 6 माइक्रोन की एक CCF4-AM अंतिम एकाग्रता का उपयोग अच्छी तरह से प्रति 25 μl के अंतिम मात्रा के रूप में वर्णित CCF4-AM लोडिंग मिश्रण तैयार करते हैं. लोड हो रहा है 150 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड से धोने से पहले 2 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर जगह लेता है और तय4% से कम 50 μl paraformaldehyde का उपयोग कर समझना अंधेरे में 30 मिनट के लिए probenecid with1 मिमी पूरक. फिर, 150 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड से धो लें और 100 μl पीबीएस / 1 मिमी प्रोबेनेसिड में नमूने छोड़ दें.
- अधिग्रहण सेटिंग्स और अधिग्रहण के बाद विश्लेषण. पहले शिगेला flexneri का उपयोग कर पहले पैराग्राफ में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें.
पूरक प्रोटोकॉल
Fluorimetric assays के बैक्टीरिया की सतह पर β-lactamase गतिविधि की जांच के क्रम में प्रदर्शन कर रहे हैं. यह वर्णित परख में इस्तेमाल किया जा करना प्रत्येक बैक्टीरियल तनाव के लिए किया जाना चाहिए. इस प्रयोजन के लिए, धोया बैक्टीरिया अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 100 एनएम CCF4-AM (Invitrogen), 50 ग्राम / एमएल सुअर का esterase जिगर अर्क (सिग्मा) के साथ संपर्क में डाल रहे हैं. घुलनशील लैक्टामेज़ 1 मिलीग्राम / एमएल (Invitrogen) के एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर, एक उत्सर्जन स्कैन एक पीटीआई Quantamaster fluorimeter और एक 1 मिलीलीटर गेलन का उपयोग कर 405nm उत्तेजना में किया जाता हैजेड क्युवेट. के नुकसान के 535 एनएम पर झल्लाहट और एक उच्च 450 एनएम चोटी की उपस्थिति CCF4 जांच करने के लिए बैक्टीरिया अलावा पर दिखाए जा रहे हैं.
Representative Results
CCF4-AM/β-lactamase दृष्टिकोण इस तरह के शिगेला flexneri (चित्रा 1) के रूप में intracellular रोगज़नक़ों के vacuolar टूटना पर नज़र रखने के लिए एक मजबूत और संवेदनशील तरीका है. इस अध्ययन में इस्तेमाल किया जाता है कि शिगेला उपभेदों M90T AfaI और BS176 AfaI कहा जाता है. M90T AfaI कुशलतापूर्वक उपकला कोशिकाओं की सतह 15 में CD55 बाध्य करने में सक्षम है जो adhesin AfaE, व्यक्त करता है कि एक शिगेला flexneri तनाव है. इसलिए AfaE व्यक्त उपभेदों उपकला कोशिकाओं में जंगली प्रकार M90T तनाव की तुलना में काफी ज्यादा आक्रमण क्षमताओं को प्रदर्शित करते हैं. BS176 AfaI प्लाज्मिड शिगेला द्वेष से रहित उत्परिवर्ती शिगेला flexneri तनाव व्यक्त एक AfaE है. इस तनाव HELA कोशिकाओं पर आक्रमण करने में असमर्थ है. फिर भी इस तनाव इस सेल लाइन में तेज शास्त्रीय phagocytosis पर ही भरोसा करते हैं और एक कार्यात्मक टाइप -3 स्राव प्रणाली की आवश्यकता नहीं है क्योंकि THP-1 कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम है. दोनों उपभेदों β-lactamase व्यक्त, और प्लाज्मिड AfaE एनकोडिंग की उपस्थिति के कारण उनकी सतह पर प्रदर्शन β-lactamase गतिविधि. 1 घंटे के लिए गैर इनवेसिव BS176 AfaI तनाव के साथ हेला सेल संक्रमण होने पर, CCF4 हरी झंडी (535 एनएम) द्वारा 2A चित्रा में दिखाया गया है जांच, बरकरार है झल्लाहट. इसके विपरीत, 1 घंटे के लिए विषमय M90T AfaI तनाव के साथ संक्रमण cytosol में जांच की दरार पर प्रकाश डाला नीले (450 एनएम) की ओर संकेत की एक स्विच की ओर जाता है. यह मात्रा ठहराना करने के लिए, हम स्वचालित कोशिकाओं का पता लगाने और ratiometric संकेत के निर्धारण के लिए 535 और 450 एनएम चैनलों में तीव्रता की माप की अनुमति देता है कि Metamorph और Acapella सॉफ्टवेयर के लिए एक स्क्रिप्ट का विकास किया. जैसा कि चित्र 2 बी में दिखाया गया है, नाभिक और कोशिकाओं की साइटोसॉल DRAQ5 चैनल का उपयोग हिस्सों में बंटा हुआ है. फिर, एल्गोरिथ्म है कि प्रत्येक व्यक्ति सेल के लिए दो तीव्रता के बीच अनुपात की गणना के लिए 450 एनएम और 535 एनएम सकारात्मक सेल आबादी का पता लगाने में सक्षम हैचित्रा -2 में एक हिस्टोग्राम के रूप में प्रतिनिधित्व किया. कम अनुपात विषमय तनाव के लिए उच्च अनुपात बनाम उत्परिवर्ती तनाव के लिए प्राप्त कर रहे हैं. इस प्रतिनिधि संक्रमण प्रयोग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग अधिग्रहण कर लिया था, वहीं epifluorescence माइक्रोस्कोपी भी इस कार्य के लिए अनुकूल है 2 विभिन्न मानव कोशिका प्रकार के उपयोग के आंकड़े 3 और 4 शो उदाहरण:. हेला उपकला कोशिकाओं और THP-1 बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह. उग्र M90T AfaI शिगेला 1 घंटे के लिए तनाव और हेला और THP-1 कोशिकाओं, नीले रंग के लिए हरे (535 एनएम) से संकेत की एक स्विच के लिए 90 मिनट के साथ संक्रमण होने पर (450 एनएम) BS176 AfaI संक्रमित कोशिकाओं (आंकड़े 3 ए की तुलना में मनाया जाता है और 4 ए). हम MetaMorph सॉफ्टवेयर को विकसित लिपि कोशिकाओं के सीधे CCF4 सकारात्मक जनसंख्या का पता लगाता है और 450 में तीव्रता और प्रत्येक व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए 535 एनएम चैनलों के बीच अनुपात की गणना. फिर कोशिकाओं एक मैक्रो विकास का उपयोग कर उनके अनुपात के एक समारोह के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैंएक्सेल में ped, इस प्रकार सेल वितरण दिखा हिस्टोग्राम उपज. यह Acapella के लिए विकसित अन्य स्क्रिप्ट के लिए मुकदमा किया गया है जैसा कि M90T AfaI संक्रमित कोशिकाओं HELA कोशिकाओं और THP-1 मैक्रोफेज (आंकड़े 3 बी और 4 बी) पर MetaMorph कलन विधि का उपयोग उच्च अनुपात प्रदर्शित जबकि BS176 AfaI संक्रमित कोशिकाओं, कम अनुपात की विशेषता है . अंत में, माइक्रोबैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए इस विधि का एक रूपांतर चित्रा 5 में दिखाया गया है. माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी के रूप में प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम में पता लगाया मजबूत 535 एनएम संकेत से परिलक्षित होता है, प्रयोग के पूरे पाठ्यक्रम के लिए फेगोसोम में रहता है. इसके विपरीत, माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के संक्रमण के 7 दिनों (चित्रा 5A और 5 ब) में एक 450 एनएम संकेत से प्रकाश डाला के रूप में संक्रमण का अधिक से अधिक 3 दिनों के बाद THP-1 मैक्रोफेज में phagosomal झिल्ली टूटना elicits. शिगेला द्वारा vacuolar टूटना का अध्ययन करने के लिए के रूप में एक ही एल्गोरिथ्म का उपयोग माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमण से 7 दिनों (आंकड़े 5C और 5D) के बाद माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी से अधिक 450/535 एनएम अनुपात प्रदर्शित पाया.
चित्रा 1. ट्रैकिंग शिगेला flexneri vacuolar टूटना के लिए CCF4-AM/β-lactamase परख का सिद्धांत. का प्रतिनिधित्व योजना CCF4-AM आज़ादी एस्टर moieties CCF4 anions के उत्पादन साइटोसोलिक esterases द्वारा बंद cleaved रहे हैं जहां cytoplasm में प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से diffuses. इस प्रतिक्रिया किसी भी झिल्ली एम्बेडेड डिब्बे में प्रवेश करने से CCF4 रोकता है. इस चरण में, CCF4 405 एनएम उत्तेजना पर 535 एनएम पर झल्लाहट elicits. जांच β-lactamase व्यक्त बैक्टीरिया ruptur तक बरकरार हैendocytic रिक्तिका ए. इस चरण में, CCF4 β-lactamase 405 एनएम उत्तेजना पर 450 एनएम के लिए 535 एनएम से उत्सर्जन में एक स्विच ट्रिगर द्वारा cleaved है क्योंकि संकेत खो दिया है झल्लाहट.
चित्रा 2. Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग शिगेला flexneri vacuolar टूटना ट्रैकिंग. (ए) CCF4-AM के लदान के 2 घंटे 30 मिनट के बाद, हेला सेल 1 घंटा और निश्चित के लिए β-lactamase व्यक्त शिगेला flexneri BS176 AfaI उत्परिवर्ती तनाव या M90T AfaI विषमय तनाव से संक्रमित हैं 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के प्रयोग से. फिर, नाभिक DRAQ5 साथ दाग रहे हैं और कोशिकाओं को एक 10x उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged हैं. प्रतिनिधि चित्रों निम्नलिखित विलय चैनलों के साथ चुना गया: बरकरार CCF4 जांच 535 एनएम (gree में प्रकट होता हैएन), cleaved CCF4 जांच 450 एनएम (नीला) में दिखाई देता है. Acapella सॉफ्टवेयर पर हमारी स्वचालित एल्गोरिथ्म की पहचान प्रणाली पर प्रकाश डाला चित्रों का (बी) के उदाहरण हैं. कोशिकाओं (नाभिक + साइटोसॉल) के विभाजन DRAQ5 चैनल का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है. CCF4 सकारात्मक कोशिकाओं को एक साथ जमा 450 और 535 एनएम चैनलों का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. (सी) हिस्टोग्राम शिगेला flexneri BS176 AfaI उत्परिवर्ती तनाव या M90T AfaI विषमय तनाव का उपयोग Acapella पर हमारी स्वचालित विश्लेषण का परिणाम दिखा रहा है. मतलब यह अनुपात 450 और 535 एनएम चैनलों में तीव्रता के बीच अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. शिगेला fle ट्रैकिंगepifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर HELA कोशिकाओं में xneri vacuolar टूटना. (ए) CCF4-AM के लदान के 2 घंटे 30 मिनट के बाद, HELA कोशिकाओं 1 घंटा और के लिए β-lactamase व्यक्त शिगेला flexneri BS176 AfaI उत्परिवर्ती तनाव या M90T AfaI विषमय तनाव से संक्रमित हैं 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde का उपयोग कर तय. फिर, कोशिकाओं को एक 20x उद्देश्य के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged हैं. प्रतिनिधि चित्रों निम्नलिखित चैनलों के साथ चुना गया:. CCF4 बरकरार जांच 535 एनएम (हरा) और CCF4 cleaved जांच 450 एनएम (नीला) (बी) MetaMorph सॉफ्टवेयर पर हमारी स्वचालित विश्लेषण के नतीजे का प्रतिनिधित्व हिस्टोग्राम. व्यक्ति की कोशिकाओं 450 और 535 एनएम चैनलों में तीव्रता के उनके अनुपात के समारोह में वितरित कर रहे हैं.
> चित्रा 4. Epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर THP-1 कोशिकाओं में शिगेला flexneri vacuolar टूटना ट्रैकिंग. (ए) CCF4-AM लोड हो रहा है, के 2 घंटे 30 मिनट के बाद THP-1 कोशिकाओं β-lactamase व्यक्त शिगेला flexneri BS176 AfaI उत्परिवर्ती तनाव या M90T AfaI से संक्रमित होते हैं 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde का उपयोग कर 1 घंटा 30 मिनट और निश्चित के लिए विषमय तनाव. फिर, कोशिकाओं को एक 20x उद्देश्य के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged हैं. प्रतिनिधि चित्रों निम्नलिखित चैनलों के साथ चुना गया:. CCF4 बरकरार जांच 535 एनएम (हरा) और CCF4 cleaved जांच 450 एनएम (नीला) (बी) MetaMorph सॉफ्टवेयर का उपयोग हमारी स्वचालित विश्लेषण के नतीजे का प्रतिनिधित्व हिस्टोग्राम. व्यक्ति की कोशिकाओं 450 और 535 एनएम चैनलों में तीव्रता के उनके अनुपात के समारोह में वितरित कर रहे हैं.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
चित्रा 5. ट्रैकिंग माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी और epifluorescence माइक्रोस्कोपी. (ए, बी) का उपयोग THP-1 मैक्रोफेज में माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग phagosomal टूटना THP-1 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए β-lactamase व्यक्त माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी या माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग से संक्रमित है और 3 से 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत हैं . धोने के बाद, कोशिकाओं के साथ लोड कर रहे हैं CCF-4-AM 2 घंटा और नियत एक 40x उद्देश्य के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde का उपयोग करने के लिए. . Cleaved CCF4, जांच 450 एनएम (नीला) (सी, डी) MetaMorph सॉफ्टवेयर का उपयोग हमारी स्वचालित विश्लेषण के नतीजे पेश Histograms बरकरार CCF4 जांच, 535 एनएम (हरा): प्रतिनिधि चित्रों निम्नलिखित चैनलों के साथ चुने गए हैं. व्यक्तिगत कोशिकाओं 450 और 535 एनएम चैनलों में तीव्रता के बीच अनुपात के समारोह के रूप में वितरित कर रहे हैं.
Discussion
CCF4-AM/β-lactamase परख इंट्रासेल्युलर शिगेला flexneri और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में माइक्रोबैक्टीरिया से प्रेरित vacuolar व्यवधान ट्रैक करने के लिए एक सरल तरीका है. यह बैक्टीरिया की सतह पर सक्रिय एक एंजाइम द्वारा cleaved है कि एक लैक्टामेज़ संवेदनशील साइटोप्लाज्मिक झल्लाहट संवाददाता का उपयोग करता है.
CCF4-AM सब्सट्रेट के नुकसान को आसानी से सब्सट्रेट के लोड करने के बाद सभी समाधान के लिए प्रोबेनेसिड जोड़कर बचा जा सकता है. प्रदर्शन के रूप में, परख अनेक प्रकार की कोशिकाओं (उपकला कोशिकाओं, phagocytic कोशिकाओं) और प्रारूपों (96, 35 मिमी गिलास नीचे बर्तन, 6/12/24 अच्छी तरह प्लेटें) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. 6/12/24 अच्छी तरह से थाली के उपयोग के लिए, बाँझ coverslips कोशिकाओं को बोने से पहले प्रत्येक कुएं के तल पर वितरित कर रहे हैं. प्रयोग के अंत में, coverslips के गोल्ड antifade अभिकर्मक (Invitrogen) के लम्बा जैसे, बढ़ते मध्यम में स्लाइड्स पर स्थानांतरित कर रहे हैं. इस तरह के संकेत परख के बाद अब समय अवधि के लिए स्थिर हैनमूने निर्धारण के बाद पीबीएस में संरक्षित कर रहे हैं जहां 96 कुओं प्रारूप की तुलना में. CCF4-AM सब्सट्रेट की उच्च लागत नमूना मात्रा के निर्धारण से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए. हम उन्हें नीचे स्केलिंग की अनुशंसा करते हैं. प्रयोगों 6/12/24 अच्छी तरह प्रारूप में अधिक महंगे हैं, लेकिन संकेतों दिनों के लिए स्थिर रहे हैं. इसके विपरीत, प्रयोगों 96 प्रारूप में सस्ता कर रहे हैं, लेकिन नमूने प्रयोग के दिन पर विश्लेषण किया जाना है. यह जीना प्रयोगों को भी 96 या 384 भी प्रारूप में प्रदर्शन किया जा सकता है कि उल्लेखनीय है. यह अच्छी तरह से प्रति पदों की संख्या के साथ एक ही समय (उत्परिवर्ती बैक्टीरिया, MOI, प्लाज्मिड या siRNA अभिकर्मक, रसायन आदि) में शर्तों के दर्जनों का उपयोग रहते प्रयोग का प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. शिगेला flexneri के लिए अनुकूल है, हम संक्रमण चक्र cytosol में बनाए रखा जा सकता है कि CCF4 की औसत दर्जे का सांद्रता अधिक है क्योंकि "सच" वास्तविक समय या समय चूक प्रयोगों माइक्रोबैक्टीरिया पढ़ाई के लिए संभव नहीं है कि प्रकाश डाला. के लिएइस कारण, CCF4-AM सब्सट्रेट आक्रमण हासिल होने के बाद ही कोशिकाओं पर लागू किया जाता है.
MetaMorph सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है मामले में, हम अच्छी तरह से प्रति चित्रों की एक निर्धारित संख्या के साथ एक संपूर्ण 96/384 अच्छी तरह से थाली प्राप्त करने की अनुमति देता है कि मॉड्यूल "स्क्रीन अधिग्रहण" का उपयोग करने की सलाह देते हैं. इसके अलावा, मॉड्यूल "समीक्षा स्क्रीन डेटा" की अनुमति देता है (मैं) एक बड़ी "पोस्टर" पर एक ही समय में किसी भी चैनल के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के सिले तस्वीर मोज़ेक visualizing और (ii) 535 में तीव्रता को मापने के लिए एक विशेष एल्गोरिथ्म पाशन और 450 एनएम चैनल. हालांकि, हम समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक बैक्टीरिया द्वारा vacuolar टूटना को मापने के लिए सक्षम किया गया है, हम प्रतिपादन व्यक्ति जीवाणुओं की सतह पर enzymatic गतिविधि यह मुश्किल ठीक इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया और vacuolar की प्रभावशीलता की संख्या सहसंबंधी तक की हो सकती है कि सावधानी करना चाहते हैं टूटना.
परख की मजबूती को देखते हुए यह घंटे के लिए अनुकूल हैigh throughput के 96 या 384 अच्छी तरह स्वरूपों में दृष्टिकोण. हम भी सफलतापूर्वक निलंबन 16 में कोशिकाओं के संक्रमण का अध्ययन करने के FACS विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल को ढाल लिया है. परख भी आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अग्रणी, उनकी सतह पर लैक्टामेज़ पेश अन्य बैक्टीरिया या वाहकों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण β-lactamase व्यक्त लीजोनेला pneumophila, लिस्टेरिया monocytogenes या साल्मोनेला के रूप में 12 अन्य रोगजनकों द्वारा प्रेरित vacuolar टूटना अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लिस्टेरिया monocytogenes शिगेला flexneri लिए तुलनीय एक छोटी संक्रमण चक्र के बाद से, समय चूक प्रयोगों संभव हो रहे हैं. इसके विपरीत, क्योंकि लीजोनेला pneumophila और साल्मोनेला प्रदर्शन लंबे संक्रमण चक्र, हम अंत बिंदु प्रयोगों प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं.
संभव आवेदनों की विविधता CCF4-AM/β-lactamase परख एक बनाता हैनिश्चित नमूनों में या वास्तविक समय में intracellular रोगजनकों द्वारा प्रेरित vacuolar टूटना पर नज़र रखने के लिए दिलचस्प fluorometric विधि.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम एजेंस नेशनल डालना ला Recherche द्वारा और यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
