Summary
Procédé pour mesurer la longueur de persistance ou la rigidité en flexion de biopolymères est décrit. La méthode utilise une kinésine axée sur les microtubules glisse test pour déterminer expérimentalement la longueur de persistance des microtubules individuels et est adaptable à l'actine des essais à base de glisse.
Abstract
Les microtubules sont des polymères du cytosquelette qui jouent un rôle dans la division cellulaire, mécanique cellulaire et le transport intracellulaire. Chacune de ces fonctions nécessite microtubules qui sont raides et droites assez pour couvrir une fraction significative du diamètre cellulaire. En conséquence, la longueur de persistance des microtubules, une mesure de rigidité, a été activement étudiée pour les deux dernières décennies 1. Néanmoins, des questions restent ouvertes: microtubules courts sont 10-50 fois moins rigide que les microtubules longues 2-4, et même microtubules longs ont mesuré la longueur de persistance qui varient d'un ordre de grandeur 5-9.
Ici, nous présentons une méthode pour mesurer la longueur de persistance des microtubules. La méthode est basée sur une analyse axée sur la kinésine microtubules glisse 10. En combinant rares marquage fluorescent des microtubules individuels avec suivi de particule unique de fluorophores individuelles attachées à des microtubules, le Glidintrajectoires g de microtubules simples sont suivis du nanomètre-niveau de précision. La longueur de persistance de la trajectoire est la même que la longueur de persistance de l'microtubules dans les conditions utilisées 11. Un sous-programme de suivi automatisé est utilisé pour créer des trajectoires des microtubules à partir de fluorophores liés aux microtubules individuels, et la longueur de persistance de cette trajectoire est calculée à l'aide des routines écrites en langage IDL.
Cette technique est rapidement réalisable, et capable de mesurer la longueur de persistance de 100 microtubules dans un jour de l'expérimentation. La méthode peut être étendue pour mesurer la longueur de persistance sous une variété de conditions, y compris la durée de persistance en fonction de la longueur le long des microtubules. En outre, les routines d'analyse utilisés peuvent être étendus à la myosine à base de tests effet de glisse, pour mesurer la longueur de persistance des filaments d'actine ainsi.
Protocol
1. Microtubules vol à voile Assay Solutions mères
Préparer à l'avance de dosage glisse.
- Polymériser 0,5 mg microtubules peu marquées avec un fluorophore organique lumineuse 22. La concentration étiquette cible est de 1 fluorophore par micromètre de microtubules, soit une densité étiquetage d'environ 1 fluorophore par 1.500 dimères de tubuline. Entreposer à la température ambiante, la lumière protégée avec de l'aluminium, une feuille pour un maximum de deux semaines.
- Purifier biotine-kinésine 21 à environ 1 uM. Conserver à -80 ° C en 5 aliquotes pour utilisation dans des expériences individuelles.
- Préparer le tampon de dosage (AB) de 50 mM imidiazole, 50 mM de chlorure de potassium (KCl), 4 mM de chlorure de magnésium (MgCl 2), 2 mM d'éthylène-glycol d'acide tétraacétique (EGTA), pH 6,7. Filtre stérile et conserver à 4 ° C.
- Dissoudre biotinylé albumine de sérum bovin (BSA-biotine) à 2 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue.Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un mois.
- Dissoudre la streptavidine (SA) à 10 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 20 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines.
- Dissoudre α-caséine à 5 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines.
- Dissoudre dithiothréitol (DTT) dans de l'eau déminéralisée à 200 mM. Conserver à -20 ° C en aliquotes de 100 pi, utiliser dans les 8 heures de décongélation. Peut-être recongelé.
- Dissoudre le paclitaxel (PT) en HPLC du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 4 mM. Boutique en 10 aliquotes à -80 ° C à long terme, de -20 ° C à court terme. Utiliser dans les 8 heures suivant la décongélation. Peut-être recongelé.
- Dissoudre le glucose dans de l'eau désionisée à 120 mg / ml. Conserver dans aliquotes de 100 pi à -20 ° C. Peut-être recongelé.
- Disrésoudre l'adénosine triphosphate (ATP) dans de l'eau déminéralisée à 150 mM, pH 7,0. Boutique en 5 aliquotes à -80 ° C, utiliser dans les 8 heures de décongélation.
- Préparer stocks d'oxygène 100x balayage 25 par dissolution de 10.000 unités de glucose-oxydase et catalase 156.000 unités dans 600 ul du tampon de dosage total. Centrifuger brièvement dans une microcentrifugeuse à granulés solides; surnageant filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 10 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant une semaine.
2. Microtubules Gliding test, même Préparation de la solution Jour
Préparer les solutions de 02.01 à 02.06 le jour de l'expérience. Avec la pratique, les solutions de 2.2 à 2.6 peuvent être préparés pendant l'écoulement des cellules lavage. Sauf indication contraire, gardez solutions mères sur la glace.
- Préparer AB, 1 ml de tampon de dosage avec 10 ul de la TNT stock (AB avec 2 mM de DTT). Conserver à température ambiante.
- Préparer bio-BSA tampon, 40 & mu, L d'un mélange 1:1 du stock biotine-BSA et AB. Conserver à température ambiante.
- Préparer un tampon BSA, mélangeant 645 ul de AB avec 5,5 ul de BSA (1 mg / ml de BSA dans AB). Conserver à température ambiante.
- Préparer un tampon SA, en mélangeant 57 ul de AB avec 3 streptavidine actions ul (0,5 mg / ml de streptavidine dans AB). Conserver à température ambiante.
- Préparer α-caséine tampon, mélanger 200 pi de tampon BSA, 50 ul de stock caséine et 0,8 ul de 15 uM (1 mg / ml α-caséine, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM d'ATP dans AB) ATP. Conserver à température ambiante.
- Préparer la fluorescence anti-eau de Javel tampon, mélangeant 95 pl de tampon α-caséine, 2,5 ul de stock de glucose, 1 ul mélange d'oxygène 100x balayage, 1 stock paclitaxel pi, 1 pi 2-mercaptoéthanol (ßME). Ajouter ßME sous une hotte. Utilisez la fluorescence anti-eau de Javel tampon dans 1 h de préparation. ATTENTION: ßME est hautement toxique et sent mauvais. Assurez-vous d'être ouvert uniquement sous la hotte. Bouteille dans le magasinl'absence de lumière, la lumière dégrade ßME et sa capacité à réduire photoblanchiment.
3. Microtubules Gliding Assay
- Construire environ quatre voies d'écoulement entre une lamelle 24 x 60 mm et 22 mm x 22 lamelle avec de la graisse à vide, extrudés à partir d'une seringue à travers un embout de pipette, comme un élément d'espacement. Chaque voie d'écoulement doit être d'environ 10 pi en volume (échelle des volumes suivants en conséquence).
- Lavez 10 ul de bio-BSA tampon dans chaque couloir. Incuber 5 minutes pour permettre BSA pour revêtir les surfaces de verre.
- Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour enlever la biotine libre-BSA, tout en continuant à bloquer la surface de glissement. Utilisez un Kimwipe ou de papier filtre pour éliminer le tampon du côté opposé de chambre d'écoulement, en étant sûr de ne pas laisser de bulles d'air à passer par la chambre d'écoulement.
- Lavez 15 pi SA-tampon dans chaque couloir. Attendre 10 minutes, ou jusqu'à 2 heures. La streptavidine se lie à la biotine lié à la surface-BSA.
- Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour retirer gratuitement SA, tout en continuant de bloquer la surface de glissement.
- Laver chaque voie avec 15 ul de tampon α-caséine. α-caséine permet en outre de bloquer liaison non spécifique de la kinésine et des microtubules dans le verre.
- Diluer kinésine à 10 nM dans α-caséine tampon et laver chaque voie avec 15 ul de cette kinésine - α-caséine solution. Attendre 15 minutes (ou jusqu'à une heure) de la kinésine biotinylé de se lier spécifiquement à la streptavidine liée à la surface. Les domaines kinésine moteur resteront libres de lier les microtubules.
- Diluer le paclitaxel à 40 pM dans la température ambiante α-caséine tampons, et laver chaque voie avec 15 ul de cette solution pour laver la kinésine libre et de pré-charger chaque chambre d'écoulement avec une solution de paclitaxel pour éviter de dépolymérisation des microtubules. Froide dépolymérise également microtubules, alors assurez-vous que ces étapes se produisent à température ambiante avec salle de temre des solutions.
- Diluer marqué par fluorescence microtubules 1:100-1:1,000 de la fluorescence anti-eau de Javel tampon avec 1 mM d'ATP. Lavez 15 ul dans une voie et d'observer dans les 30 minutes.
4. Collecte des données
- Observez le glissement des microtubules en utilisant la microscopie à fluorescence, un microscope capable de résoudre fluorophores simples comme une installation commerciale ou maison de construction FRBR est nécessaire 26 (figure 2).
Les microtubules devrait être propulsé par les moteurs de kinésine sur le substrat à environ 0,5 mm / s, en fonction de la température. Si le champ de vision du microscope est de 50 um, les microtubules individuels doit être visible pendant environ 100 secondes. Réglez l'intensité lumineuse de telle sorte que les fluorophores simples ne photoblanchiment plus vite que 100 sec. Si l'on utilise une excitation laser, un réglage de puissance de l'ordre de 3-5 mW est approprié. - Recueillir des séquences d'images pour l'analyse. 600 images à5 Hz (2 min au total) fonctionne bien. Utiliser des séquences assez longtemps que les microtubules traversent l'ensemble du champ de vision.
5. Analyse des données
Une routine IDL, get_lp.pro , est annexé. Cette routine renvoie une valeur de longueur de persistance basée sur les microtubules glisse dans une séquence d'images donné. Soit exécuter cette routine sur chaque séquence d'images, la modification des paramètres d'intensité en fonction de la configuration de votre microscope particulier, ou procédez comme suit:
- Suivre chaque fluorophore attaché à un microtubule à créer des trajectoires fluorophores.
- Mélanger tous les trajectoires des fluorophores sur un microtubule donné dans une trajectoire globale des microtubules; répétez pour chaque microtubules dans la séquence d'images (figure 3).
- Calculer l'angle de la tangente à chaque point le long de la trajectoire (figure 4), Et calculer <cos θ s> dans l'équation. 1 en faisant la moyenne du cosinus de la différence d'angle pour chaque paire de points séparés par un chemin de longueur l (figure 5). Trouver la longueur de persistance pour un microtubule ou un groupe de microtubules par <cos montage θ s> à Eq. 1, la pondération des points de données individuels dans l'ajustement par le nombre de valeurs indépendantes du cos θ s qui sont utilisés pour calculer la moyenne.
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Discussion
Les mesures de longueur de persistance sont une bonne caractérisation des propriétés mécaniques des biopolymères individuels. Dans cet article, nous avons décrit une méthode de mesure de la longueur de persistance des microtubules. Comme indiqué dans l'introduction, cette méthode est facilement étendu à l'examen des propriétés mécaniques des microtubules dans une variété de conditions tout simplement en faisant varier les réactifs, la température, la viscosité ou à l'étape finale de l'épreuve de glisse, 3,9, ou par polymérisation des microtubules, étape 1.1, dans des conditions différentes.
La technique elle-même est rapide à réaliser. Une fois les solutions mères ont été préparées à l'avance (étape 1), une expérience de glisse test peut être effectué en 2-3 heures, dont un maximum de quatre variations des conditions sur une lame de microscope unique (les quatre voies dans l'étape 3.1). De nombreux microtubules peut être examinée dans chaque expérience; expériences typiques dans notre laboratoire examiner 100 microtubules par condition (environ 10 séquençage d'imagees par voie, avec 10 microtubules par séquence). L'analyse de grands ensembles de données est également assez rapide. Avec la pratique, 10 séquences d'images peuvent être analysées pour longueur de persistance dans l'après-midi ou alors avec un PC moderne. L'étape limitante dans l'analyse est le temps de suivre les fluorophores individuelles; nouvelles méthodes de suivi promettent d'augmenter cette vitesse sensiblement 27.
Parce que la méthode implique le suivi des fluorophores individuelles attenantes à un microtubule donné, la précision du suivi est limitée uniquement par la collecte de photons, et peut-être à l'échelle du nanomètre 22, 25. En incluant les données de fluorophores nombreux, la précision est encore améliorée. Potentiellement, une précision encore plus élevée pourrait être atteint en fixant des objets très lumineux fluorescents, tels que les points quantiques, à l'microtubules.
Alors que la précision des trajectoires individuelles est assez bonne, la persistance de l'incertitude dans lengths mesurées avec cette technique (sur l'échelle de ± 50% pour un microtubule simple) est encore important. La principale limitation de la précision des mesures de la longueur de persistance sont les statistiques impliqués dans la moyenne cos θ s. Que la longueur de contour entre des paires de points, s, augmente, le nombre de mesures indépendantes de θ s diminue lorsque L / s, où L est la longueur de la trajectoire des microtubules étudié. Augmentation de la longueur des trajectoires des microtubules permettrait d'améliorer la précision dans les mesures de longueur de persistance.
Une deuxième limitation de cette méthode est l'exigence que biotinylé kinésine-1 être utilisé pour la fixation spécifique de la kinésine pour lames de microscope. Kinésine biotinylé doit être purifié (à partir de E. Coli dans notre cas), et ne peuvent pas simplement être achetés dans le commerce. Cependant, un dosage modifié glisse à l'aide kin unbiotinylatedesin peut être utilisé 28; protéine kinésine chaîne lourde qui peut être adapté à cette technique est disponible dans le commerce à partir du cytosquelette (KR01). Modification du test en vol plané vers utilisez cette kinésine autre n'affecterait pas la rigidité à la flexion des microtubules en aucune façon, et permettrait ainsi des groupes qui n'ont pas accès à la protéine recombinante kinésine d'utiliser cette méthode.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Melissa Klocke d'assistance préparer la Figure 1 et Anna Ratliff pour démontrer le protocole. Ce travail a été soutenu par la Société pour l'avancement de la recherche scientifique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
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