Summary
שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.
Abstract
Microtubules הם פולימרי cytoskeletal אשר ממלאים תפקיד בחלוקת תאים, מכניקה של תאים, ותחבורה תאית. כל אחת מהפונקציות הללו דורש microtubules שנוקשים וישר מספיק כדי להקיף חלק משמעותי של קוטר התא. כתוצאה מכך, אורך microtubule התמדה, מידה של נוקשות, נחקר באופן פעיל בשני העשורים האחרונים 1. עם זאת, נותרו שאלות פתוחות: microtubules הקצר הם 10-50 פעמים פחות נוקשה מאשר microtubules הארוך 2-4, ואפילו microtubules הארוך מדד אורכי התמדה המשתנים על פי סדר הגודל 5-9.
כאן, אנו מציגים שיטה למדידת אורך התמדת microtubule. השיטה מבוססת על בדיקת גלישת microtubule kinesin מונחה 10. על ידי שילוב של ניאון תיוג דליל של microtubules הבודד עם מעקב אחת של חלקיק הבודד fluorophores המצורף לmicrotubule, glidinמסלולי G של microtubules הבודד מתבצעים מעקב בדייקנות ננומטר ברמה. אורך ההתמדה של המסלולים הוא זהה לאורך ההתמדה של microtubule בתנאים המשמשים 11. שגרת מעקב אוטומטית משמשת ליצירת מסלולי microtubule מfluorophores המצורף לmicrotubules הבודד, ואורך ההתמדה של מסלול זה מחושב באמצעות רוטינות שנכתבו בIDL.
טכניקה זו היא מהירות ישימה, ומסוגל למדוד את אורך ההתמדה של 100 microtubules ביום אחד מניסויים. השיטה ניתן להאריך למדידת אורך התמדה תחת מגוון רחב של תנאים, כולל אורך התמדה כפונקציה של אורך יחד microtubules. יתר על כן, את שגרת הניתוח משמשת יכולה להיות מורחבת למבחני שרירן מבוסס משחק גלישה, כדי למדוד את אורך ההתמדה של סיבי יקטין גם כן.
Introduction
Cytoskeleton, רשת של biopolymers נמצא ברוב התאים האיקריוטים, ממלא תפקיד בארגון סלולרי, תחבורה תאית, ומכניקת תא. המאפיינים המכאניים של biopolymers של cytoskeleton (בעיקר תקטין וmicrotubules) לשחק תפקיד משמעותי בקביעת התכונות המכאניות של התא ככולו 12. מאז שלמה מכניקה סלולרית יכולה לאפיין תאים בריאים וחולים 13,14 ומעורב בתנועתיות סלולריות 15, את התכונות המכאניות של רכיבי cytoskeletal הבסיסיים היו אזור פעיל של מחקר בשני העשורים האחרונים 1.
הגמישות (או נוקשות) של biopolymers מאופיין באורך ההתמדה, אורכו של פולימר אשר מתכופף על ידי כ 1 רדיאן תחת תנודות תרמיות בטמפרטורת הסביבה. מספר הטכניקות פותח כדי למדוד אורך התמדה 16, לexampטכניקות פעילות le אשר כרוכות כיפוף הפולימר באמצעות זרימה הידרודינמית, מלכודות אופטיות, או שדות חשמליים 4,17,18, וטכניקות פסיביות אשר מודדות את התנודות של פולימרים חופשיים בפתרון 5,6. המדידות הפעילות, עם זאת, דורשות setups המיוחד כדי ליישם את הכוחות ידועים בסולם מיקרומטר, והמדידות, התנודות חופשיות יכולות להיות מאתגרות בשל דיפוזיה מחוץ למטוס של מוקד מיקרוסקופ בשימוש.
במאמר זה, אנו מתארים, טכניקה משלימה, פסיבית כדי למדוד את אורך ההתמדה של microtubules, פולימר cytoskeletal. הטכניקה כוללת מבחני דאייה, אשר להבטיח כי הפולימר נשאר תמיד במישור המוקד של 19. יתר על כן, זה כרוך fluorophores מעקב הבודד מחובר באופן קבוע לפולימר של ריבית, כך שמקומות מסוימים לאורך הפולימר מאופיינים היטב.
קריקטורה של השיטה מוצגת בFigurדואר 1. Kinesin נע במיוחד לקראת הסוף + של microtubules, כך microtubules בassay גלישה הם מונעים unidirectionally. הסוף המוביל של microtubule, מעבר kinesin האחרון צורף, הוא חופשי להשתנות תחת כוחות התרמיות של הפתרון שמסביב. כmicrotubule מונע קדימה, הסוף משתנה עד קשירת מולקולה חדשה kinesin המשך שקופית הזכוכית קופא בתנודות נתונות. בגלל kinesin מייחס microtubules חזק מאוד, microtubule מוגבל ללכת בדרך של הסוף המוביל. לכן, התנודות הסטטיסטיות שקפאו למסלול microtubule זהות לתנודות הסטטיסטיות של הקצה החופשי של 11 microtubules, ולכן יכולות לשמש כדי לחשב את אורך ההתמדה פי 20
איפה אני p הוא אורך ההתמדה של microtubule, θ s היא הזווית בין משיקים למסלול המופרד באורך של קו מתאר, ו<> מסמן ממוצע לאורך כל הזוגות של עמדות המופרדות באורך של קווי מתאר.
Assay הגלישה עוצמה משתמש biotinylated kinesin ב21-הסליל מפותל קשורים באופן ספציפי לשקופית הזכוכית באמצעות הצמדת streptavidin-ביוטין. התקשרות זו מבטיחה כי התחומים המוטוריים חופשיים להיקשר ולהניע microtubules. על מנת לעקוב אחר מסלולי microtubule, microtubules מתויגים דלילות עם fluorophores אורגני 22,23 - התוויות חייבות להיות דלילות מספיק שfluorophores היחיד הם פתיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדה. fluorophores היחיד נמצאים במעקב באמצעות שגרת ניתוח תמונה נכתבה בIDL. המסלולים שכל fluorophore חייבים מיקרופון ניתןrotubule משולבים לתוך מסלול microtubule מורכב באופן אוטומטי 24. זוויות θ לכל נקודה לאורך מסלול המשיקות מחושבות; מזוויות משיקות אלה <cosθ של> הערך מחושב לכל אורכו של קו מתאר. לבסוף, נתונים אלה מתאימים למשוואה. 1 כדי לחלץ אורך התמדה לmicrotubule נתון, או לmicrotubules רב באותו assay הדאייה.
השיטה היא חזקה מספיק כדי לעבוד עם microtubules הוכן במגוון רחב של מצבים (עם סוכנים שונים מייצבים או מולקולות קטנות אחרות מאוגדים לmicrotubule, עם חלבונים מאוגדים microtubule קשור (מפות), או עם מגוון רחב של פתרונות צמיגים). במעבדה שלנו, הטכניקה נעשתה שימוש כדי לאפיין את אורך ההתמדה של microtubules כפונקציה של אורך לאורך microtubules וmicrotubules עם סוכני מייצבים שונים. המגבלה העיקרית היא שmicrotubules חייב עדיין שלתנועתיות upport kinesin. מאז kinesin הוא אנזים מנוע חזק, זוהי מגבלה די רופפת. על ידי החלפת microtubules עם אקטין וkinesin עם משפחת אנזים מיוזין, אורך ההתמדה של אקטין יכול להימדד באותה הטכניקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פתרוני microtubule דאיית Assay מניות
להכין מראש assay דאייה.
- פלמר 0.5 microtubules מ"ג כותרת דלילות עם 22 fluorophore האורגני הבהיר. ריכוז תווית היעד הוא fluorophore 1 לכל מיקרומטר של microtubule, או צפיפות תיוג של כ 1 fluorophore ל1500 הדימרים טובולין. אחסן בטמפרטורת חדר, אור שמוגן באלומיניום, נייר כסף לתקופה של עד שבועות.
- טהר 21 ביוטין-kinesin בכ 1 מיקרומטר. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב5 aliquots μl לשימוש בניסויים נפרדים.
- הכן את חיץ assay (א.ב.) של imidiazole 50 מ"מימ, אשלגן כלורי mM 50 (KCl), 4 מגנזיום כלוריד מ"מ (MgCl 2), אתילן גליקול 2 מ"מ tetraacetic החומצה (EGTA), 6.7 pH. מסנן וסטרילי חנות ב 4 ° C.
- ממס biotinylated שור אלבומין (ביוטין-BSA) עד 2 מ"ג / מ"ל בא"ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2.חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
- ממס streptavidin (SA) עד 10 מ"ג / מ"ל בא"ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב20 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות.
- ממס α-קזאין עד 5 מ"ג / מ"ל בא"ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות.
- ממס dithiothreitol (DTT) במי deionized ב 200 מ"מ. חנות ב -20 ° C ב100 aliquots μl, השתמש בשעות 8 הפשרה. יכול להיות refrozen.
- ממס פקליטקסל (PT) בsulfoxide דימתיל HPLC כיתה (DMSO) בשעת 4 מ"מ. חנות ב 10 aliquots μl ב -80 ° C לטווח ארוך, -20 ° C לטווח קצר. יש להשתמש תוך 8 שעות של הפשרה. יכול להיות refrozen.
- לפזר סוכר במי deionized במינון 120 מ"ג / מ"ל. חנות ב100 aliquots μl ב -20 ° C. יכול להיות refrozen.
- דיסלפתור אדנוזין טריפוספט (ATP) במי deionized ב150 מ"מ, 7.0 pH. חנות ב 5 aliquots μl ב -80 ° C, השתמש בשעות 8 הפשרה.
- הכן 100x מניות חמצן הדחת 25 על ידי המסת 10000 גלוקוז אוקסידאז יחידות ויחידות 156.000 catalase לחיץ assay סך μl 600. צנטריפוגה בקצרה בmicrocentrifuge לגלולה מוצקה; supernatant סינון עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. חנות ב -80 ° C ב 10 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
2. Microtubule הרחיפה Assay, הכנת פתרון באותו יום
הכן את הפתרונים ב2.1-2.6 ביום של הניסוי. בעזרת תרגול, פתרונות 2.2-2.6 יכולים להיות מוכנים בזמן שטיפת זרימת תאים. אלא אם נאמר אחרת, לשמור פתרוני מניות על קרח.
- הכן AB, 1 מ"ל של חיץ assay עם 10 μl של DTT המניות (AB עם 2 המ"מ DTT). שמור בטמפרטורת חדר.
- הכן יו BSA חיץ, 40 & mu; מערבל תערובת ביחס 1:1 של ביוטין-BSA המניות וא.ב.. שמור בטמפרטורת חדר.
- הכן את חיץ BSA, ערבוב 645 μl של AB עם 5.5 BSA μl (1 מ"ג / המ"ל BSA בא"ב). שמור בטמפרטורת חדר.
- הכן את חיץ SA, ערבוב 57 μl של AB עם מלאי streptavidin μl 3 (0.5 מ"ג / המ"ל streptavidin בא"ב). שמור בטמפרטורת חדר.
- הכן את חיץ α-קזאין, ערבוב 200 μl של BSA חיץ, מניית קזאין 50 μl, ו -0.8 μl של 15 מיקרומטר ATP (1 מ"ג / מ"ל α-קזאין, 0.8 מ"ג / המ"ל BSA, 50 ננומטר-ATP בא"ב). שמור בטמפרטורת חדר.
- הכן את חיץ פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה, ערבוב 95 חיץ μl α-קזאין, מניית גלוקוז 2.5 μl, לערבב 1 μl 100x חמצן הדחה, מניית פקליטקסל 1 μl, μl 1 2-mercaptoethanol (βME). הוסף βME תחת מנדף. השתמש במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה בתוך 1 שעה של הכנת זהירות:. ΒME הוא רעיל מאוד וריח נורא. הקפד לפתוח רק במנדף. בקבוק בחנותהיעדר האור, אור מדרדר βME ויכולתו להפחית photobleaching.
3. Assay microtubule הרחיפה
- לבנות על ארבעה נתיבי זרימה בין coverslip 24 x 60 מ"מ והמ"מ coverslip 22 x 22 באמצעות גריז ואקום, extruded ממזרק דרך קצה פיפטה, כspacer. כל נתיב זרימה צריך להיות כ 10 μl בנפח (כרכים באים בקנה המידה בהתאם).
- שטוף 10 μl של חיץ ביו BSA לתוך כל סמטה. דגירת 5 דקות על מנת לאפשר לBSA מעייל משטחי הזכוכית.
- שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA μl 15 להסיר חופשי ביוטין-BSA, תוך המשך כדי לחסום את שקופית פני השטח. השתמש Kimwipe או נייר סינון כדי להסיר את החיץ מהצד השני של תא זרימה, להיות בטוח שלא לאפשר לבועות אוויר לצאת דרך חדר הזרימה.
- שטוף 15 μl SA-החיץ לתוך כל סמטה. חכה 10 דקות, או עד 2 שעות. Streptavidin יהיה לאגד את המשטח בכריכת ביוטין-BSA.
- שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA 15 μl להסיר החופשי SA תוך כדי לחסום את שקופית פני השטח.
- שטוף את כל מסלולים עם 15 חיץ μl α-קזאין. α-קזאין מסייע לחסום נוסף מחייב שאינו ספציפי של kinesin וmicrotubules לזכוכית.
- דלל kinesin עד 10 ננומטר במאגר α-קזאין ותרחץ כל שביל עם 15 μl של kinesin זה - פתרון α-קזאין. חכה 15 דקות (או עד שעה) לkinesin biotinylated כדי לאגד באופן ספציפי לstreptavidin קרקע המאוגדת. התחומים המוטוריים kinesin יישארו חופשיים microtubules אגד.
- דלל פקליטקסל ל40 מיקרומטר בטמפרטורת חדר חיץ α-קזאין, ותרחץ כל שביל עם 15 μl של פתרון זה לשטוף את kinesin החופשי ומראש לטעון כל תא זרימה עם פקליטקסל פתרון כדי למנוע מmicrotubules depolymerizing. קר גם depolymerizes microtubules, כדי לוודא שהצעדים הללו מתרחשים בטמפרטורת חדר עם החדר temperatuמחדש פתרונות.
- לדלל כותרת fluorescently microtubules 1:100-1:1,000 במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה עם mM ATP 1. שטוף 15 μl לנתיב אחד ולהתבונן בתוך 30 דקות.
4. איסוף נתונים
- שים לב microtubules הגלישה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; מיקרוסקופ מסוגל לפתור fluorophores הבודד כגון התקנת TIRF מסחרית או ביתי לבנות נדרש 26 (איור 2).
את microtubules צריך להיות מונע על ידי מנועי kinesin על המצע בכ 0.5 מיקרומטר / s, תלוי בטמפרטורה. אם השדה של הנוף של המיקרוסקופ הוא 50 מיקרומטר, microtubules הבודד צריך להיות גלוי לכ 100 שניות. הגדרת עוצמת תאורה, כך שfluorophores הבודד לא photobleach מהר יותר מ 100 שניות. אם אתם משתמשים בעירור ליזר, הגדרת הספק של כ 3-5 mW היא מתאימה. - איסוף רצפים של תמונות לניתוח. 600 תמונות ב5 הרץ (2 סך הכל דקות) עובד היטב. השתמש ברצפים ארוכים מספיק שmicrotubules חוצה את כל התחום של הנוף.
5. ניתוח נתונים
שגרת IDL, get_lp.pro, מצורפת. שגרה זו מחזירה ערך אורך התמדה מבוסס על כל microtubules הגלישה בתמונה ברצף נתון. כך או להפעיל את השגרה הזאת בכל תמונה ברצף, שינוי פרמטרים בעצימות בהתאם להגדרת מיקרוסקופ המסוימת שלך, או בצע את הפעולות הבאות:
- עקוב אחר כל fluorophore המצורף microtubule ליצור מסלולי fluorophore.
- מערבב את כל המסלולים של fluorophores על microtubule ניתן למסלול microtubule כלל החוזרים עבור כל microtubule בתמונה ברצף (איור 3).
- חשבתי את זווית משיק לכל נקודה לאורך המסלול (איור 4)ולחשב <cos θ s> במשוואה. 1 על ידי ממוצעים של הקוסינוס של זווית ההבדל עבור כל זוג הנקודות המופרדות של הנתיב באורך (איור 5). מצא את אורך ההתמדה לmicrotubule בודד או קבוצת microtubules ידי <cos ההולם של θ> למשוואה. 1, שקלול נקודתי נתונים הבודדים בכושר על ידי מספר הערכים עצמאיים של cos θ s המשמשים לחישוב ממוצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונת מצב מבדיקת גלישה מוצגת באיור 2. צפיפות microtubule טובה היא microtubules 1-10 לשדה הראייה; משמעותי יותר יגרום mistracking כmicrotubules חוצים זה את זה. עלילה של מסלולי 11 microtubule מבדיקת הגלישה באיור 2 מוצגת באיור 3. מסלולים אופייניים הם ארוכים 10-30 מיקרומטר; כמה מסלולים יש פערים בי microtubule 1 חוצה אחר. מסלולים אלו יכולים להיות מושלכים מניתוח.
מסלול microtubule אחד ארוך מוצג באיור 4A עם זוויות משיקות דוגמה בשתי עמדות לאורך המסלול. ההבדל בין הזוויות משיקות המופרדות במרחק קבוע קשור לאורך ההתמדה; זווית המשיק כפונקציה של מיקום לאורך מסלול microtubule מוצגת באיור 4 ב.
נתוני זווית המשיקממסלולי microtubule רבים משולב לחישוב אורך התמדה יחידה עבור כל microtubules בניסוי נתון. איור 5 מראה חלקת <cos θ s> באורך של קונטור לעומת לבדיקת הגלישה של איור 2. בערכי אורך גובה גדולים, מעט מאוד ערכים של cos θ נמדדים, ולכן הממוצע הוא משתנה מאוד. הכושר המשוקלל תואם את של קצר, נתוני דיוק גבוה יותר מאשר מקרוב s הארוכה, נתונים בעלי דיוק נמוך.
הערך של אורך התמדה מ11 מסלולים אלה, 500 ± 40 מיקרומטר (± שגיאת התקן של הממוצע), הוא נציג של אורכי התמדה לmicrotubules קצר יחסית 2. ניסויים דומים לתת מגוון של אורכי התמדה בין 300 ל 1000 מיקרומטר.
פתרון בעיות
אם microtubules נעדר לחלוטין, increase ריכוז microtubules בשלב 3.9-0.5 מ"ג / מ"ל. אם microtubules עדיין חסרים, microtubules מחדש פלמר. הפוך פקליטקסל הבטוח קיים בכל פתרון microtubules בדילול, אך באופן microtubules יהיה depolymerize.
אם microtubules הוא לשדר באופן חופשי בתמיסה, אך לא מחייב את פני שטח, להעלות את ריכוז kinesin בשלב 3.7 ולהשתמש AMP-PNP במקום ATP כדי להבטיח kinesin נקשר microtubules באופן בלתי הפיך. אם microtubules עדיין לא מתקשר, להכין ציר חדש streptavidin וחיץ, ואחריו המאגר החדש ביוטין-BSA. לבסוף, לטהר kinesin biotinylated החדש.
אם microtubules להיקשר אבל אל תזוז, החלף פתרון מניית ATP עם ATP טרי.
אם fluorophores photobleach מהר מדי, להפחית את עוצמת תאורה. אם fluorophores עדיין photobleach מהר מדי, להחליף את מערכת חמצן הדחה עם המלאי טרי.
אם fluorophoהמיל הוא עמום מדי, להגדיל את עוצמת תאורה.
איור 1. קריקטורה של assay גלישת microtubule. אנזימי kinesin קשורים באופן ספציפי לcoverslip ידי הצמדת ביוטין-streptavidin. Microtubules מתויג דלילות עם fluorophores האורגני. עם התוספת של ה-ATP, microtubules נדחפים על ידי מנועי kinesin. הקצה החופשי המוביל של microtubule משתנה כתוצאה מכוחות תרמיות בתמיסה; תנודות אלה משמשים לחישוב אורך התמדת microtubule. אורך קנה המידה של microtubule נחקר על ידי ניסויים אלה הוא באורך של הקצה החופשי.
איור 2. תמונה אופיינית של מיקרוסקופ assay דאייה, נלקחה באמצעות מיקרוסקופיה TIRF. Microtu bules מעוטרים בדלילות fluorophores הבודד. סרגל קנה מידה הוא 5 מיקרומטר.
איור 3. מסלולי microtubule מרצף התמונות שמוצגים באיור 2. כל מסלול משלב microtubule מסלולי fluorophore בודדים רבים (כ 10 בממוצע), וכבר דלל לנקודה אחת לכל 100 ננומטר.
איור 4. חישוב הזוויות המשיקות למסלול. () מסלול של microtubule אחד, עם זוויות משיקות דוגמה (θ) מוצגות. (ב) זווית משיק כפונקציה של מיקום לאורך מסלול microtubule. נתונים אלה משמשים לחישוב זוויות הממוצעות המשמשות במשוואה. 1.
איור 5. חישוב אורך התמדה מזוויות משיקות. (נקודות) מגרש של <cos θ s> לעומת קווי מתאר של אורך זה 11 מסלולים המוצגים באיור 3. (קו מוצק) התאמה למשוואה. 1. לקבוצה זו של microtubules, אורך ההתמדה הוא 500 ± 40 מיקרומטר. עבור אורכי גובה ארוכים (מעל 10 מיקרומטר או כך), הנתונים משתנים מאוד בשל נתונים מוגבלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מדידות אורך התמדה הן אפיון טוב של התכונות המכאניות של biopolymers הבודד. במאמר זה, יש לנו תאר שיטה למדידת אורך ההתמדה של microtubules. כפי שצוין במבוא, שיטה זו היא להרחיב בקלות לבחינת מאפייני microtubule מכאניים במגוון רחב של תנאים פשוט על ידי שינוי את ריאגנטים, הטמפרטורה, או הצמיגות בשלב הסופי של הגלישה assay, 3.9, או על ידי microtubules polymerizing, צעד 1.1, בתנאים שונים.
הטכניקה עצם היא מהירה לביצוע. ברגע פתרוני מניות כבר הכין מראש (שלב 1), ניסוי assay גלישה יכול להתבצע ב2-3 שעות, כולל עד ארבעה שינויים בתנאים בשקופית מיקרוסקופ אחת (ארבעה נתיבים בשלב 3.1). microtubules רב יכול להיבחן בכל ניסוי; ניסויים טיפוסיים במעבדה שלנו לבחון 100 microtubules למצב (כ 10 רצפי תמונהes לכל נתיב, עם 10 microtubules לרצף). הניתוח של ערכות נתונים גדולות הוא גם מהיר למדי. בעזרת תרגול, 10 רצפי תמונה ניתן לנתח לאורך התמדה בשעתי אחר הצהריים או משהו כזה במחשב מודרני. צעד שער ההגבלה בניתוח זה הזמן לעקוב אחר fluorophores הבודד; שיטות מעקב חדשות מבטיחות להגביר את המהירות באופן משמעותי זה 27.
מאחר שהשיטה כרוכה במעקב fluorophores הבודד מצורפים לmicrotubule נתון, הדיוק של מעקב מוגבל רק על ידי אוסף פוטון, ויכול להיות בקנה המידה של ננומטר 22, 25. על ידי הכללת נתונים מfluorophores רב, הדיוק הוא השתפר עוד יותר. פוטנציאלי, דיוק אפילו גבוה יותר ניתן להגיע על ידי הצמדת אובייקטי ניאון בהירים מאוד, כגון נקודות קוונטיות, כדי microtubule.
אמנם הדיוק של מסלולים נפרדים הוא די טוב, חוסר הוודאות בהתמדת lengths נמדד בטכניקה זו (בקנה המידה של ± 50% לmicrotubule יחיד) היא עדיין משמעותי. המגבלה המרכזית ברמת דיוק של מדידות אורך ההתמדה היא את הסטטיסטיקה המעורבת בממוצע cos θ s. כאורך קווי המתאר בין זוגות של נקודות, ים, עליות, מספר המדידות עצמאיות של θ של פוחת ככל L / s כאשר L הוא אורכו של מסלול microtubule למד. הגדלת האורך של מסלולי microtubule תאפשר דיוק השתפר במדידות אורך התמדה.
מגבלה שנייה לשיטה זו היא הדרישה שbiotinylated kinesin-1 ישמש להתקשרות ספציפית של kinesin לשקופיות מיקרוסקופ. kinesin Biotinylated חייב להיות מטוהר (מהחיידק הזה במקרה שלנו), ולא יכול פשוט לרכוש מהמדף. עם זאת, בדיקת גלישה שונה באמצעות קרובי unbiotinylatedesin עשוי לשמש 28; חלבון שרשרת כבדה kinesin שעשוי להיות מתאימים לטכניקה זו הוא זמין מסחרי מcytoskeleton (KR01). שינוי assay הגלישה להשתמש kinesin החלופי זה לא ישפיע על קשיחות כפיפת microtubule בכל דרך, ובכך לאפשר לקבוצות ללא גישה לחלבון רקומביננטי kinesin להשתמש בשיטה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים למליסה Klocke לסיוע הכנת האיור 1 ואנה רטליף להוכחה בפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי חברת המחקר לקידום מדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
