Summary
지속성 길이 또는 biopolymers의 굽힘 강성을 측정 할 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 실험적으로 개별 미소의 지속성 길이를 결정하는 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석을 사용하고 고를 기반 글라이딩 assays에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
미소는 cytoskeletal 세포 분열에 역할을 고분자, 세포 역학, 그리고 세포 내 수송 있습니다. 이 함수는 각각 뻣뻣하고 세포 직경의 중요한 일부를 기간을 직선 충분 미소가 필요합니다. 그 결과, 미세 소관 지속성 길이, 강성의 측정은 적극적으로 지난 20 년 1 연구되었습니다. 짧은 미소 긴 미소 2-4보다 10-50 배 더 치열한 있으며, 심지어 긴 미소는 진도 5-9의 순서에 따라 다를 수 지속성 길이를 측정했습니다 그럼에도 불구하고, 오픈 질문이 남아있다.
여기, 우리는 미세 소관 지속성 길이를 측정하는 방법을 제시한다. 방법은 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석 10를 기준으로합니다. 미세 소관에 부착 된 개인 fluorophores의 단일 입자 추적, glidin과 개별 미소의 스파 스 형광 라벨을 결합하여하나 미소의 g의 탄도는 나노 미터 수준의 정밀도로 추적합니다. 궤도의 지속성 길이는 11 사용 조건에서 미세 소관의 지속성 길이와 동일합니다. 자동화 된 추적 루틴은 개별 미소에 첨부 fluorophores에서 미세 소관의 탄도를 만드는 데 사용되는,이 탄도의 지속성 길이를 IDL로 작성된 루틴을 사용하여 계산됩니다.
이 기술은 빠르게 implementable, 그리고 실험 하루에 100 미소의 지속성 길이를 측정 할 수 있습니다. 방법은 미소를 따라 길이의 함수로 지속성 길이 등의 다양한 조건 아래에서 지속성 길이를 측정하기 위해 확장 될 수 있습니다. 또한, 사용 된 분석 루틴은 잘 고를의 필라멘트의 지속성 길이를 측정하기 위해, 마이 오신 기반의 연기 글라이딩 assays로 확장 할 수 있습니다.
Introduction
세포 골격은 대부분의 진핵 세포에서 발견 biopolymers의 네트워크, 휴대 조직, 세포 내 수송과 세포 역학의 역할을합니다. 세포 골격 (주로 고를와 미소)의 biopolymers의 기계적 특성은 전체 12 세포의 기계적 특성을 결정에 중요한 역할을한다. 전체 세포 역학이 건강하고 병에 걸린 세포에게 13,14을 특성화 할 수 있으며 세포 운동성 15에 관여되어 있기 때문에, 기본 cytoskeletal 구성 요소의 기계적 성질은 지난 20 년 1 연구의 활성 영역했습니다.
biopolymers의 유연성 (또는 강성)은 지속성 길이, 주위 온도에서 열 변동에 따라 약 방 사부에 의해 구부러 폴리머의 길이에 의해 특징입니다. 기술의 수는 examp에 대한 지속성 길이 16, 측정하기 위해 개발되었습니다유체 흐름, 광학 트랩, 또는 전기 분야 4,17,18, 및 솔루션 5,6에서 무료로 고분자의 변동을 측정 수동적 인 기술을 사용하여 폴리머를 절곡 참여 르중인 기술. 활성 측정 단, 전문 설정은 마이크로 미터 규모라고 힘을 구현하도록 요구하고, 자유 변동 측정은 사용 현미경의 초점 비행기의 확산 아웃으로 인해 도전 할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이, cytoskeletal 폴리머를 측정 할 수있는 보완, 수동, 기술에 대해 설명합니다. 기술은 폴리머는 항상 19 초점 비행기에 남아 있도록 글라이딩 assays를 포함합니다. 또한,이 폴리머 따라 특정 위치가 잘 특징 있도록 관심 폴리머에 영구적으로 부착 된 추적 한 fluorophores을 포함합니다.
방법의 만화는 Figur에 표시됩니다E 1. Kinesin는 미소의 + 끝으로 구체적으로 이동하므로 글라이딩 분석에 미소가 unidirectionally 추진되어 있습니다. 미세 소관의 선두 끝은 첨부 마지막 kinesin 넘어, 주변 솔루션의 열 군사 변동 할 수있다. 미세 소관이 앞으로 추진되면서 끝은 유리 슬라이드를 따라 더 새로운 kinesin 분자에 바인딩 할 때까지 주어진 변동에 정지 다를 수 있습니다. kinesin가 매우 강력하게 미소를 연결하기 때문에, 미세 소관은 선도적 인 엔드의 경로를 따라 제한됩니다. 따라서 미세 소관 궤도에 냉동 통계 변동 미소 (11)의 자유 단의 통계 변동과 동일합니다, 따라서 20에 따라 지속성 길이를 계산하는 데 사용할 수 있습니다
리터 P는 미세 소관의 지속성 길이이고, θ s이 (가) 등고선의 길이 S로 구분하여 궤도에 접선 사이의 각도이며, <> 존재라는 증거 윤곽 길이의로 구분하여 위치의 모든 쌍 이상의 평균.
글라이딩 분석 자체는 특별히 streptavidin - 비오틴의 연계를 통해 유리 슬라이드에 바인딩 된 코일 코일 21시 kinesin biotinylated 사용합니다. 이 첨부 파일은 모터 도메인에 바인딩하고 미소를 추진 자유롭게 보장합니다. 미세 소관의 탄도를 따라하기 위해, 미소가 띄엄 띄엄 유기 fluorophores 22,23으로 분류됩니다 - 라벨 하나 fluorophores는 단일 분자 형광 현미경을 사용하여 확인할 수있는 것을 충분히 희박한해야합니다. 싱글 fluorophores은 IDL로 작성된 이미지 분석 루틴을 사용하여 추적하고 있습니다. 각 형광의 궤도는 주어진 마이크에 바인딩rotubule은 자동으로 24 복합 미세 소관 궤도로 결합되어 있습니다. 궤도를 따라 각 지점에 θ 탄젠트 각도가 계산되며,이 접하는 각도에서 <cosθ S> 값이 각 등고선의 길이 s에 대한 계산됩니다. 마지막으로, 이러한 데이터는 EQ에 맞게되어 있습니다. 1 주어진 미세 소관에 대한 지속성 길이를 추출하기 위해, 또는 같은 글라이딩 분석에 많은 미소를위한.
방법은 조건의 다양한 (행 미세 소관 관련 단백질 (지도)이나 점성 솔루션의 다양한, 미세 소관에 바인딩 된 다른 안정화 대리인 또는 다른 작은 분자 포함)에서 조리 미소와 함께 일을 할 수있을만큼 강력합니다. 우리가 실험실에서, 기술은 다른 안정화 에이전트와 미소와 미소를 따라 길이의 함수로 미소의 지속성 길이를 특성화하는 데 사용되었습니다. 주요 제한은 미소는 여전히해야upport kinesin의 운동성. kinesin는 강력한 모터 효소이기 때문에이 상당히 느슨한 제한됩니다. 마이 오신 가족 효소를 고를와 kinesin과 미소를 대체함으로써, 고를의 지속성 길이가 같은 기술을 사용하여 측정 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 미세 소관 글라이딩 검정 주식 솔루션
앞서 글라이딩 분석의 준비.
- 띄엄 띄엄 밝은 유기 형광 22 분류 0.5 MG의 미소를 중합. 대상 레이블 농도가 1 마이크로 미터 미세 소관의 당 형광, 또는 1500 tubulin의 dimers 당 약 1 형광의 라벨 밀도입니다. 객실 온도, 빛의 저장소가 최대 두 주를 위해 알루미늄, 호일로 보호되고 있습니다.
- 약 1 μM에서 비오틴 - kinesin 21 정화. -80에서 저장 ° C 각각의 실험에 사용 5 μl aliquots 인치
- 50 밀리미터 imidiazole의 분석 버퍼 (AB), 50 MM의 칼륨 염화물 (KCl), 4 밀리미터 염화 마그네슘 (MgCl 2), 2 MM 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA), pH를 6.7를 준비합니다. 4에 살균 필터 및 저장 ° C.
- 2 밀리그램 / AB의 ML에 biotinylated 소 혈청 알부민 (BSA 비오틴 -)을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다.-80에서 스토어 4에 오랜 기간 100 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 1 개월하십시오.
- 10 MG / AB의 ML에 streptavidin (SA)을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다. -80에서 매장까지 2 주에 ° 4에 오랜 기간 20 μl aliquots에서 C, ° C.
- 5 AB의 MG / ML에 α-카제인을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다. -80에서 스토어 4에 오랜 기간 100 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 2 주에.
- 200 MM의 탈 이온수에 dithiothreitol (DTT)을 분해. 100 μl aliquots에서 -20 ° C에서 스토어는, 해동 8 시간 이내에 사용합니다. refrozen 할 수 있습니다.
- 4 MM에서 HPLC 급 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 paclitaxel (PT)을 분해. -80 10 μl aliquots에 저장 ° C 장기적으로, -20 ° C 단기. 해동 8 시간 이내에 사용하십시오. refrozen 할 수 있습니다.
- 120 MG / ML의 탈 이온수에서 포도당을 분해. -20 ° C. 100 μl aliquots에 저장 refrozen 할 수 있습니다.
- 비밀입니다150 음, 산도 7.0에서 탈 이온수에 아데노신 삼인산 (ATP)를 해결. -80에서 5 μl aliquots에 저장 ° C는 해동 8 시간 이내에 사용합니다.
- 600 μl 총 검정 버퍼에 카탈라아제 만 단위의 포도당 산화 효소와 156,000 단위를 용해하여 100x 산소를 청소 재고품 25 준비합니다. 펠렛 고체에 microcentrifuge에 간단히 원심 분리기, 0.2 μm의 주사기 필터 필터 표면에 뜨는. -80에서 스토어 4에 오랜 기간에 10 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 일주일하십시오.
2. 미세 소관 글라이딩 검정, 당일 솔루션 준비
실험 당일 2.1-2.6의 솔루션을 준비합니다. 연습으로, 솔루션 2.2-2.6는 흐름 세포 세척 동안 준비 할 수 있습니다. 별도로 명시하지 않는 한, 얼음 재고 솔루션을 유지.
- DTT 주식의 10 μl (2 MM DTT와 AB)와 AB, 검정 버퍼 1 ML을 준비합니다. 실온에서 보관.
- 바이오 BSA 버퍼, 40 & 무 준비, 비오틴-BSA 주식과 AB의 1:1 혼합물의 리터. 실온에서 보관.
- 5.5 μl BSA (AB 1 MG / ML BSA)과 AB의 645 μl를 혼합 BSA 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관.
- 3 μl streptavidin 재고 (AB의 0.5 MG / ML streptavidin)와 AB의 57 μl를 혼합, SA 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관.
- BSA 버퍼, 50 μl 카세인 재고 및 15 μM ATP (1 MG / ML α-카세인, 0.8 MG / ML BSA, AB에서 50 nm의 ATP)의 0.8 μl 200 μl를 혼합, α-카세인 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관.
- 95 μl α-카세인 버퍼, 2.5 μl 포도당 재고, 1 μl 100x 산소 청소 믹스, 1 μl paclitaxel 재고, 1 μl 2 메르 캅토 에탄올을 (βME) 혼합, 형광 반 표백 버퍼를 준비합니다. 배기함에 넣고 βME을 추가합니다. 준비 1 시간 이내에 형광 반 표백 버퍼를 사용하여주의 :. βME은 높은 독성이며, 끔찍한 냄새. 만 배기함에 넣고 열해야합니다. 에 저장 병빛의 부재, 빛 βME과 photobleaching을 줄일 수있는 능력을 방해합니다.
3. 미세 소관 글라이딩 분석
- 스페이서로 피펫 팁을 통해 주사기에서 압출 진공 그리스를 사용하는 24 X 60mm의 coverslip 22 X 22mm의 coverslip 사이 네 흐름 차선,에 대해 구성합니다. 각 흐름 차선는 볼륨의 약 10 μl (규모의 후속 권 따라)해야합니다.
- 각 차선에 바이오 BSA 버퍼 10 μl을 씻는다. BSA는 코트의 유리 표면을 할 수 있도록 5 분 알을 품다.
- 슬라이드 표면을 차단하는 계속하는 동안, 비오틴-BSA 무료 제거 15 μl BSA 버퍼 각 차선을 세 번 씻으십시오. 공기 거품이 흐름 챔버 통과 할 수 있도록하지 않도록하는 것 흐름 챔버의 반대편에서 버퍼를 제거하는 Kimwipe 또는 거름 종이를 사용합니다.
- 각 차선에 15 μl SA-버퍼를 씻으십시오. 10 분, 또는 최대 2 시간을 기다립니다. streptavidin는 표면에 바인딩 비오틴-BSA에 바인딩됩니다.
- 슬라이드 표면을 차단하기 위해 계속하는 동안 무료로 SA를 제거하는 15 μl BSA 버퍼 각 차선을 세 번 씻으십시오.
- 15 μl α-카세인 버퍼 각 차선을 씻는다. α-카세인은 또한 유리에 비 특정 kinesin의 구속하며 미소를 차단하는 데 도움이됩니다.
- α-카세인 버퍼에서 10 나노 미터로 kinesin를 희석이 kinesin의 15 μl 각 차선을 씻고 - α-카세인 솔루션입니다. 표면에 바인딩 streptavidin에 구체적으로 바인딩 biotinylated kinesin 15 분 (또는 최대 한 시간까지) 기다립니다. kinesin 모터 도메인은 바인드 미소를 무료로 유지됩니다.
- 방 온도 40 μM α-카세인 버퍼에 paclitaxel을 희석, 무료 kinesin을 씻어하고 depolymerizing에서 미소를 방지 할 수있는 paclitaxel 솔루션으로 각각의 흐름 챔버를 미리로드하려면이 솔루션의 15 μl 각 차선을 씻는다. 감기는 미소를 depolymerizes 때문에 방 temperatu로 실온에서 다음 단계가 발생했는지 확인솔루션을 다시.
- 휘황 1 ㎜ ATP와 형광 안티 - 표백제를 버퍼에 미소 1:100-1:1,000이라는 희석. 한 차선에 15 μl을 씻고 30 분 이내에 관찰한다.
4. 데이터 수집
- 형광 현미경을 사용하여 미소 글라이딩을 관찰, 이러한 상업적 또는 집에서 빌드 TIRF 설정과 같은 단일 fluorophores를 해결 할 수있는 현미경은 26 (그림 2)가 필요합니다.
미소는 온도에 따라 약 0.5 μm / s의 기판 위에 kinesin 모터에 의해 추진되어야한다. 현미경의 뷰 필드가 50 μm 경우, 각각의 미소는 약 100 초 동안 표시됩니다. 단일 fluorophores 더 빨리 100 초보다 photobleach하지 않도록 조명 강도를 설정합니다. 레이저 여기를 사용하는 경우, 약 3-5 MW의 전력 설정이 적합합니다. - 분석을위한 이미지의 시퀀스를 수집합니다. 600 이미지에서5 Hz에서 (2 분 총)는 잘 작동합니다. 충분히 미소는 전체 뷰 필드를 통과하는 시퀀스를 사용하십시오.
5. 데이터 분석
IDL 루틴, get_lp.pro가 첨부되어 있습니다. 이 루틴은 주어진 이미지 시퀀스의 모든 미소 글라이딩에 따라 지속성 길이 값을 반환합니다. 어느 특정 현미경 설정에 따라 강도 매개 변수를 수정, 각 이미지 시퀀스에서이 루틴을 실행하거나 다음을 수행하십시오 :
- 형광의 탄도를 만들 수있는 미세 소관에 부착 된 각각의 형광을 추적 할 수 있습니다.
- 이미지 시퀀스의 각 미세 소관 (그림 3)을 반복, 전체 미세 소관 궤도에 주어진 미세 소관에 fluorophores의 모든 궤도를 결합합니다.
- 궤적을 따라 각 지점의 접선 각도 (그림 4) 계산및 계산 <cos θ S> EQ 인치 (그림 5) 경로 길이 S로 구분하여 지점의 모든 쌍에 대한 각도 차이의 코사인을 평균하여 1. θ S> EQ에 맞는 <cos하여 미소의 단일 미세 소관 또는 그룹에 대한 지속성 길이를 찾습니다. 1 가중 평균을 계산하는 데 사용됩니다 왜냐하면 θ s의 독립적 인 값의 개수로 적합의 개별 데이터 포인트.
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Representative Results
글라이딩 분석에서 스냅 샷은 그림 2에 표시됩니다. 좋은 미세 소관 밀도는 시야 당 1-10 미소이다; 미소가 서로 교차으로 실질적으로 더 많은 mistracking 될 것이다. 그림 2의 글라이딩 분석에서 11 미세 소관의 탄도의 플롯은 그림 3에 표시됩니다. 일반적으로 궤도는 10-30 μm 길이 한쪽 미세 소관이 서로 교차 곳을 몇 궤도는 차이가 있습니다. 이 궤도는 분석에서 삭제 될 수 있습니다.
하나의 긴 미세 소관 궤도가 궤도를 따라 두 위치에서 예를 들어 탄젠트 각도로 그림 4A에 표시됩니다. 고정 된 거리로 구분하여 탄젠트 각도 사이의 차이는 지속성의 길이에 관련되어, 미세 소관의 궤적을 따라 위치의 함수로 접하는 각도는 그림 4B에 표시됩니다.
탄젠트 각도 데이터많은 미세 소관의 탄도에서 주어진 실험의 모든 미소에 대해 하나의 지속성 길이를 계산하기 위해 결합되어 있습니다. 그림 5는 그림 2의 글라이딩 분석을위한 <cos θ S> 대 등고선의 길이 s의 음모를 보여줍니다. 큰 윤곽 길이 값에서, 왜냐하면 θ의 거의 값이 측정되며, 따라서 평균은 매우 변수입니다. 가중치 운동은 짧은 s에 부합 더 자세히보다 고정밀 데이터를 긴 s의 낮은 정밀 데이터입니다.
이 11 궤도에서 지속성 길이 500 ± 40 μm (평균의 ± 표준 오차)의 값은 상대적으로 짧은 미소 2에 대한 지속성 길이의 대표적인 것입니다. 비슷한 실험은 300 1,000 μm 사이의 지속성 길이의 범위를 제공합니다.
문제 해결
미소는 incre 완전히 결석하는 경우단계에서 미소의 ASE 농도 3.9-0.5 MG / ML. 미소가 여전히 누락 된 경우, 재 중합 미소. 확인 paclitaxel은 미소가 미소가 depolymerize 그렇지 않으면로 희석, 각 솔루션에 존재합니다.
미소 자유롭게 솔루션 diffusing하지만, 표면에 구속력이없는 경우 단계 3.7에서 kinesin 농도를 증가시키고 kinesin는 돌이킬 미소를 결합하기 위해 대신 ATP의 AMP-PNP를 사용합니다. 미소가 여전히 구속하지 않는 경우, 새로운 비오틴-BSA 버퍼에 이어 새로운 streptavidin 주식과 버퍼를합니다. 마지막으로, 새로운 biotinylated kinesin를 정화.
미소가 구속하지만, 움직이지 않는 경우, 신선한 ATP와 ATP 재고 솔루션을 대체합니다.
fluorophores가 너무 빨리 photobleach 경우, 조명 강도를 줄일 수 있습니다. fluorophores 아직도 너무 빨리 photobleach 경우, 신선한 주식과 산소 청소 시스템을 대체합니다.
만약 fluoropho해상도가 너무 희미 아르 조명 강도를 향상시킬 수 있습니다.
그림 1. 미세 소관 글라이딩 분석의 만화. Kinesin 효소는 특히 비오틴 - streptavidin을 연동하여 coverslip에 바인딩됩니다. 미소가 띄엄 띄엄 유기 fluorophores으로 분류됩니다. ATP의 추가시, 미소는 kinesin 모터에 의해 적용됩니다. 미세 소관의 선두 무료로 끝이 솔루션에 열 힘에 의한 변동, 이러한 변동은 미세 소관 지속성 길이를 계산하는 데 사용됩니다. 이 실험에 의해 탐지 미세 소관의 길이 스케일은 자유 단의 길이입니다.
그림 2. TIRF 현미경을 통해 촬영 글라이딩 분석의 일반적인 현미경 스냅 샷. Microtu bules는 띄엄 띄엄 한 fluorophores으로 장식되어 있습니다. 스케일 바는 5 μm이다.
이미지 시퀀스에서 그림 3. 미세 소관의 탄도는 그림 2에 표시. 각 미세 소관 궤도는 많은 단일 형광의 탄도를 (평균 10) 결합, 100 nm의 당 하나의 지점으로 얇게되었습니다.
그림 4. 궤도에 접하는 각도를 계산. 표시 예를 들어 탄젠트 각도 (θ)과 하나가 미세 소관의 (A) 탄도. 미세 소관의 궤적을 따라 위치의 함수로 (B) 탄젠트 각도. 이러한 데이터는 EQ에 사용 된 평균 각도를 계산하는 데 사용됩니다. 1.
그림 5. 탄젠트 각도에서 지속성 길이를 계산. 그림 3에 표시된 11 궤도에 <cos θ S> 대 등고선 길이 s의 (점) 플롯. (실선) EQ에 맞추기. 1. 미소의이 그룹은 지속성 길이는 500 ± 40 μm이다. 긴 윤곽 길이 (10 μm 정도 이상)의 경우 데이터 인해 제한된 통계에 매우 변수입니다.
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Discussion
지속성 길이 측정은 개별 biopolymers의 기계적 성질의 좋은 특성입니다. 이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이를 측정하는 방법을 설명합니다. 으로 도입에 명시된 바와 같이,이 방법은 쉽게 간단하게 글라이딩 검정, 3.9의 최종 단계에서 시약, 온도, 또는 점도를 변화하거나 polymerizing 미소, 스텝 1.1의 다양한 조건에 미세 소관 기계적 특성을 조사에 연장됩니다 다른 조건 하에서.
기술 자체는 수행 할 수 빠른 것입니다. 재고 솔루션은 미리 (1 단계)의 준비를 한 후 글라이딩 분석 실험은 단일 현미경 슬라이드에 조건 네 개의 변화 (단계 3.1의 네 개의 차선)까지 포함, 2-3 시간에 수행 할 수 있습니다. 많은 미소는 각 실험에서 검토 될 수있다; 우리 연구실에서 전형적인 실험 조건 당 100 미소 (약 10 이미지 sequenc을 검토순서 당 10 미소)와 차선 당 에스. 큰 데이터 세트의 분석 역시 매우 빠른 것입니다. 연습으로, 10 이미지 시퀀스는 현대적인 PC와 오후 쯤 지속성의 길이를 분석 할 수 있습니다. 분석의 속도 - 제한 단계는 개별 fluorophores을 추적 할 시간입니다, 새로운 추적 방법은 실질적으로 27이 속도를 증가 할 것을 약속드립니다.
방법은 주어진 미세 소관에 부착 한 fluorophores을 추적 포함하기 때문에, 추적의 정확도는 광자 컬렉션에 의해 제한되어 있으며 나노 미터 22, 25의 규모에있을 수 있습니다. 많은 fluorophores에서 데이터를 포함하여, 정밀도가 더욱 향상됩니다. 잠재적으로 더 높은 정밀도는 미세 소관에, 이러한 양자 도트로 매우 밝은 형광 개체를 첨부하여 도달 할 수있다.
개인 탄도의 정확성은 끈기 르의 불확실성 매우 좋은 반면이 기법 (단일 미세 소관에 대한 ± 50 % 규모)로 측정 ngths은 여전히 중요하다. 지속성 길이 측정의 정밀도의 주요 제한은 왜냐하면 θ을 평균에 관련된 통계입니다. L은 미세 소관의 궤적의 길이입니다 L / S는 공부로 포인트, S, 증가의 쌍 사이의 윤곽 길이로, θ s의 독립적 인 측정의 수는 줄어 듭니다. 미세 소관의 탄도의 길이를 증가하는 것은 지속성 길이 측정의 개선 정밀도를 허용합니다.
이 방법에 대한 두 번째 제한은 biotinylated kinesin-1이 현미경 슬라이드에 kinesin의 특정 첨부 파일을 사용할 수있는 요구 사항입니다. Biotinylated kinesin는 (우리의 경우 대장균에서) 정화해야하며 단순히 선반을 구입 할 수 없습니다. 그러나, 수정 글라이딩 분석은 unbiotinylated 친척를 사용하여esin는 28 일 사용할 수 있습니다,이 기술에 적합 될 수 kinesin 중쇄 단백질은 세포 골격 (KR01)에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 대체 kinesin을 사용하도록 글라이딩 분석을 수정하면 어떤 방식으로 미세 소관 굽힘 강성에 영향을 미치지 않을, 그래서 재조합 kinesin 단백질에 대한 액세스 권한이없는 그룹이 방법을 사용할 수 있도록합니다.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 지원이 프로토콜을 시연을 위해 그림 1과 안나 Ratliff를 준비 멜리사 Klocke 감사드립니다. 이 작품은 과학 발전을위한 연구 법인에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
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