Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы

Published: November 9, 2012 doi: 10.3791/50117

Summary

Метод измерения длины сохранение или жесткость на изгиб биополимеров описано. Метод использует кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа экспериментально определить сохранением длины отдельных микротрубочек и адаптируется к актина на основе скользящих анализов.

Abstract

Микротрубочки цитоскелета являются полимерами, которые играют важную роль в делении клеток, клеточной механики и внутриклеточного транспорта. Каждая из этих функций требует микротрубочек, которые являются жесткими и прямыми достаточно, чтобы охватить значительную часть клетки диаметра. В результате, длина микротрубочек настойчивость, мера жесткости, активно исследуется в течение последних двух десятилетий 1. Тем не менее, открытыми остаются вопросы: короткие микротрубочки в 10-50 раз менее жесткими, чем длинные микротрубочки 2-4, и даже долго микротрубочек измерили сохранением длины, которые зависят от порядка 5-9.

Здесь мы представляем метод для измерения длины микротрубочек настойчивость. Метод основан на кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа 10. Благодаря сочетанию редких флуоресцентные маркировки отдельных микротрубочек с одной отслеживание частиц отдельных флуорофоров прикреплены к микротрубочек, Glidinг траектории одной микротрубочки отслеживаются с нанометрового уровня точности. Сохранение длины траектории так же, как сохранение длины микротрубочек в соответствии с условиями 11. Автоматизированное отслеживание используется для создания микротрубочек траекторий из флуорофоров к отдельным микротрубочки, и сохранением длины этой траектории рассчитывается с использованием процедуры, написанные на IDL.

Эта техника быстро реализуемым, и способны измерять сохранение длиной 100 микротрубочек в один день эксперимента. Метод может быть расширен для измерения длины настойчивость в различных условиях, в том числе сохранением длины в зависимости от длины вдоль микротрубочек. Кроме того, анализ процедур, используемых может быть продлен до миозина на основе действующего скольжение анализы, чтобы измерить длину сохранение нитей актина, а также.

Protocol

1. Микротрубочек Gliding анализа растворов

Подготовка перед анализом скольжения.

  1. Полимеризации 0,5 мг микротрубочек редко помечены яркой органических флуорофоров 22. Концентрацией целевой метки составляет 1 флуорофора в микрометра микротрубочек, или маркировки плотности примерно 1 флуорофора на 1500 димеров тубулина. Хранить при комнатной температуре, защищенном от света алюминиевой, фольги на срок до двух недель.
  2. Очищают биотин-кинезин 21 на примерно 1 мкм. Хранить при -80 ° C в 5 мкл аликвоты для использования в отдельных экспериментах.
  3. Подготовка буфере (AB) 50 мМ imidiazole, 50 мМ хлорид калия (KCl), 4 мМ хлорида магния (MgCl 2), 2 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), рН 6,7. Стерильный фильтр и хранить при 4 ° C.
  4. Растворите биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА биотин) до 2 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца.Хранить при -80 ° C в 100 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С на срок до одного месяца.
  5. Растворите стрептавидином (SA) до 10 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца. Хранить при температуре от -80 ° С в 20 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение двух недель.
  6. Растворите α-казеин до 5 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца. Хранить при -80 ° C в 100 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение двух недель.
  7. Растворите дитиотреитол (DTT) в деионизированной воде при 200 мМ. Хранить при -20 ° C в 100 мкл аликвоты, использовать в течение 8 часов оттаивания. Может быть замораживать.
  8. Растворите паклитаксел (PT) в ВЭЖХ-класса диметилсульфоксид (ДМСО) при 4 мМ. Магазин в 10 мкл аликвоты при -80 ° C долгосрочной перспективе, -20 ° C краткосрочной перспективе. Использовать в течение 8 часов оттаивания. Может быть замораживать.
  9. Растворите глюкозы в деионизированной воде при 120 мг / мл. Хранить в 100 мкл аликвоты при -20 ° C. Может быть замораживать.
  10. Расстояниерешить аденозинтрифосфата (АТФ) в деионизированной воде при 150 мМ, рН 7,0. Хранить в 5 мкл аликвоты при -80 ° C, использовать в течение 8 часов оттаивания.
  11. Подготовка 100x кислород складе 25 по растворению 10.000 единиц оксидаза глюкозы и 156000 единиц каталазы в 600 мкл буфера для анализа общего. Центрифуга на микроцентрифуге для осаждения твердых частиц; супернатанта с фильтром 0,2 мкм шприц. Хранить при температуре от -80 ° С в 10 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение одной недели.

2. Микротрубочек Gliding анализа, же препарат Solution Day

Подготовка решений в 2.1-2.6 в день эксперимента. С практикой решений 2.2-2.6 могут быть получены в течение поток-элементный стирки. Если не указано иное, держать растворов на льду.

  1. Подготовка AB, 1 мл буфера для анализа с 10 мкл DTT складе (AB 2 мМ DTT). Хранить при комнатной температуре.
  2. Подготовка био-BSA буфере, 40-му, Л смеси 1:1 биотин-BSA акции и AB. Хранить при комнатной температуре.
  3. Подготовка BSA буфера, смешивая 645 мкл AB с 5,5 мкл BSA (1 мг / мл BSA в AB). Хранить при комнатной температуре.
  4. Подготовка SA буфера, смешивая 57 мкл AB с 3 мкл складе стрептавидина (0,5 мг / мл стрептавидином в AB). Хранить при комнатной температуре.
  5. Подготовка α-казеин буфера, смешивая 200 мкл BSA буфера, 50 мкл складе казеина и 0,8 мкл 15 мкМ АТФ (1 мг / мл α-казеина, 0,8 мг / мл BSA, 50 нМ ATP в AB). Хранить при комнатной температуре.
  6. Подготовка флуоресценции анти-отбеливателя буфера, смешивания 95 мкл α-казеин буфера, 2,5 мкл складе глюкозы, 1 мкл 100x кислород смеси, 1 мкл складе паклитаксел, 1 мкл 2-меркаптоэтанол (βME). Добавить βME под вытяжным шкафом. Использование флуоресценции анти-отбеливателя буфера в течение 1 часа подготовки. ОСТОРОЖНО: βME является высокотоксичным и пахнет ужасно. Будьте уверены, чтобы открыть только под вытяжным шкафом. Хранить бутылки вотсутствие света, свет разлагается βME и его способность снижать фотообесцвечивания.

3. Микротрубочек Gliding анализа

  1. Построить около четырех потоков полосы между 24 × 60 покровное мм и 22 х 22 мм покровным использованием вакуумной смазки, выдавливается из шприца через кончика пипетки, в качестве прокладки. Каждый поток полосы должна быть примерно 10 мкл объема (масштаба последующие тома соответственно).
  2. Вымойте 10 мкл био-BSA буфера в каждой полосе. Инкубировать 5 мин, чтобы BSA, чтобы покрыть стеклянные поверхности.
  3. Промойте каждую полосу в три раза с 15 мкл буфера BSA для удаления свободного биотина-BSA, продолжая блокировать поверхности скольжения. Используйте Kimwipe или фильтровальной бумагой, чтобы удалить буфер из противоположную сторону проточной камеры, будучи уверенным, чтобы не допустить пузырьков воздуха, чтобы пройти через проточную камеру.
  4. Вымойте 15 мкл SA-буфер в каждой полосе. Подождите 10 минут, или до 2 часов. Стрептавидин будет связываться с поверхностью связанного биотина BSA.
  5. Промойте каждую полосу в три раза с 15 мкл буфера BSA для удаления свободного SA, продолжая блокировать поверхности скольжения.
  6. Промойте каждую полосу с 15 мкл α-казеин буфера. α-казеин помогает блокировать дальнейшее неспецифического связывания кинезина и микротрубочки к стеклу.
  7. Развести кинезин до 10 нм в α-казеин буфера и мыть каждую полосу с 15 мкл этого кинезин - α-казеин решение. Подождите 15 минут (или до часа) для биотинилированного кинезин специфически связываться с поверхностью связанных стрептавидином. Кинезин двигателя областях будет оставаться свободным связывать микротрубочек.
  8. Развести паклитаксела до 40 мкм в комнатной температуре α-казеин буфера, и мыть каждую полосу с 15 мкл этого раствора, чтобы смыть бесплатно кинезина и для предварительной загрузки каждого потока камера с паклитакселом решение для предотвращения деполимеризации микротрубочек с. Холодная также деполимеризует микротрубочки, поэтому убедитесь, что действия происходят при комнатной температуре с комнатным temperatuповторного решения.
  9. Развести флуоресцентно меченые микротрубочки 1:100-1:1,000 флуоресценции анти-отбеливателя буфера с 1 мМ АТФ. Вымойте 15 мкл в одну полосу и наблюдать в течение 30 мин.

4. Сбор данных

  1. Соблюдайте микротрубочек скольжения с помощью флуоресцентной микроскопии; микроскопа способна решить одну флуорофоры, такие как коммерческие или домашние сборка установки TIRF требуется 26 (рис. 2).
    Микротрубочек должно быть движение с помощью двигателя кинезин на подложке примерно в 0,5 мкм / с, в зависимости от температуры. Если поле-обзора микроскопа составляет 50 мкм, индивидуальные микротрубочки должны быть видны в течение примерно 100 секунд. Установите интенсивность освещения таким образом, чтобы одна флуорофоров не photobleach быстрее, чем 100 сек. При использовании лазерного возбуждения, мощность установки примерно 3-5 мВт является целесообразным.
  2. Сбор последовательности изображений для анализа. 600 изображений в5 Гц (2 мин общего числа) работает хорошо. Использование последовательности достаточно долго, что микротрубочки пройти все поле-обзора.

5. Анализ данных

Рутинной IDL, get_lp.pro , прилагается. Эта процедура возвращает значение сохранения длины на основе всех микротрубочек скольжения в данной последовательности изображений. Либо запустить эту процедуру на каждой последовательности изображений, изменение параметров интенсивности в зависимости от настройки микроскопа, или выполните следующие действия:

  1. Отслеживать каждого флуорофора прикреплены к микротрубочек создать флуорофора траектории.
  2. Смешайте все траектории флуорофоры на данный микротрубочек в общую траекторию микротрубочек, повторите для каждого микротрубочек в последовательности изображений (рис. 3).
  3. Расчет касательной углом друг к точке вдоль траектории (рис. 4), И вычислить <cos θ S> в формуле. 1 путем усреднения косинус угла разница для каждой пары точек, разделенных пути длиной S (рис. 5). Найти сохранением длины для одного микротрубочек или группы микротрубочек путем установки <cos θ S> к уравнению. 1, взвешивание отдельных точек данных в соответствие, число независимых значений соз θ с, которые используются для вычисления среднего.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Постоянство измерений длины являются хорошей характеристикой механических свойств отдельных биополимеров. В этой статье мы описали метод измерения с сохранением длины микротрубочек. Как отмечалось во введении, этот метод легко распространить на изучение механических свойств микротрубочек в различных условиях просто путем изменения реагентов, температуры и вязкости в заключительном этапе анализа скольжения, 3,9, или путем полимеризации микротрубочек, шаг 1,1, в различных условиях.

Сама методика быстро выполнить. После складе решения были подготовлены заранее (шаг 1), эксперимент скольжение анализ может быть выполнен в течение 2-3 ч, в том числе до четырех вариантах в условиях на одном слайде микроскопа (четыре полосы движения в шаге 3,1). Многие микротрубочки могут быть рассмотрены в каждом эксперименте, типичный эксперименты в нашей лаборатории изучения 100 микротрубочек в условии (около 10 изображений sequencES на полосу, с 10 микротрубочек в последовательности). Анализа больших наборов данных тоже довольно быстро. С практикой, 10 последовательностей изображений могут быть проанализированы для сохранения длины в день или около того с современными ПК. Ограничение скорости шаг в анализе время, чтобы отслеживать отдельные флуорофоров; новые методы отслеживания обещают увеличить эту скорость в значительной степени 27.

Поскольку метод включает в себя отслеживание одного флуорофоров прилагается к данному микротрубочек, точность отслеживания ограничивается только фотон сбор, и могут быть в масштабе нанометров, 22, 25. В том числе данные из многих флуорофоры, точность дальнейшего совершенствования. Потенциально, даже более высокая точность может быть достигнута путем присоединения очень яркий флуоресцентный объектов, таких как квантовые точки, к микротрубочек.

В то время как точность индивидуальных траекторий довольно хорошо, неопределенность в сохранение леngths измеряется с этой техникой (по шкале ± 50% для одного микротрубочек) все еще остается значительной. Основным ограничением в точности измерений сохранением длины статистики, участвующие в среднем соз θ с. Как контур расстояние между парами точек, S, увеличивается число независимых измерений θ уменьшается с л / с, где L-длина микротрубочек траектории изучены. Увеличение длины микротрубочек траекторий позволит улучшить точность измерений сохранением длины.

Второе ограничение этого метода является требование, чтобы биотинилированного кинезин-1 будет использоваться для конкретных вложений кинезина на микроскопом. Биотинилированные кинезин должна быть очищена (от E. Coli в нашем случае), и просто не может быть приобретена в готовом виде. Тем не менее, анализ изменения скольжения использованием unbiotinylated родственниковЕсин могут быть использованы 28; кинезин тяжелой белковой цепи, которые могут быть пригодны для этой техники является коммерчески доступные от цитоскелета (KR01). Изменение анализа скольжения использовать этот альтернативный кинезин не повлияет микротрубочек жесткость при изгибе в любом случае, и, таким образом, позволяют групп, не имеющих доступа к рекомбинантного белка кинезин использовать этот метод.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Мелисса Klocke за помощь подготовке Рисунок 1 и Анна Ratliff для демонстрации протокол. Эта работа была поддержана Research Corporation по науке улучшению.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
imidazole Sigma-Aldrich I2399
potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
EGTA Sigma-Aldrich E3889
BSA Calbiochem 126615
biotinylated BSA Thermo Scientific 29130
α-casein Sigma-Aldrich C6780
streptavidin Thermo Scientific 21125
dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
paclitaxel LC Laboratories P-9600
glucose oxidase Sigma-Aldrich G2133
catalase Sigma-Aldrich C100
glucose Sigma-Aldrich G8270
ATP Sigma-Aldrich A2383
2-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M3148 Toxic. Buy small amount.
24X60 mm No. 1 1/2 cover glass VWR 48393-252
22X22 mm No. 1 cover glass Gold Seal 3306
High Vacuum Grease Dow-Corning NA
Equipment
TIRF microscope many NA The TIRF microscope used in this method was home-made.
IDL (software) Exelis NA Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
  2. Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
  3. Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
  4. Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
  5. Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
  6. Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
  7. Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
  8. Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
  9. van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
  10. Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
  11. Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
  12. Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
  13. Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
  14. Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
  15. Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
  16. Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
  17. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
  18. Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
  19. van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
  20. Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
  21. Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
  22. Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
  23. Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
  24. Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
  25. Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
  26. Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
  27. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
  28. Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).

Tags

Биофизики № 69 биоинженерии физики молекулярной биологии клеточной биологии микротрубочки настойчивость длина жесткость при изгибе скольжение анализа механики цитоскелет актин
Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, D. S., Yu, L., Van Hoozen,More

Martin, D. S., Yu, L., Van Hoozen, B. L. Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays. J. Vis. Exp. (69), e50117, doi:10.3791/50117 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter