Summary
Метод измерения длины сохранение или жесткость на изгиб биополимеров описано. Метод использует кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа экспериментально определить сохранением длины отдельных микротрубочек и адаптируется к актина на основе скользящих анализов.
Abstract
Микротрубочки цитоскелета являются полимерами, которые играют важную роль в делении клеток, клеточной механики и внутриклеточного транспорта. Каждая из этих функций требует микротрубочек, которые являются жесткими и прямыми достаточно, чтобы охватить значительную часть клетки диаметра. В результате, длина микротрубочек настойчивость, мера жесткости, активно исследуется в течение последних двух десятилетий 1. Тем не менее, открытыми остаются вопросы: короткие микротрубочки в 10-50 раз менее жесткими, чем длинные микротрубочки 2-4, и даже долго микротрубочек измерили сохранением длины, которые зависят от порядка 5-9.
Здесь мы представляем метод для измерения длины микротрубочек настойчивость. Метод основан на кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа 10. Благодаря сочетанию редких флуоресцентные маркировки отдельных микротрубочек с одной отслеживание частиц отдельных флуорофоров прикреплены к микротрубочек, Glidinг траектории одной микротрубочки отслеживаются с нанометрового уровня точности. Сохранение длины траектории так же, как сохранение длины микротрубочек в соответствии с условиями 11. Автоматизированное отслеживание используется для создания микротрубочек траекторий из флуорофоров к отдельным микротрубочки, и сохранением длины этой траектории рассчитывается с использованием процедуры, написанные на IDL.
Эта техника быстро реализуемым, и способны измерять сохранение длиной 100 микротрубочек в один день эксперимента. Метод может быть расширен для измерения длины настойчивость в различных условиях, в том числе сохранением длины в зависимости от длины вдоль микротрубочек. Кроме того, анализ процедур, используемых может быть продлен до миозина на основе действующего скольжение анализы, чтобы измерить длину сохранение нитей актина, а также.
Protocol
1. Микротрубочек Gliding анализа растворов
Подготовка перед анализом скольжения.
- Полимеризации 0,5 мг микротрубочек редко помечены яркой органических флуорофоров 22. Концентрацией целевой метки составляет 1 флуорофора в микрометра микротрубочек, или маркировки плотности примерно 1 флуорофора на 1500 димеров тубулина. Хранить при комнатной температуре, защищенном от света алюминиевой, фольги на срок до двух недель.
- Очищают биотин-кинезин 21 на примерно 1 мкм. Хранить при -80 ° C в 5 мкл аликвоты для использования в отдельных экспериментах.
- Подготовка буфере (AB) 50 мМ imidiazole, 50 мМ хлорид калия (KCl), 4 мМ хлорида магния (MgCl 2), 2 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), рН 6,7. Стерильный фильтр и хранить при 4 ° C.
- Растворите биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА биотин) до 2 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца.Хранить при -80 ° C в 100 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С на срок до одного месяца.
- Растворите стрептавидином (SA) до 10 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца. Хранить при температуре от -80 ° С в 20 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение двух недель.
- Растворите α-казеин до 5 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца. Хранить при -80 ° C в 100 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение двух недель.
- Растворите дитиотреитол (DTT) в деионизированной воде при 200 мМ. Хранить при -20 ° C в 100 мкл аликвоты, использовать в течение 8 часов оттаивания. Может быть замораживать.
- Растворите паклитаксел (PT) в ВЭЖХ-класса диметилсульфоксид (ДМСО) при 4 мМ. Магазин в 10 мкл аликвоты при -80 ° C долгосрочной перспективе, -20 ° C краткосрочной перспективе. Использовать в течение 8 часов оттаивания. Может быть замораживать.
- Растворите глюкозы в деионизированной воде при 120 мг / мл. Хранить в 100 мкл аликвоты при -20 ° C. Может быть замораживать.
- Расстояниерешить аденозинтрифосфата (АТФ) в деионизированной воде при 150 мМ, рН 7,0. Хранить в 5 мкл аликвоты при -80 ° C, использовать в течение 8 часов оттаивания.
- Подготовка 100x кислород складе 25 по растворению 10.000 единиц оксидаза глюкозы и 156000 единиц каталазы в 600 мкл буфера для анализа общего. Центрифуга на микроцентрифуге для осаждения твердых частиц; супернатанта с фильтром 0,2 мкм шприц. Хранить при температуре от -80 ° С в 10 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение одной недели.
2. Микротрубочек Gliding анализа, же препарат Solution Day
Подготовка решений в 2.1-2.6 в день эксперимента. С практикой решений 2.2-2.6 могут быть получены в течение поток-элементный стирки. Если не указано иное, держать растворов на льду.
- Подготовка AB, 1 мл буфера для анализа с 10 мкл DTT складе (AB 2 мМ DTT). Хранить при комнатной температуре.
- Подготовка био-BSA буфере, 40-му, Л смеси 1:1 биотин-BSA акции и AB. Хранить при комнатной температуре.
- Подготовка BSA буфера, смешивая 645 мкл AB с 5,5 мкл BSA (1 мг / мл BSA в AB). Хранить при комнатной температуре.
- Подготовка SA буфера, смешивая 57 мкл AB с 3 мкл складе стрептавидина (0,5 мг / мл стрептавидином в AB). Хранить при комнатной температуре.
- Подготовка α-казеин буфера, смешивая 200 мкл BSA буфера, 50 мкл складе казеина и 0,8 мкл 15 мкМ АТФ (1 мг / мл α-казеина, 0,8 мг / мл BSA, 50 нМ ATP в AB). Хранить при комнатной температуре.
- Подготовка флуоресценции анти-отбеливателя буфера, смешивания 95 мкл α-казеин буфера, 2,5 мкл складе глюкозы, 1 мкл 100x кислород смеси, 1 мкл складе паклитаксел, 1 мкл 2-меркаптоэтанол (βME). Добавить βME под вытяжным шкафом. Использование флуоресценции анти-отбеливателя буфера в течение 1 часа подготовки. ОСТОРОЖНО: βME является высокотоксичным и пахнет ужасно. Будьте уверены, чтобы открыть только под вытяжным шкафом. Хранить бутылки вотсутствие света, свет разлагается βME и его способность снижать фотообесцвечивания.
3. Микротрубочек Gliding анализа
- Построить около четырех потоков полосы между 24 × 60 покровное мм и 22 х 22 мм покровным использованием вакуумной смазки, выдавливается из шприца через кончика пипетки, в качестве прокладки. Каждый поток полосы должна быть примерно 10 мкл объема (масштаба последующие тома соответственно).
- Вымойте 10 мкл био-BSA буфера в каждой полосе. Инкубировать 5 мин, чтобы BSA, чтобы покрыть стеклянные поверхности.
- Промойте каждую полосу в три раза с 15 мкл буфера BSA для удаления свободного биотина-BSA, продолжая блокировать поверхности скольжения. Используйте Kimwipe или фильтровальной бумагой, чтобы удалить буфер из противоположную сторону проточной камеры, будучи уверенным, чтобы не допустить пузырьков воздуха, чтобы пройти через проточную камеру.
- Вымойте 15 мкл SA-буфер в каждой полосе. Подождите 10 минут, или до 2 часов. Стрептавидин будет связываться с поверхностью связанного биотина BSA.
- Промойте каждую полосу в три раза с 15 мкл буфера BSA для удаления свободного SA, продолжая блокировать поверхности скольжения.
- Промойте каждую полосу с 15 мкл α-казеин буфера. α-казеин помогает блокировать дальнейшее неспецифического связывания кинезина и микротрубочки к стеклу.
- Развести кинезин до 10 нм в α-казеин буфера и мыть каждую полосу с 15 мкл этого кинезин - α-казеин решение. Подождите 15 минут (или до часа) для биотинилированного кинезин специфически связываться с поверхностью связанных стрептавидином. Кинезин двигателя областях будет оставаться свободным связывать микротрубочек.
- Развести паклитаксела до 40 мкм в комнатной температуре α-казеин буфера, и мыть каждую полосу с 15 мкл этого раствора, чтобы смыть бесплатно кинезина и для предварительной загрузки каждого потока камера с паклитакселом решение для предотвращения деполимеризации микротрубочек с. Холодная также деполимеризует микротрубочки, поэтому убедитесь, что действия происходят при комнатной температуре с комнатным temperatuповторного решения.
- Развести флуоресцентно меченые микротрубочки 1:100-1:1,000 флуоресценции анти-отбеливателя буфера с 1 мМ АТФ. Вымойте 15 мкл в одну полосу и наблюдать в течение 30 мин.
4. Сбор данных
- Соблюдайте микротрубочек скольжения с помощью флуоресцентной микроскопии; микроскопа способна решить одну флуорофоры, такие как коммерческие или домашние сборка установки TIRF требуется 26 (рис. 2).
Микротрубочек должно быть движение с помощью двигателя кинезин на подложке примерно в 0,5 мкм / с, в зависимости от температуры. Если поле-обзора микроскопа составляет 50 мкм, индивидуальные микротрубочки должны быть видны в течение примерно 100 секунд. Установите интенсивность освещения таким образом, чтобы одна флуорофоров не photobleach быстрее, чем 100 сек. При использовании лазерного возбуждения, мощность установки примерно 3-5 мВт является целесообразным. - Сбор последовательности изображений для анализа. 600 изображений в5 Гц (2 мин общего числа) работает хорошо. Использование последовательности достаточно долго, что микротрубочки пройти все поле-обзора.
5. Анализ данных
Рутинной IDL, get_lp.pro , прилагается. Эта процедура возвращает значение сохранения длины на основе всех микротрубочек скольжения в данной последовательности изображений. Либо запустить эту процедуру на каждой последовательности изображений, изменение параметров интенсивности в зависимости от настройки микроскопа, или выполните следующие действия:
- Отслеживать каждого флуорофора прикреплены к микротрубочек создать флуорофора траектории.
- Смешайте все траектории флуорофоры на данный микротрубочек в общую траекторию микротрубочек, повторите для каждого микротрубочек в последовательности изображений (рис. 3).
- Расчет касательной углом друг к точке вдоль траектории (рис. 4), И вычислить <cos θ S> в формуле. 1 путем усреднения косинус угла разница для каждой пары точек, разделенных пути длиной S (рис. 5). Найти сохранением длины для одного микротрубочек или группы микротрубочек путем установки <cos θ S> к уравнению. 1, взвешивание отдельных точек данных в соответствие, число независимых значений соз θ с, которые используются для вычисления среднего.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Постоянство измерений длины являются хорошей характеристикой механических свойств отдельных биополимеров. В этой статье мы описали метод измерения с сохранением длины микротрубочек. Как отмечалось во введении, этот метод легко распространить на изучение механических свойств микротрубочек в различных условиях просто путем изменения реагентов, температуры и вязкости в заключительном этапе анализа скольжения, 3,9, или путем полимеризации микротрубочек, шаг 1,1, в различных условиях.
Сама методика быстро выполнить. После складе решения были подготовлены заранее (шаг 1), эксперимент скольжение анализ может быть выполнен в течение 2-3 ч, в том числе до четырех вариантах в условиях на одном слайде микроскопа (четыре полосы движения в шаге 3,1). Многие микротрубочки могут быть рассмотрены в каждом эксперименте, типичный эксперименты в нашей лаборатории изучения 100 микротрубочек в условии (около 10 изображений sequencES на полосу, с 10 микротрубочек в последовательности). Анализа больших наборов данных тоже довольно быстро. С практикой, 10 последовательностей изображений могут быть проанализированы для сохранения длины в день или около того с современными ПК. Ограничение скорости шаг в анализе время, чтобы отслеживать отдельные флуорофоров; новые методы отслеживания обещают увеличить эту скорость в значительной степени 27.
Поскольку метод включает в себя отслеживание одного флуорофоров прилагается к данному микротрубочек, точность отслеживания ограничивается только фотон сбор, и могут быть в масштабе нанометров, 22, 25. В том числе данные из многих флуорофоры, точность дальнейшего совершенствования. Потенциально, даже более высокая точность может быть достигнута путем присоединения очень яркий флуоресцентный объектов, таких как квантовые точки, к микротрубочек.
В то время как точность индивидуальных траекторий довольно хорошо, неопределенность в сохранение леngths измеряется с этой техникой (по шкале ± 50% для одного микротрубочек) все еще остается значительной. Основным ограничением в точности измерений сохранением длины статистики, участвующие в среднем соз θ с. Как контур расстояние между парами точек, S, увеличивается число независимых измерений θ уменьшается с л / с, где L-длина микротрубочек траектории изучены. Увеличение длины микротрубочек траекторий позволит улучшить точность измерений сохранением длины.
Второе ограничение этого метода является требование, чтобы биотинилированного кинезин-1 будет использоваться для конкретных вложений кинезина на микроскопом. Биотинилированные кинезин должна быть очищена (от E. Coli в нашем случае), и просто не может быть приобретена в готовом виде. Тем не менее, анализ изменения скольжения использованием unbiotinylated родственниковЕсин могут быть использованы 28; кинезин тяжелой белковой цепи, которые могут быть пригодны для этой техники является коммерчески доступные от цитоскелета (KR01). Изменение анализа скольжения использовать этот альтернативный кинезин не повлияет микротрубочек жесткость при изгибе в любом случае, и, таким образом, позволяют групп, не имеющих доступа к рекомбинантного белка кинезин использовать этот метод.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Мелисса Klocke за помощь подготовке Рисунок 1 и Анна Ratliff для демонстрации протокол. Эта работа была поддержана Research Corporation по науке улучшению.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
BSA | Calbiochem | 126615 | |
biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
Equipment | |||
TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).