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Bioengineering

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Published: November 9, 2012 doi: 10.3791/50117
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physics, Lawrence University

Summary

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Abstract

Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto que desempeñan un papel en la división celular, la mecánica celular y el transporte intracelular. Cada una de estas funciones requiere microtúbulos que son rígidos y recta suficiente para abarcar una fracción significativa de la célula de diámetro. Como resultado, la longitud de persistencia microtúbulos, una medida de la rigidez, se ha estudiado activamente durante las últimas dos décadas 1. No obstante, las preguntas abiertas permanecen: microtúbulos cortos son 10-50 veces menos rígidos que los microtúbulos largos 2-4, e incluso microtúbulos largas han medido las longitudes de persistencia que pueden variar en un orden de magnitud 5-9.

A continuación, se presenta un método para medir la longitud de microtúbulos persistencia. El método se basa en un kinesin impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento 10. Mediante la combinación de etiquetado fluorescente escaso de microtúbulos individuales con seguimiento sola partícula de fluoróforos individuales unidos a los microtúbulos, la gliding trayectorias individuales de los microtúbulos se realiza un seguimiento con precisión nanométrica nivel. La persistencia de longitud de las trayectorias es la misma que la longitud de persistencia de los microtúbulos en las condiciones utilizadas 11. Una rutina de seguimiento automatizado se utiliza para crear trayectorias de microtúbulos a partir de los fluoróforos unidos a los microtúbulos individuales, y la longitud de persistencia de esta trayectoria se calcula utilizando las rutinas escritas en IDL.

Esta técnica es rápida implementación, y capaz de medir la longitud de persistencia de 100 microtúbulos en un día de experimentación. El método puede ser extendido para medir la longitud de persistencia bajo una variedad de condiciones, incluyendo la longitud de persistencia como una función de la longitud a lo largo de microtúbulos. Además, las rutinas de análisis usados ​​pueden extenderse a miosina de acción basados ​​en ensayos de deslizamiento, para medir la longitud de persistencia de los filamentos de actina también.

Introduction

El citoesqueleto, una red de biopolímeros se encuentran en la mayoría de las células eucariotas, desempeña un papel en la organización celular, el transporte intracelular, y la mecánica celular. Las características mecánicas de los biopolímeros del citoesqueleto (principalmente actina y microtúbulos) desempeñan un papel importante en la determinación de las características mecánicas de la célula como un todo 12. Puesto que la mecánica de células enteras puede caracterizar células sanas y enfermas 13,14 y está implicado en la motilidad celular 15, las propiedades mecánicas de los componentes del citoesqueleto subyacentes han sido un área activa de estudio para las dos últimas décadas 1.

La flexibilidad (o rigidez) de los biopolímeros se caracteriza por la persistencia de longitud, la longitud de polímero que se dobla por aproximadamente un radián menores fluctuaciones térmicas a temperatura ambiente. Una serie de técnicas han sido desarrolladas para medir la longitud de persistencia 16, para example activos técnicas que implican doblar el polímero utilizando flujo hidrodinámico, trampas ópticas, o campos eléctricos 4,17,18, y técnicas pasivas que miden las fluctuaciones de polímeros libres en solución 5,6. Las mediciones activos, sin embargo, requieren configuraciones especiales para aplicar fuerzas conocidas en la escala del micrómetro, y las mediciones de libre fluctuación puede ser difícil debido a la difusión fuera del plano de foco del microscopio utilizado.

En este artículo, se describe un complementaria, técnica pasiva, para medir la longitud de persistencia de los microtúbulos, un polímero citoesquelético. La técnica consiste en ensayos de deslizamiento, que aseguran que el polímero permanece siempre en el plano focal 19. Por otra parte, implica el seguimiento fluoróforos individuales unidos permanentemente al polímero de interés, de modo que los lugares específicos a lo largo del polímero están bien caracterizados.

Una caricatura del método se muestra en la Figure 1. Kinesin mueve específicamente hacia el extremo + de microtúbulos, por lo que los microtúbulos en un ensayo de deslizamiento son impulsados ​​unidireccionalmente. El extremo delantero de los microtúbulos, más allá de la quinesina último unido, es libre de fluctuar bajo las fuerzas térmicas de la solución circundante. Como los microtúbulos es propulsado hacia adelante, el extremo fluctúa hasta la unión a una molécula de quinesina nuevo aún más a lo largo de la lámina de vidrio se congela en una fluctuación dada. Debido a kinesin concede microtúbulos muy fuertemente, los microtúbulos se ve obligado a seguir el camino del extremo delantero. Por lo tanto, las fluctuaciones estadísticas congelados en la trayectoria de microtúbulos son las mismas que las fluctuaciones estadísticas del extremo libre 11 de los microtúbulos, y por lo tanto se puede utilizar para calcular la longitud de persistencia de acuerdo con 20

Ecuación 1 donde p es l la longitud de persistencia de los microtúbulos, s θ es el ángulo entre las tangentes a la trayectoria separados por una longitud de contorno s, y <> denota un promedio sobre todos los pares de posiciones separadas por una longitud de contorno s.

El ensayo de deslizamiento misma utiliza kinesin biotinilado en el enrollado de la bobina 21 se unía específicamente a la placa de vidrio mediante un enlace estreptavidina-biotina. Esta unión se asegura de que los dominios de motor son libres para unirse a microtúbulos y propulsar. Con el fin de seguir la trayectoria de microtúbulos, los microtúbulos están escasamente etiquetados con fluoróforos orgánicos 22,23 - las etiquetas deberán ser lo suficientemente escasa que fluoróforos individuales se pueden resolver utilizando microscopía de fluorescencia de una sola molécula. Fluoróforos individuales son rastreados utilizando rutinas de análisis de imágenes escrito en IDL. Las trayectorias de cada fluoróforo unido a un micrófono dadorotubule se combinan en una trayectoria de microtúbulos compuesto automáticamente 24. Los ángulos tangentes θ para cada punto a lo largo de una trayectoria se calculan, a partir de estos ángulos tangentes de la <cosθ s> valor se calcula para cada longitud de contorno s. Finalmente, estos datos se ajustan a la ecuación. 1 con el fin de extraer una longitud de persistencia para un microtúbulo dado, o para muchos microtúbulos en el mismo ensayo de deslizamiento.

El método es lo suficientemente robusto como para trabajar con los microtúbulos preparados en una amplia variedad de condiciones (con diferentes agentes estabilizantes u otras moléculas pequeñas unidas a los microtúbulos, con las proteínas microtubulares unidos asociadas (MAPs), o con una variedad de soluciones viscosas). En nuestro laboratorio, la técnica se ha utilizado para caracterizar la longitud de persistencia de los microtúbulos como una función de la longitud a lo largo de los microtúbulos y los microtúbulos con diferentes agentes estabilizantes. La restricción principal es que los microtúbulos todavía debe spoyo kinesin motilidad. Desde quinesina es una enzima motor robusto, esta es una restricción bastante suelta. Mediante la sustitución de microtúbulos con la actina y la quinesina con una enzima de familia de la miosina, la longitud de persistencia de la actina puede ser medida utilizando la misma técnica.

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Protocol

1. Microtúbulos delta del ensayo de Soluciones

Prepárese con ensayo de deslizamiento.

  1. Polimerizar 0,5 mg microtúbulos poco marcados con fluoróforo brillante orgánica 22. La concentración etiqueta de destino es 1 fluoróforo por micrómetro de microtúbulos, o una densidad de etiquetado de aproximadamente 1 por cada 1.500 fluoróforo dímeros de tubulina. Almacenar a temperatura ambiente, protegida de la luz con aluminio, papel de aluminio de hasta dos semanas.
  2. Purificar biotina-quinesina 21 a aproximadamente 1 mM. Almacenar a -80 ° C en 5 ml de alícuotas para su uso en los experimentos individuales.
  3. Preparar el tampón de ensayo (AB) de imidiazole 50 mM, 50 mM de cloruro de potasio (KCl), 4 mM de cloruro magnésico (MgCl 2), 2 mM etilenglicol tetraacético (EGTA), pH 6,7. Filtro estéril y se almacena a 4 ° C.
  4. Disolver albúmina de suero bovino biotinilada (biotina-BSA) a 2 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras.Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 º C hasta por un mes.
  5. Disolver estreptavidina (SA) a 10 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 20 l durante largos períodos de tiempo, a 4 ° C durante hasta dos semanas.
  6. Disolver α-caseína a 5 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 ° C durante hasta dos semanas.
  7. Disolver ditiotreitol (DTT) en agua desionizada a 200 mM. Almacenar a -20 ° C en 100 ml de alícuotas, utilizar antes de 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar.
  8. Disolver paclitaxel (PT) en grado HPLC-dimetil sulfóxido (DMSO) a 4 mM. Almacenar en 10 ml de alícuotas a -80 º C a largo plazo, -20 ° C a corto plazo. Usar dentro de las 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar.
  9. Disolver la glucosa en agua desionizada a 120 mg / ml. Almacenar en 100 ml de alícuotas a -20 ° C. Se puede volver a congelar.
  10. Disresolver el trifosfato de adenosina (ATP) en agua desionizada a 150 mM, pH 7,0. Tienda en 5 alícuotas a -80 ° C, utilizar antes de 8 horas de descongelación.
  11. Preparar 100x acciones de captación de oxígeno 25 mediante la disolución de 10.000 unidades de glucosa oxidasa y catalasa 156.000 unidades en 600 l tampón de ensayo total. Centrifugar brevemente en una microcentrífuga para sedimentar los sólidos; sobrenadante filtro con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 10 l durante largos períodos de tiempo, a 4 º C durante hasta una semana.

2. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos, Preparación misma solución de Día

Preparar las soluciones en 2.1-2.6 en el día del experimento. Con la práctica, las soluciones de 2.2-2.6 se pueden preparar durante el lavado de celda de flujo. A menos que se indique lo contrario, mantener soluciones madre en hielo.

  1. Preparar AB, 1 ml de tampón de ensayo con 10 l de DTT de stock (AB con 2 mM DTT). Conservar a temperatura ambiente.
  2. Preparar bio-tampón BSA, 40 y mu; L de una mezcla 1:1 de la población de biotina-BSA y AB. Conservar a temperatura ambiente.
  3. Preparar tampón de BSA, la mezcla de 645 l de AB con 5,5 l de BSA (1 mg / ml de BSA en AB). Conservar a temperatura ambiente.
  4. Preparar tampón SA, mezclar 57 l de AB con 3 l de stock estreptavidina (0,5 mg / ml de estreptavidina en AB). Conservar a temperatura ambiente.
  5. Preparar α-caseína tampón, mezclando 200 l de tampón BSA, 50 l de stock caseína, y 0,8 l de ATP mu M 15 (1 mg / ml de α-caseína, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM ATP en AB). Conservar a temperatura ambiente.
  6. Preparar fluorescencia anti-cloro tampón, mezclar 95 l α-caseína tampón, 2,5 stock de glucosa l, 1 l mezcla oxígeno 100x compactación, 1 stock de paclitaxel l, 1 l de 2-mercaptoetanol (βME). Añadir βME bajo campana de humos. Utilice fluorescencia anti-blanqueo tampón dentro de 1 hora de preparación PRECAUCIÓN:. ΒME es altamente tóxico y huele horrible. Asegúrese de abrir sólo en la campana de humos. Tienda botella en laausencia de luz, la luz degrada βME y su capacidad para reducir photobleaching.

3. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos

  1. Construir sobre cuatro carriles de flujo entre un cubreobjetos de 24 x 60 mm y 22 x 22 mm cubreobjetos utilizando grasa de vacío, extruidos de una jeringa a través de una punta de pipeta, como un espaciador. Cada carril de flujo debe ser de aproximadamente 10 l en volumen (escala volúmenes subsiguientes).
  2. Lavar 10 l de bio-tampón BSA en cada carril. Incubar 5 min para permitir la BSA para revestir las superficies de vidrio.
  3. Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre biotina-BSA, mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento. Utilice un Kimwipe o papel de filtro para eliminar el tampón desde el lado opuesto de la cámara de flujo, asegurándose de no permitir que las burbujas de aire que pasar por la cámara de flujo.
  4. Lávese 15 l SA-buffer en cada carril. Esperar 10 min, o hasta 2 hr. La estreptavidina se une a la superficie unida a biotina-BSA.
  5. Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre SA mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento.
  6. Lavar cada carril con 15 l α-caseína tampón. α-caseína ayuda adicional bloquear la unión no específica de kinesin y los microtúbulos en el cristal.
  7. Diluir kinesin a 10 nM en tampón de α-caseína y lavar cada carril con 15 l de esta kinesin - α-caseína solución. Esperar 15 min (o hasta una hora) para la quinesina biotinilada para unirse específicamente a la estreptavidina unida a la superficie. Los dominios kinesin motor seguirá siendo gratuito a los microtúbulos se unen.
  8. Diluir paclitaxel a 40 micras a temperatura ambiente α-caseína de amortiguamiento, y lave cada carril con 15 l de esta solución para lavar kinesin libre y para precargar cada cámara de flujo con una solución de paclitaxel de microtúbulos para prevenir la despolimerización. Fría también despolimeriza microtúbulos, así que asegúrese de estas medidas se producen a temperatura ambiente con habitación temre soluciones.
  9. Diluir la etiqueta fluorescente microtúbulos 1:100-1:1,000 de la fluorescencia anti-blanqueo tampón con 1 mM ATP. Lavar 15 l en un carril y observar dentro de 30 min.

4. Recopilación de datos

  1. Observe el deslizamiento microtúbulos mediante microscopía de fluorescencia, un microscopio capaz de resolver los fluoróforos individuales, tales como una configuración de TIRF comercial o doméstica de aumento se requiere 26 (Figura 2).
    Los microtúbulos debe ser propulsado por los motores de quinesina sobre el sustrato a aproximadamente 0,5 m / s, dependiendo de la temperatura. Si el campo de visión del microscopio es de 50 micras, los microtúbulos individuales debe ser visible para aproximadamente 100 seg. Establecer la intensidad de iluminación de manera que los fluoróforos individuales no fotoblanqueador más rápidamente que 100 seg. Si se utiliza láser de excitación, un ajuste de potencia de aproximadamente 3-5 mW es apropiado.
  2. Recoger secuencias de imágenes para el análisis. 600 imágenes en5 Hz (2 en total min) funciona bien. Usar secuencias tiempo suficiente que los microtúbulos atravesar todo el campo de visión.

5. Análisis de Datos

Una rutina de IDL, get_lp.pro , se adjunta. Esta rutina devuelve un valor de longitud de persistencia basado en toda deslizamiento microtúbulos en una secuencia de imagen dada. O utilizar esta rutina en cada secuencia de imágenes, modificar parámetros de intensidad en función de la configuración del microscopio especial, o haga lo siguiente:

  1. El seguimiento de cada fluoróforo unido a un microtúbulo para crear trayectorias de fluoróforo.
  2. Combinar todas las trayectorias de fluoróforos sobre un microtúbulo determinado en una trayectoria de microtúbulos en general, repetir para cada uno de los microtúbulos en la secuencia de imágenes (Figura 3).
  3. Calcular el ángulo tangente a cada punto a lo largo de la trayectoria (Figura 4)Y calcular <cos θ s> en la ecuación. 1 promediando el coseno de la diferencia de ángulo para cada par de puntos separados por una longitud de recorrido s (Figura 5). Halla la longitud de persistencia para un microtúbulo o grupo de microtúbulos por <cos ajuste θ s> a la ecuación. 1, la ponderación de los puntos de datos individuales en el ajuste por el número de valores independientes de cos θ s que se utilizan para calcular el promedio.

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Representative Results

Una instantánea de un ensayo de deslizamiento se muestra en la Figura 2. Una densidad de los microtúbulos es bueno microtúbulos 1-10 por campo de visión; sustancialmente más resultará en mal seguimiento como microtúbulos se cruzan entre sí. Una gráfica de las trayectorias 11 de microtúbulos a partir del ensayo de deslizamiento en la Figura 2 se muestra en la Figura 3. Trayectorias típicas son de 10 a 30 um de largo; algunas trayectorias tienen espacios donde uno se cruza con otra de microtúbulos. Estas trayectorias pueden ser descartados del análisis.

Una trayectoria individual, microtúbulos largo se muestra en la Figura 4A con ángulos tangentes ejemplo en dos posiciones a lo largo de la trayectoria. La diferencia entre los ángulos tangentes separadas por una distancia fija está relacionada con la longitud de persistencia, el ángulo tangente como una función de la posición a lo largo de la trayectoria de microtúbulos se muestra en la Figura 4B.

Los datos del ángulo de tangentesde trayectorias de microtúbulos muchos se combinan para calcular una longitud de persistencia único para todos los microtúbulos en un experimento dado. Figura 5 muestra una gráfica de <cos θ s> s frente a longitud de contorno para el ensayo de deslizamiento de la figura 2. A grandes valores de contorno de longitud, muy pocos valores de cos θ se mide, por lo que el promedio es muy variable. El ajuste ponderado conforme a la s corto y de alta precisión de los datos más de cerca que el s largo plazo, de baja precisión de datos.

El valor de la longitud de persistencia de estos 11 trayectorias, 500 ± 40 m (± error estándar de la media), es representativo de longitudes de persistencia para los microtúbulos relativamente cortas 2. Experimentos similares dan un rango de longitudes de persistencia entre 300 y 1.000 micras.

Solución de problemas

Si microtúbulos están completamente ausentes, increase la concentración de los microtúbulos en el paso 3,9 a 0,5 mg / ml. Si microtúbulos están todavía desaparecidas, re-polimerizan los microtúbulos. Hacer paclitaxel seguro está presente en cada solución de microtúbulos se diluyen en lo contrario, los microtúbulos se despolimerizan.

Si microtúbulos son de libre difusión en solución, pero no la unión a la superficie, aumentar la concentración de quinesina en el paso 3,7 y el uso de AMP-PNP en lugar de ATP para asegurar quinesina se une irreversiblemente microtúbulos. Si todavía no los microtúbulos se unen, hacen nuevas acciones estreptavidina y el tampón, seguido por el nuevo biotina-BSA. Por último, purificar kinesin biotinilado nuevo.

Si los microtúbulos se unen pero no se mueven, reemplace solución de ATP stock con fresco ATP.

Si fluoróforos fotoblanqueador demasiado rápido, reducir la intensidad de la iluminación. Si todavía fluoróforos fotoblanqueador demasiado rápido, reemplazar el sistema de captación de oxígeno con material fresco.

Si fluorophores son demasiado tenues, aumentar la intensidad de la iluminación.

Figura 1
Figura 1. Caricatura del ensayo de deslizamiento de microtúbulos. Enzimas Kinesin se une específicamente a un cubreobjetos por un enlace biotina-estreptavidina. Los microtúbulos son escasamente etiquetados con fluoróforos orgánicos. Tras la adición de ATP, los microtúbulos son empujados por los motores de quinesina. El extremo delantero libre de la microtúbulos fluctúa debido a las fuerzas térmicas en solución; estas fluctuaciones se utilizan para calcular la longitud de persistencia microtúbulos. La escala de longitud de los microtúbulos sondeado por estos experimentos es la longitud del extremo libre.

Figura 2
Figura 2. Instantánea microscopio típica de un ensayo de deslizamiento, tomada a través de microscopía TIRF. Microtu bules están escasamente decorada con fluoróforos individuales. Barra de escala es de 5 m.

Figura 3
Figura 3. Trayectorias de microtúbulos a partir de la secuencia de imágenes se muestra en la Figura 2. Cada trayectoria microtúbulos combina muchas trayectorias solo fluoróforo (alrededor de 10 en promedio), y se han diluido a un punto por cada 100 nm.

Figura 4
Figura 4. Cálculo de los ángulos tangentes a la trayectoria. (A) Trayectoria de un microtúbulo, con ángulos de ejemplo tangentes (θ) que se muestran. (B) ángulo tangente como una función de la posición a lo largo de la trayectoria de microtúbulos. Estos datos se utilizan para calcular los ángulos medios utilizados en la ecuación. 1.

ays "> Figura 5
Figura 5. Cálculo de longitud de persistencia desde ángulos tangentes. (Puntos) Argumento de <cos θ s> frente a la longitud de contorno s para las 11 trayectorias mostradas en la Figura 3. (Línea continua) Ajustar a la ecuación. 1. Para este grupo de microtúbulos, la persistencia de longitud es de 500 ± 40 micras. Para longitudes de curvas largas (por encima de 10 micras o menos), los datos son muy variables debido a las estadísticas limitadas.

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Discussion

Mediciones Longitud persistencia son una buena caracterización de las propiedades mecánicas de biopolímeros individuales. En este artículo, hemos descrito un método de medición de la longitud de persistencia de los microtúbulos. Como se ha señalado en la introducción, este método se extiende fácilmente a examinar las propiedades mecánicas de microtúbulos en una variedad de condiciones, simplemente variando los reactivos, la temperatura o viscosidad en la etapa final del ensayo de deslizamiento, 3,9, o por polimerización de microtúbulos, paso 1,1, bajo diferentes condiciones.

La misma técnica es rápida de realizar. Una vez que las soluciones madre se han preparado antes de tiempo (paso 1), un experimento de ensayo de deslizamiento se puede realizar en 2-3 horas, incluyendo hasta cuatro variaciones de las condiciones sobre un portaobjetos de microscopio (solo los cuatro carriles en el paso 3,1). Microtúbulos pueden examinar muchas en cada experimento; experimentos típicos en nuestro laboratorio de examinar 100 microtúbulos por condición (alrededor de 10 imagen secuenciaciónes por carril, con 10 microtúbulos por secuencia). El análisis de grandes conjuntos de datos es también bastante rápido. Con la práctica, 10 de secuencias de imágenes se pueden analizar para la longitud de persistencia en una tarde o así con un PC moderno. La tasa de limitación de paso en el análisis es el momento para realizar un seguimiento fluoróforos individuales; nuevos métodos de seguimiento prometen aumentar esta velocidad sustancialmente 27.

Debido a que el método implica el seguimiento fluoróforos individuales conectados a un microtúbulo dado, la precisión de seguimiento sólo está limitado por recolección de fotones, y puede estar en la escala de nanómetros 22, 25. Mediante la inclusión de datos procedentes de muchos fluoróforos, la precisión se mejora aún más. Potencialmente, una precisión aún mayor podría ser alcanzado uniendo objetos fluorescentes muy brillantes, como los puntos cuánticos, a los microtúbulos.

Mientras que la precisión de las trayectorias individuales es bastante bueno, la incertidumbre en la persistencia lengths medidos con esta técnica (en la escala de ± 50% para una sola microtúbulos) sigue siendo significativa. La limitación fundamental en la precisión de las mediciones de longitud de persistencia es la estadística que participan en promedio cos θ s. Como la longitud de contorno entre pares de puntos, s, aumenta, el número de mediciones independientes de θ s disminuye a medida que L / s, donde L es la longitud de la trayectoria de microtúbulos estudiado. El aumento de la longitud de las trayectorias de microtúbulos permitiría precisión mejorada en las mediciones de longitud de persistencia.

Una segunda limitación de este método es el requisito de que biotinilado quinesina-1 usar para la unión específica de la quinesina a portaobjetos de microscopio. Kinesin biotinilado debe ser purificado (de E. coli en nuestro caso), y no se puede simplemente comprar fuera de la plataforma. Sin embargo, un ensayo modificado de deslizamiento utilizando parientes no biotiniladaesin se puede usar 28; proteína kinesin cadena pesada que podría ser adecuado para esta técnica está disponible comercialmente de Cytoskeleton (KR01). Modificación del ensayo de deslizamiento para utilizar esta kinesin alternate no afectaría a la rigidez a la flexión de microtúbulos en modo alguno, lo que permitiría a los grupos que no tienen acceso a la proteína recombinante quinesina para utilizar este método.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Acknowledgments

Damos las gracias a Melissa Klocke de asistencia preparando la Figura 1 y Ratliff Anna para demostrar el protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Corporación de Investigaciones para el Avance de la Ciencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
imidazole Sigma-Aldrich I2399
potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
EGTA Sigma-Aldrich E3889
BSA Calbiochem 126615
biotinylated BSA Thermo Scientific 29130
α-casein Sigma-Aldrich C6780
streptavidin Thermo Scientific 21125
dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
paclitaxel LC Laboratories P-9600
glucose oxidase Sigma-Aldrich G2133
catalase Sigma-Aldrich C100
glucose Sigma-Aldrich G8270
ATP Sigma-Aldrich A2383
2-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M3148 Toxic. Buy small amount.
24X60 mm No. 1 1/2 cover glass VWR 48393-252
22X22 mm No. 1 cover glass Gold Seal 3306
High Vacuum Grease Dow-Corning NA
Equipment
TIRF microscope many NA The TIRF microscope used in this method was home-made.
IDL (software) Exelis NA Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biofísica Número 69 Bioingeniería Física Biología Molecular Biología Celular microtúbulos la longitud de la persistencia la rigidez a la flexión ensayo de vuelo sin motor mecánica citoesqueleto la actina
Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela
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Martin, D. S., Yu, L., Van Hoozen,… More

Martin, D. S., Yu, L., Van Hoozen, B. L. Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays. J. Vis. Exp. (69), e50117, doi:10.3791/50117 (2012).

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