Summary
Sebat uzunluğu veya biyopolimerlerin eğilme rijitliği ölçmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem deneysel olarak bireysel mikrotübül kalıcılığı uzunluğunu belirlemek için bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi kullanmaktadır ve aktin bazlı kayma deneyleri için uyarlanabilir.
Abstract
Mikrotübüller sitoskeletal hücre bölünmesinde rol polimerler, hücre mekaniği, ve hücre içi taşıma vardır. Bu fonksiyonların her biri sert ve hücre çapı önemli bir kısmını kapsayan düz yeterli mikrotübüller gerektirir. Sonuç olarak, mikrotübül kalıcılık uzunluğu, sertlik ölçüsü, aktif son yirmi yılda 1 için incelenmiştir. Kısa mikrotübüller uzun mikrotübüller 2-4 den 10-50 kat daha sert, ve hatta uzun mikrotübüller büyüklükte 5-9 sipariş göre farklılık sebat uzunlukları ölçüldü: Bununla birlikte, açık sorular kalır.
Burada, mikrotübül sebat uzunluğunu ölçmek için bir yöntem mevcut. Yöntem bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi 10 dayanır. Mikrotübül bağlı bireysel floroforlar tek parçacık izleme, glidin bireysel mikrotübül seyrek floresan etiketleme birleştirerekTek mikrotübüller g yörüngeleri nanometre seviyesinde hassasiyet ile izlenir. Yörüngesel süreklilik uzunluğu 11 kullanılan şartlar altında mikrotübülün kalıcılığı uzunluğu ile aynıdır. Bir otomatik izleme rutin bireysel mikrotübüller bağlı floroforlar gelen mikrotübül yörüngeleri oluşturmak için kullanılır ve bu yörünge sebat uzunluğu IDL yazılmış rutinleri kullanılarak hesaplanır.
Bu teknik hızla uygulanabilir, ve deney bir gün içinde 100 mikrotübül sebat uzunluğu ölçme yeteneğine sahiptir. Yöntem mikrotübüller boyunca uzunluğunun bir fonksiyonu olarak süreklilik uzunluk dahil çeşitli koşullar altında kalıcılık uzunluğunu ölçmek için genişletilebilir. Ayrıca, kullanılan analiz rutinleri yanı aktin filamentler sebat uzunluğunu ölçmek için, miyozin tabanlı etkili kayma deneyleri için uzatılabilir.
Introduction
Hücre iskeleti, çoğu ökaryotik hücrelerde bulunan biyopolimerlerin bir ağ, hücresel organizasyon, hücre içi ulaşım, ve hücre mekaniği bir rol oynar. Hücre iskeleti (öncelikle aktin ve mikrotübüller) ve biyopolimerlerin mekanik özellikleri de, bir bütün olarak 12 hücre mekanik özelliklerini belirlemede önemli bir rol oynamaktadır. Tüm hücre mekaniği, sağlıklı ve hastalıklı hücrelerin 13,14 karakterize edebilir ve hücresel motilite 15 dahil olduğundan, altta yatan sitoskeletal bileşenlerin mekanik özellikleri son yirmi yılda 1 için çalışma aktif alan olmuştur.
Biyopolimerlerin esneklik (veya sertliği) kalıcılığı uzunluğu, ortam sıcaklığında, ısı dalgalanmaları altında yaklaşık bir radyan tarafından eğilir polimer uzunluğu ile karakterize edilir. Bir dizi teknik examp için sebat uzunluğu 16, ölçmek için geliştirilmiştirhidrodinamik akış, optik tuzakları, ya da elektrik alanları 4,17,18, ve çözüm 5,6 ücretsiz polimerlerin dalgalanmaları ölçmek pasif teknikleri kullanarak polimer bükme içeren le aktif teknikleri. Aktif ölçümler, ancak özel kurulumları mikrometre ölçekte bilinen kuvvetler uygulamak gerektirir ve serbest dalgalanma ölçümleri kullanılan mikroskop odak düzlemi difüzyon dışarı nedeniyle zor olabilir.
Bu yazıda, mikrotübül sebat uzunluğu, sitoskeletal polimer ölçmek için tamamlayıcı, pasif, tekniği açıklar. Tekniği polimer daima 19 odak düzlemi kalmasını sağlamak kayma testleri, içerir. Ayrıca, polimer boyunca belirli yerlerde de karakterize edilir, böylece ilgi polimer ile kalıcı olarak bağlanmış tek bir izleme floroforlar, içerir.
Yöntemin özel bir çizgi Figür gösterilire 1. Kinesin mikrotübül + sonuna doğru özellikle hareket, yani bir kayma tayininde mikrotübül tek yönlü tahrikli. Mikrotübül yapının önde gelen ucunu, ekli son kinesin ötesinde, çevreleyen bir çözelti termal kuvvetler altında dalgalanma serbesttir. Mikrotübül ileri itilir gibi, uç cam slayt üzerinde daha ileri bir yeni kinesin molekül bağlama kadar belirli bir dalgalanma, donar dalgalanır. Kinesin çok güçlü mikrotübüller ekler Çünkü, mikrotübül lider sonu yolunu takip sınırlıdır. Bu nedenle, mikrotübül yörünge donmuş istatistiksel dalgalanmalar mikrotübüllerin 11 serbest uç bölgesinin istatistiksel dalgalanmalar aynıdır, ve bu yüzden 20 göre süreklilik uzunluk hesaplamak için de kullanılabilir
l p mikrotübülün sebat uzunluğu nerede, θ s kontur uzunluğu s ayrılmış yörünge için teğet arasındaki açı olup, <> temsil eder bir kontur uzunluğu s ile ayrılmış pozisyonları tüm çiftleri üzerinde bir ortalama.
Kayma testi kendisi özel bir streptavidin biotin bağlantı yoluyla cam slayt bağlı coiled coil 21'de kinesin biotinlenmiş kullanır. Bu eki motora etki bağlamak ve mikrotübüller itmek için ücretsiz sağlar. Mikrotübül yörüngeleri takip etmek için, mikrotübüller seyrek organik floroforlar 22,23 ile etiketlenir - etiketler tek floroforlar tek bir molekül floresan mikroskobu kullanılarak çözülebilir olması yeterli seyrek olmalıdır. Tek floroforlar IDL yazılmış görüntü analiz rutinleri kullanılarak izlenir. Her fluorofor yörüngeleri belirli bir mikrofon bağlırotubule otomatik 24 bileşik mikrotübül yörünge birleştirilir. Bir yörünge boyunca her noktasına θ teğet açıları hesaplanır; bu teğet açılardan <cosθ s> değeri, her kontur uzunluğu ler için hesaplanır. Son olarak, bu veriler Denk sığdırılır. 1. Belirli bir mikrotübül için bir kalıcılık uzunluk elde etmek için, ya da aynı kayma tahlil içinde çok mikrotübüller için.
Yöntem koşullarının geniş bir çeşitliliği (bağlı mikrotübül ilişkili protein (MAP), ya da viskoz bir dizi çözüm ile, mikrotübül bağlı farklı stabilizasyon ajanları ya da diğer küçük moleküllerin) 'de hazırlanan mikrotübüller birlikte çalışmak için yeterince sağlamdır. Bizim laboratuvarda, teknik farklı dengeleyici maddeler ile mikrotübüllerin ve mikrotübüller boyunca uzunluğunun bir fonksiyonu olarak mikrotübül kalıcılığı uzunluk karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ana sınırlamadır mikrotübül hala zorunluluk olduğunuupport kinesin motilitesi. Kinesin bir sağlam motor enzim olduğundan, bu oldukça gevşek bir sınırlamadır. Bir miyozin aile enzimi ile aktin ve kinesin ile mikrotübüller değiştirerek, aktin sebat uzunluğu aynı tekniği kullanılarak ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrotubul Kayma Testi Stok Çözümleri
Öncesinde kayma testin hazırlayın.
- Seyrek parlak organik fluorofor 22 ile etiketlenmiş 0.5 mg mikrotübüller Polimerize. Hedef etiketi konsantrasyonu 1 mikrotübülün mikrometre başına fluorofor veya 1.500 tübülin dimerleri başına yaklaşık 1 fluorofor bir etiketleme yoğunluğudur. Oda sıcaklığında, ışık saklayın kadar iki hafta için alüminyum folyo ile korunmaktadır.
- Yaklaşık 1 mcM az biotin kinesin 21 arındırın. -80 ° C'de saklayın ayrı deneylerde kullanılmak için 5 ul alikotları.
- 50 mM imidiazole ve deney tamponu (AB), 50 mM potasyum klorid (KCl), 4 mM magnezyum klorür (MgCI2), 2 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), pH 6.7 hazırlayın. 4 at Steril filtre ve mağaza ° C
- 2 mg / AB içinde ml biotinlenmiş sığır serum albumini (biotin-BSA) çözülür. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre.-80 Store 4 de uzun süreler için 100 ul alikotları ° C, ° C kadar bir ay için.
- 10 mg / AB ml için streptavidin (SA) çözülür. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre. -80 Mağazası kadar iki hafta için 4 ° de uzun süreler için 20 ul alikotları C, ° C.
- 5 AB mg / ml 'ye α-kazein eritilir. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre. -80 Store 4 de uzun süreler için 100 ul alikotları ° C, ° C iki hafta için.
- 200 mM deiyonize su ditiyotretol (DTT) çözülür. 100 ul alikotları -20 ° C'de saklayın, çözdürme 8 saat içerisinde tüketilmelidir. Tekrar dondurulmamalıdır olabilir.
- 4 mM HPLC-grade dimetil sülfoksit (DMSO) içinde paklitaksel (PT) eritilir. -80 10 ul alikotları Mağaza ° C Uzun süreli, -20 ° C kısa süreli. Çözdürme 8 saat içinde kullanın. Tekrar dondurulmamalıdır olabilir.
- 120 mg / ml 'de deiyonize su içinde çözülür glikoz. -20 ° C'de 100 ul alikotları Mağazası Tekrar dondurulmamalıdır olabilir.
- Dis150 mM, pH 7.0 deiyonize su adenozin trifosfat (ATP) çözmek. -80 5 ul alikotları Mağaza ° C, çözdürme 8 saat içerisinde tüketilmelidir.
- 600 ul toplam analiz tampon katalaz 10.000 adet glukoz oksidaz ve 156,000 adet eriterek 100x oksijen süpürücü stokta 25 hazırlayın. Pelet katı bir mikrosantrifüj kısaca santrifüjleyin; 0,2 mikron şırınga filtresi ile filtre süpernatant. -80 Deposu 4 de uzun bir süre için 10 ul hacimde ° C, ° C ila bir hafta için.
2. Mikrotubul Kayma Testi, Aynı Gün Çözelti Hazırlama
Deney gününde 2,1-2,6 içinde çözüm hazırlayın. Birlikte uygulama, çözeltiler 2,2-2,6 akış hücresi yıkama sırasında hazırlanabilir. Aksi belirtilmediği sürece, buz üzerinde stok solüsyonları tutmak.
- DTT stok 10 ul (2 mM DTT ile AB) ile AB, tahlil tampon 1 ml hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
- Biyo-BSA tampon, 40 & Mu hazırlayın, Biyotin-BSA stok ve AB bir 1:1 karışımından l. Oda sıcaklığında saklayınız.
- 5.5 ul BSA (AB içinde 1 mg / ml BSA) ile AB 645 ul karıştırma BSA tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
- 3 ul streptavidin stoku (AB içinde 0.5 mg / ml streptavidin) ile AB arasında 57 ul karıştırma, SA tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
- BSA tamponu, 50 ul stok kazein, 15 uM ATP (1 mg / ml α-kazein, 0.8 mg / ml BSA, AB içinde 50 nM ATP) 0.8 ul 200 ul, karıştırma, α-kazein tampon hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayınız.
- 95 ul α-kazein tampon, 2.5 ul glukoz stok, 1 ul 100x oksijen süpürücü karışımı, 1 ul paklitaksel stok, 1 ul 2-merkaptoetanol (βME) karıştırılması, floresan anti-bleach tamponu hazırlayın. Davlumbaz altında βME ekleyin. Hazırlık 1 saat içinde floresan anti-bleach tampon kullanın DİKKAT:. ΒME son derece zehirlidir ve kötü kokuyor. Sadece davlumbaz altında açmak için emin olun. Mağaza şişeışığın olmaması; ışık βME ve photobleaching azaltmak kabiliyetini düşürür.
3. Mikrotubul Gliding Assay
- Bir boşluk gibi bir pipet ile bir şırınga sıkılan vakum yağ kullanarak 24 x 60 mm lamel ve 22 x 22 mm lamel arasında dört akışı şerit, yaklaşık Construct. Her akış şeritte hacmi yaklaşık 10 ul (ölçek izleyen birimler buna göre) olmalıdır.
- Her şeride biyo-BSA tampon 10 ul yıkayın. BSA kat cam yüzeyleri sağlamak için 5 dakika inkübe edin.
- Kızak yüzeyi bloke etmeye devam ederken, biyotin-BSA ücretsiz kaldırmak için 15 ul BSA tamponu ile her kulvarın üç kez yıkayın. Hava kabarcıkları akışı odasına gitmek için izin vermemek için emin olmak, akış odasının ters tarafına tampon kaldırmak için bir Kimwipe veya filtre kağıdı kullanın.
- Her şeride 15 ul SA-tampon yıkayın. 10 dakika, ya da en fazla 2 saat bekleyin. Streptavidin yüzey-bağlı biyotin-BSA bağlanır.
- Kızak yüzeyi bloke etmeye devam ederken serbest SA kaldırmak için 15 ul BSA tamponu ile her kulvarın üç kez yıkayın.
- 15 ul α-kazein tamponu ile her kulvarın yıkayın. α-kazein daha cama spesifik olmayan kinesin bağlayıcı ve mikrotübüller engellenmesine yardımcı olur.
- Α-kazein tamponunda 10 nM kinesin seyreltin ve bu kinesin 15 ul her kulvarın yıkayın - α-kazein çözüm. Yüzeye bağlı streptavidin özellikle bağlamak biotinlenmiş kinesin için 15 dakika (veya bir saat kadar) bekleyin. Kinesin motor alanlarla bind mikrotübüle serbest kalacak.
- Oda sıcaklığında 40 uM α-kazein arabelleğe paklitaksel seyreltin ve ücretsiz kinesin yıkayın ve depolimerizasyon gelen mikrotübüller önlemek için paklitaksel çözümü ile her bir akış odasının ön-yüklemek için bu çözüm 15 ul her kulvarın yıkayın. Soğuk ayrıca mikrotübüller depolymerizes, böylece oda sıcaklıkları ile oda sıcaklığında bu adımları ortaya emin olunçözümleri yeniden.
- Floresan 1 mM ATP ile floresan anti-bleach tampon mikrotübüllerinde 1:100-1:1,000 etiketli seyreltin. Tek şeride 15 ul yıkayın ve 30 dakika içinde gözlemlemek.
4. Veri Toplama
- Floresan mikroskobu kullanarak mikrotübül kayma gözlemleyin; böyle bir ticari veya ev-yapı TIRF ayar olarak tek floroforlar çözebileceklerdirler mikroskop 26 (Şekil 2) gereklidir.
Mikrotübüller sıcaklığına bağlı olarak, yaklaşık 0.5 um / s de alt tabaka üzerinde kinesin motoru tarafından tahrik edilebilir olmalıdır. Mikroskop alanında-of-view 50 mikron ise, bireysel mikrotübüller yaklaşık 100 saniye boyunca görünür olmalıdır. Tek floroforlar daha hızlı 100 sn'den photobleach kalmamak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Lazer uyarma kullanıyorsanız, yaklaşık 3-5 mW güç ayarı uygundur. - Analiz için görüntü dizilerini toplayın. 600 görüntüleri5 Hz (2 dk toplam) iyi çalışıyor. Yeterince uzun mikrotübüller tüm alan-of-view geçiş olduğunu dizilerini kullanın.
5. Veri Analizi
Bir IDL rutin get_lp.pro ektedir. Bu rutin belirli bir görüntü dizisi tüm mikrotübüller kayma dayalı bir sebat uzunluğu değeri döndürür. Ya sizin özel mikroskop kurulum bağlı olarak yoğunluğu parametrelerini değiştirerek, her bir görüntü dizisi bu rutin çalıştırmak veya aşağıdakileri yapın:
- Fluorofor yörüngeleri oluşturmak için bir mikrotübül bağlı her fluorofor izleyin.
- Görüntü dizisi içinde her bir mikrotübül (Şekil 3) için tekrar; genel bir mikrotübül yörünge içine belirli bir mikrotübül üzerinde florofor tüm yörüngeleri birleştirin.
- Yörünge boyunca her noktasına teğet açısı (Şekil 4) hesaplayınVe hesaplama <cos θ s> Denk. (Şekil 5) bir yol uzunluğu s noktalar ile ayrılan her çifti için açı farkı kosinüs ortalaması alınarak 1. Θ s> Eşitlik uydurma <cos tarafından mikrotübül tek mikrotübül veya grup için sebat uzunluğu bulun. 1, ağırlık ortalama hesaplamak için kullanılır çünkü θ s, bağımsız değerlerin sayısı ile uyum içinde ayrı veri noktaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir kayma testte bir anlık Şekil 2 'de gösterilmiştir. İyi bir mikrotübül yoğunluk görüş alanı başına 1-10 mikrotübüller olduğunu; mikrotübüller birbirlerine çapraz olarak önemli ölçüde daha mistracking neden olacaktır. Şekil 2 'de kayma testte 11 mikrotübül yörüngesel bir grafiği Şekil 3' de gösterilmiştir. Tipik yörüngeleri 10 ila 30 mikron uzunluğunda; tek mikrotübül başka kestiği yerlerde bazı yörüngeleri boşluklar var. Bu yörüngeleri analizi atılabilir.
Tek uzun mikrotübül yörünge yörünge boyunca iki pozisyon itibariyle örnek tanjant açısı ile, Şekil 4A 'de gösterilmiştir. Sabit bir mesafe ile ayrılmış tanjant açısı arasındaki fark kalıcılık uzunluğu ile ilgilidir, mikrotübül yörünge boyunca konumunun bir fonksiyonu olarak tanjant açısı Şekil 4B 'de gösterilmiştir.
Teğet açısı verileriBirçok mikrotübül yörüngeleri, belirli bir deneydeki tüm mikrotübüller için tek bir kalıcılık uzunluk hesaplamak için birleştirilir. Şekil 5, Şekil 2'nin kayma tayini için <cos θ s> karşı çevre uzunluğu sn 'lik bir şemasını göstermektedir. Büyük kontur uzunluğu değerleri ise, cos θ çok az değerleri ölçülür; dolayısıyla ortalaması oldukça değişkendir. Ağırlıklı uygun kısa s uygun, daha yakından daha yüksek kesinlik verilerinin uzun s, düşük duyarlıklı veri.
Bu 11 yörüngeleri arasından sebat uzunluğu, 500 ± 40 mikron (ortalama ± standart hata), değeri nispeten kısa mikrotübüller 2 için sebat uzunlukları temsilcisidir. Benzer deneyler 300 ve 1000 mm arasında kalıcılık uzunluklarda bir dizi verir.
Sorun Giderme
Mikrotübüller artışlarla, tamamen eksik iseAdım mikrotübül ase konsantrasyon 3,9-0,5 mg / ml idi. Mikrotübüller hala eksikse, yeniden polimerize mikrotübüller. Emin paklitaksel mikrotübül mikrotübüller depolymerize, aksi takdirde içine seyreltilir her çözüm mevcut olduğundan emin olun.
Mikrotübüller serbestçe çözüm difüzyon ama yüzeye bağlayıcı değilse, adım 3.7 'kinesin konsantrasyonunu artırmak ve kinesin dönüşümsüz mikrotübüller bağlar sağlamak yerine ATP AMP-PNP kullanın. Mikrotübüller hala bağlamak istemiyorsanız, yeni biyotin-BSA tampon ardından yeni streptavidin stok ve tampon yapmak. Son olarak, yeni biotinlenmiş kinesin arındırmak.
Mikrotübüller bağlamak ama hareket yoksa, taze ATP ATP stok solüsyonu değiştirin.
Floroforlar çok hızlı photobleach varsa, aydınlatma yoğunluğunu azaltır. Floroforlar hala çok hızlı photobleach ise, taze stok ile oksijen süpürücü sistemi değiştirin.
Eğer fluorophores, çok loş aydınlatma yoğunluğunu artırır.
Şekil 1. Mikrotübül kayma testin Karikatür. Kinesin enzimler özellikle biotin streptavidin bağı ile lamel bağlanmıştır. Mikrotübüller seyrek organik floroforlar ile etiketlenir. ATP ilavesi üzerine, mikrotübüller kinesin motorlar tarafından itilir. Mikrotübül en önde gelen serbest uç çözelti içinde termal kuvvetleri nedeniyle değişiklik gösterir, bu dalgalanmaları mikrotübül kalıcılık uzunluk hesaplamak için kullanılır. Bu deneyler tarafından tanınacak mikrotübül uzunluğu ölçekli serbest ucunun uzunluğu.
Şekil 2. TIRF mikroskop aracılığıyla alınan bir kayma testi tipik mikroskop anlık. Mikrotübüllerle bules seyrek tek floroforlar ile dekore edilmiştir. Ölçek çubuğu 5 mikron.
Görüntü dizisi, Şekil 3. Mikrotübül yörüngeleri, Şekil 2'de gösterilmiştir. Her mikrotübül yörüngesi birçok tek fluorofor yörüngeleri (ortalama 10) birleştirir ve 100 nm başına bir noktaya inceltilmiş edilmiştir.
Şekil 4. Bir yörünge için teğet açıları hesaplanıyor. Gösterilen örnekte tanjant açısı (θ) ile bir mikrotübül (A) Yörünge. Mikrotübül yörünge boyunca konumunun bir fonksiyonu olarak (B) tanjant açısı. Bu veriler, Denklem kullanılan ortalama açı hesaplamak için kullanılır. 1.
Şekil 5. Teğet açılardan sebat uzunluğu hesaplanıyor. Şekil 3'te gösterilen 11 yörüngeleri için <cos θ s> karşı çevre uzunluğu s (nokta) arsa. (Düz çizgi) Denk sığdır. 1. Mikrotübül Bu grup için, sebat uzunluğu 500 ± 40 mikron. Uzun kontur uzunlukları (10 mikron ya da öylesine üzeri) için, veri nedeniyle sınırlı istatistiklere oldukça değişkendir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebat uzunluk ölçümleri bireysel biyopolimerlerin mekanik özelliklerinin iyi bir karakterizasyon vardır. Bu yazıda, mikrotübül sebat uzunluk ölçüm yöntemi tanımlamışlardır. Girişte belirtildiği gibi, bu yöntem, sadece kolayca kayma deneyi, 3.9, en son adım olarak, reaktiflerin, sıcaklık veya viskozite değiştirmek sureti ile polimerize etmek veya mikrotübüller, adım 1.1, tarafından çeşitli koşullar mikrotübül mekanik özelliklerinin incelenmesi için genişletilmiştir farklı koşullar altında.
Tekniği kendini gerçekleştirmek için hızlı. Stok çözeltileri, vaktinden önce (aşama 1) hazırlandı sonra, bir kayma tahlil deney, tek bir mikroskop lamı üzerinde koşullarda dört varyasyonlar (adım 3.1 'de dört şeritli)' e kadar da dahil olmak üzere 2-3 saat içinde gerçekleştirilebilir. Birçok mikrotübüller her denemede incelenebilir; laboratuarımızda tipik deney koşulu başına 100 mikrotübüller (yaklaşık 10 görüntü sequenc incelemekdizisi başına 10 mikrotübüller) ile her kulvar için es,. Büyük veri kümelerinin analizi aynı şekilde oldukça hızlı. Uygulama ile, 10 görüntü dizileri modern bir PC ile bir öğleden sonra ya da öylesine sebat uzunluğu için analiz edilebilir. Analizinde hız sınırlayıcı adım bireysel floroforlar izlemek zaman; yeni izleme yöntemleri büyük ölçüde 27 Bu hızını artırmak için söz veriyorum.
Yöntem, belirli bir mikrotübül bağlı tek bir florofor izleme gerektirdiğinden, izleme hassas tek foton toplanarak ile sınırlıdır, ve nanometre 22, 25 ölçeğinde olabilir. Birçok floroforlar verileri dahil ederek, hassasiyet daha da geliştirilebilir. Potansiyel olarak, yüksek hassasiyet mikrotübül için, bu tür kuantum noktalar olarak çok parlak floresan nesneler takılarak ulaşılmıştır.
Bireysel yörüngelerin hassas, sebat le belirsizliği oldukça iyi olsa daBu tekniği (tek mikrotübül için ±% 50 ölçekte) ile ölçülen ngths hala önemli olduğunu. Sebat uzunluğu ölçümleri hassas anahtar sınırlaması cos θ ler ortalama yer istatistikleri. L mikrotübül yörünge uzunluğu L / s, okudu gibi noktalar, s artar çiftleri arasındaki kontur uzunluğu gibi, θ ler bağımsız ölçümlerin sayısını azaltır. Mikrotübül yörüngeleri uzunluğunu artırmak sebat uzunluğu ölçümleri geliştirilmiş hassasiyet için izin verecek.
Bu yöntem için ikinci bir sınırlama biotinlenmiş kinesin-1 mikroskop slaytlar kinesin belirli eki için kullanılacak olması gerekliliğidir. Biotinlenmiş kinesin (bizim durumumuzda E. Coli 'dan itibaren) arındırılmalıdır ve sadece raftan satın alınamaz. Bununla birlikte, modifiye edilmiş bir kayma deneyi kullanılarak unbiotinylated akrabaesin 28 kullanılabilir, bu yöntem için uygun olabilir kinesin ağır zincirli protein Sitoiskelet (KR01) dan ticari olarak temin edilebilir. Bu alternatif kinesin kullanmak kayma testi değiştirilmesi herhangi bir şekilde mikrotübül eğilme rijitliği etkilemez olmaz, ve böylece rekombinant kinesin proteini erişimi olmayan gruplara bu yöntemi kullanmak için izin istiyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz yardım protokolü göstermek için Şekil 1 ve Anna Ratliff hazırlamak için Melissa Klocke ederim. Bu çalışma Bilim İlerlemesi için Araştırma Kurumu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
