Avslöja dynamiska processer av material i vätskor använder flytande Cell transmissionselektronmikroskop

Summary

Vi har utvecklat en fristående flytande cell, vilket tillåter avbildning genom vätskor med ett transmissionselektronmikroskop. Dynamiska processer av nanopartiklar i vätskor kan avslöjas i realtid med sub-nanometer upplösning.

Abstract

Den senaste tidens utveckling för in situ transmissionselektronmikroskopi, som tillåter avbildning genom vätskor med hög rumslig upplösning, har lockat stora intressen över forskningsområden i materialvetenskap, fysik, kemi och biologi. Nyckeln möjliggörande teknik är en flytande cell. Vi tillverka flytande celler med tunna visning fönster genom en sekventiell mikrofabrikation, inbegripet kiselnitrid membran nedfall, fotolitografisk mönstring, rån etsning, cell bindning, etc. En flytande cell med måtten på en vanlig TEM rutnät kan passa i en vanlig TEM provhållare . Cirka 100 nanoliter reaktionslösningen laddas i behållarna och cirka 30 picoliters vätska dras in i tittar fönster genom kapillärkraft. Därefter cellen förseglas och laddas i en mikroskop för in situ avbildning. Inne i TEM, går elektronstrålen genom det tunna vätskeskiktet inneslutet mellan två membran kiselnitrid. Dynamisk proccesser av nanopartiklar i vätskor, till exempel kärnbildning och tillväxt av nanokristaller, spridning och montering av nanopartiklar, etc., har avbildats i realtid med sub-nanometer upplösning. Vi har också tillämpat denna metod på andra forskningsområden, t.ex. avbildning proteiner i vatten. Flytande cell TEM är redo att spela en viktig roll i att avslöja dynamiska processer av material i sina arbetsmiljöer. Det kan också medföra stor inverkan på studiet av biologiska processer i sin ursprungliga miljö.

Introduction

Studien av kemiska reaktioner i vätskor i realtid och bildbehandling biologiska material i sin naturliga miljö har betydande intressen över de forskningsområden ^1-5. På grund av den höga rumsliga upplösningen i transmissionselektronmikroskopi (TEM), avbildning genom vätskor med TEM har fått mycket uppmärksamhet ^4,5. Det har dock varit en stor utmaning att bilden vätskeformiga prover med TEM, eftersom den konventionella mikroskop används i högvakuum miljö. Dessutom, vätskeformiga prover måste vara tillräckligt tunn för att medge elektronstrålen att gå igenom. Williamson et al. ⁶ rapporterade att avbildning av elektrokemisk avsättning av Cu kan uppnås med 5 nm upplösning med en elektrokemisk vätska cell drivs i en TEM. De Jonge et al. ¹ kunde bilden biologiska prover genom upprepade mikrometer tjock vatten med användning av en skanning (S) TEM. Den låga kontrast av de biologiska proverna var inteupp som ett problem eftersom guld nanopartiklar användes som markörer för avbildning. Den tjocka vätskeprov var inte ett problem heller eftersom STEM bildåtergivningsläge användes och nanometer upplösning uppnåddes. Vi utvecklade nyligen en fristående flytande cell, vilket gör Real Imaging tid TEM av kolloidala nanopartiklar i vätskor med subnanometer upplösning ^5,7. Dessa nyutvecklade flytande celler, som erbjuder förbättrad upplösning och snabbare TEM avbildning (30 bilder per sekund som inte har uppnåtts genom hög upplösning STEM avbildning), gjort det möjligt att studera kolloidala nanopartiklar dynamik i vätskor. De flytande cellerna passar i en standard TEM hållare och kan användas som vanliga TEM prover. En liten mängd vätska (ca 30 pikoliter) kan undersökas på plats under en förlängd kemisk reaktion. Olika imaging och analytisk (dvs energi-dispersiv röntgenspektroskopi) tekniker kan användas. Eftersom det totala tjocklek fönstret (inklusive membranoch vätskeskiktet) kan styras till 100 nm eller under, har direkt avbildning av biologiska prover (dvs proteiner) i flytande vatten utan guld nanopartiklar markörer också uppnåtts ^8.

Under de senaste två decennierna har det skett betydande framsteg på synteser och tillämpningar av kolloidala nanokristaller ^9-11. Dock är kunskapen om hur nanopartiklar kärnor, växa och interagerar med varandra i vätskor i stort sett empirisk och främst grundar sig på ex situ analyser ^11-13. Vår utveckling av flytande cell TEM är en unik plattform för att studera dynamiska processer av nanopartiklar i vätskor på plats ^5,7,14,15.

Vi tillverka en fristående vätska cell med användning av ultra tunna kiselskivor (100 um) genom en sekventiell mikrofabrikation process. Den innehåller nedfall av kiselnitrid membran, fotolitografisk mönstring, rån etsning, distans nedfall, och cellbindning, är etc. Om 50 nanoliter av reaktionslösningen placeras i en reservoar, som dras in i cellen genom kapillärkraften. Vi fyller den andra behållaren med ytterligare 50 nanoliter av vätskan. Därefter cellen förseglas och laddas i mikroskopet för in situ avbildning. Inne i mikroskop, den vätska mellan två membran kiselnitrid (totalt ca 30 picoliters) kan undersökas. När elektronstrålen passerar genom det tunna vätskeskiktet, kan dynamiska processer av nanopartiklar i vätskor övervakas i realtid. Kärnbildning och tillväxt av nanopartiklar kan induceras genom elektronstrålen i vissa fall ^5,7 eller reaktioner kan utlösas av en extern värmekälla ^14,16. När elektronstrålen skadan är ett problem, bör låg elektronstråle ström (dos) användas.

Eftersom flytande celler tillverkade av kisel mikrofabrikationslaboratorier processer och i stora serier, variationer i membran eller vätskatjocklek mellan individuella flytande celler kan vara smal ^L6. Varje forskare som har grundläggande mikrofabrikation utbildning kan lyckas göra flytande celler. Den vätskehanterande teknik och in situ TEM operation kan också behärskas efter praktiken. Det noteras att förutom att använda membran kiselnitrid som tittar fönster, kan andra material, såsom kiseldioxid, kisel eller kol (inklusive grafen) användas som membran fönster samt ^17-19. Eftersom våra flytande celler använder små visning fönster, dvs 1 x 50 um, ingen utbuktning av membranen har observerats. Och är den flytande cellen också robust att arbeta, dvs under 1% av flytande celler har brutit fönster under experimenten. Dessutom kan tjockleken hos vätskeskiktet också flexibelt avstämmas genom att ändra tjockleken hos det avsatta indium distansorganet. Under provberedning kan en förseglad flytande cell behålla vätskor i flera dagar utan läckage. Den lilla mängd vätska kanundersökas i flera timmar under elektronstrålen, vilket möjliggör studier av en förlängd kemisk reaktion i realtid.

Hittills har vi visualiserade många unika dynamiska processer av nanopartiklar i vätskor, till exempel nanopartiklar tillväxt och koalescens av Pt ^5,15, spridning av nanopartiklar i tunna vätskor ^20,21, tillväxt fluktuationer i Bi nanopartiklar ^14, och tillväxten av Pt ₃ fe nanostavar från block nanopartiklar byggnad ^7, etc. Dessutom har vi tillämpat även denna metod till andra områden, t.ex. avbildning proteiner i flytande vatten med 2,7 nm upplösning ^8. Sammanfattningsvis har vi flytande cell TEM teknik visat sig vara ett mycket värdefullt utveckling för att studera ett brett spektrum av grundläggande frågor inom materialvetenskap, fysik, kemi och biologi. Vi tror att det finns fortfarande stort utrymme för framtida tekniska framsteg och tillämpningar av flytande TEM och det kommer säkert att bli en stor ImpaCT på ett brett spektrum av vetenskaplig forskning.

Protocol

1. Microfabrication av flytande celler

1. Förbered kiselskivor (p-dopade, 100 um i tjocklek och 4 tum i diameter) och rengör skivorna med en vanlig skiva bad rengöringsproceduren.
2. Insättning låg-stress kiselnitridartiklar tunna filmer (20 nm tjocklek) på båda sidor av kiselskivorna genom lågt tryck kemisk ångavsättning (LPCVD) metoden. En anpassad utvecklat recept används för utfällning, vilket möjliggör tillväxt av kisel-rik nitrid _(SiNx, x <4/3).
3. Tillverka nedre chipet (2,6 x 2,6 mm, 3 mm i diameter) med ett siktfönster (1 × 50 um) och den övre spånbrytande (2,6 x 2,6 mm, 3 mm i diameter) med ett siktfönster (1 × 50 um) och två reservoarer (0,6 × 1,2 × 0,1 mm) genom att följa en sekvens av standard tillverkningsprocesser, inklusive fotolitografisk mönstring, plasma etsning av _SiNx membranet (med SF ₆ som aktiv gas), KOH våt etching av den exponerade kiselskivan, etc. Vi använder den vanligaste fotolitografisk process, såsom spinnbeläggning av en fotoresist (positiv fotoresist med centrifugeringsvarvtal av 3.000 varv per minut under 1 min; tjockleken av fotoresisten är ungefär 1 ^ m), UV-exponering under Cr mask av flytande celler, litografisk mönstring med utvecklare och fixare (avjoniserat vatten), etc. Det finns olika val av fotoresisten för spinnbeläggning och utvecklare för mönstring. Och kan de motsvarande parametrarna för processerna varierar också. Eftersom funktionerna i mönstret är relativt stora (hundratals um eller större), är processen lätt ske. KOH-lösning framställs genom upplösning av kaliumhydroxid kraft i avjoniserat vatten med kaliumhydroxid: vatten viktförhållande av 1:2. KOH-lösningen hålles vid 80 ° C under etsning. En etsningshastigheten av 1 um per minut kan uppnås. _SiNx membran är en idealisk skyddsmask för Koh etsning av kisel. Eftersom etching linjer används individuella chip samband med tunna linjer av etsat rån efter KOH etsning. Bitar av flis kan lätt avskiljas från skivan med vassa pincett för efterföljande processer. Inget tärning processen behövs.
4. Deposition indium distans på den platta sidan av den nedre chip. Först gör litografisk mönstring av marker genom att följa liknande process i 1,3. För att bistå hanteringen av flisen, stick enskilda chips (kan vara en bit av flera chips) på en tunn glasskiva med fotoresist och låt den lufttorka under 5 minuter innan spinnbeläggning, UV-exponering, etc. det andra, rengör mönstrade marker genom O ₂ plasma rengöring vid 50 watt under 1 minut, det tredje, insättning indium tunn film med tjockleken 100 nm på chipet med hjälp av en indunstare, tredje, lift-off processen utförs för att generera indium distansorganet.
5. Bindning botten och topp marker tillsammans. Vi ansluter två första kiselnitrid tittar fönster i botten och topp marker i en optisk microscope och applicera ett tryck av ca 0,1 MPa genom användning av en klämma. Det kräver övning för att exakt anpassa fönstren ovanpå varandra. Därefter vätskor celler bakas i en vakuumugn vid 120 ° C under 1 timme. Slutligen samlar vi cellerna och lagra som förberedda celler i en vakuumexsickator för framtida användning.

Hela tillverkningsprocessen visas i figur 1. Vi genomför alla tillverkningsprocesser vid Nanotekniklaboratoriet Lab vid University of California, Berkeley.

2. Framställning av reaktionslösningarna

Vi förbereder reaktionslösningarna för tillväxt Pt ₃ Fe nanostavar som ett exempel. Platina (II) acetylacetonat (20 mg / ml) och järn (II) acetylacetonat (20 mg / ml) löstes i en lösningsmedelsblandning av pentadekan och oleylamin (7:3 vol / vol) eller en blandning av pentadekan, oleylamin, och oljesyra (6:3:1 vol / vol / vol) användes för jämförelse av surfactant effekter.

3. Ladda reaktionslösningarna

1. Ca 50 nl av reaktionslösningen laddas i en av behållarna i ett flytande cell genom att använda en spruta och Teflon nanorör (inköpt från Cole-Parmer, IL). Därefter är den andra reservoaren fylls på samma sätt.
2. Cirka 30 pl av reaktionslösningen dras in i cellen genom kapillärkraften och bildar ett flytande skikt (~ 100 nm) inklämt mellan två membran kiselnitrid i fönstret.
3. Den flytande cellen därefter förseglas med en tunn kopparfilm lock (~ 50 | im TEM rutnät med enkel slits 0,6 mm hål, som köptes från Tedd Pella, Inc.). Vakuum fett applicerades på ena sidan av locket och epoxi användes för att försegla kanten av den flytande cellen. Den totala tjockleken hos den slutliga flytande cell är omkring 250-300 pm.

4. Ladda Flytande celler i TEM

1. En JEOL 3010 TEM drivs vid 300 kV och en FEI monochromated F20 UT Tecnai drivs vid 200 kV används för in situ avbildning.
2. Den flytande cellen laddas i mikroskopet som en standard TEM prov för avbildning.

5. Real Time TEM Imaging

1. Trimma mikroskop till en perfekt Högupplösande TEM avbildning tillstånd, och en stråle strömtäthet av 1-8 x 10 ⁵ A / m ² bibehålls under realtid avbildning.
2. För PTFE-system, kan kärnbildning och tillväxt av nanopartiklar initieras genom gjutning av elektronstrålen på det flytande skiktet.
3. VirtualDub programvara kombinerad med Gatan DigitalMicrograph programvara används för att spela in nanopartiklar dynamik.

Representative Results

Genom att använda flytande metod cell TEM har vi visualiserat lösningen tillväxten av Pt ₃ Fe nanostavar från block nanopartiklar byggnad. Figur 2 visar sekventiella bilder som skildrar tillväxt banan för en Pt ₃ Fe nanorod i olika lösningar förhållanden. Falsk färg processen med Photoshop användes för att markera nanopartiklar.

När den lösningsmedelsblandning av pentadekan och oleylamin (7:3 vol / vol) användes, kan tre distinkta stadier av tillväxt identifieras (Figur 2A). Först är många små nanopartiklar bildas när Pt och Fe prekursorer reduceras med elektronstrålebestrålning. Några av dem växa genom monomer fastsättning, andra genomgår koalescens. Andra är korta nanopartiklar kedjor bildas via nanopaticle interaktioner. För det tredje så formade korta nanopartiklar kedjor fungerar som byggstenar för att bilda relativt lång slingrande nanopartiklar kedjor. När en blandning av pentadekan, Oleylamin, och oljesyra (6:3:1 vol / vol / vol) användes, är slingrande nanopartiklar kedjor bildas först, och sedan nanopartiklar kedjorna räta och bildar en enda kristallina nanostavar inom en kort tidsperiod (Figur 2B).

Sammanfattningsvis har vi visat bildandet av enkristall nanostavar via tillväxt slingrande kedjor polykristallina nanopartiklar från formen riktad nanopartikel fastsättning följt av riktning, orientering och form korrigeringar av byggstenarna. Statistik och kvantifiering av nanopartiklar dynamik från i realtid avbildning är av stor betydelse för förståelse och kontroll av hierarkiska nanomaterial tillväxt och självorganisering för funktionella enheter ^7.

Figur 1.

Figur 2. Tillväxten av Pt ₃ Fe nanostavar i en flytande cell under exponeringen för elektronstrålen. (A) Sekventiella TEM-bilder visar utvecklingen från den initiala kärnbildning och tillväxt i den molekylära prekursorlösningen till ett senare stadium av nanotrådar bildning av formen riktad nanopartiklar fastsättning. En lösningsmedelsblandning av pentadekan och oleylamin (7:3 vol / vol) användes. (B) Bildning av tvinnade Pt ₃ Fe nanostavar och den efterföljande processen riktning. (A) Sekventiell TEM-bilder av tillväxten av en kort Pt ₃ Fe nanorod. (B) sekventiella TEM-bilder visar tillväxten av en lång Pt ₃ Fe nanorod. En lösningsmedelsblandning av pentadekan, oleylamin, och oljesyra (6:3:1 vol / vol / vol) användes. I både (A) och (B), är tiden visas som min: sek, och den initiala tiden är godtyckligt ^7.

Discussion

Samtliga tillverkningsprocesser har gjorts i renrummet där halvledarkomponenter görs.

Innan deponeringen av indium, är O ₂ plasma rengöring av marker som krävs för att undanröja den organiska rester på ytan. Sålunda, kan en hög kvalitet indium spacer uppnås, vilket kan förbättra bindningen av övre och nedre marker och utbytet av läckage fri vätska celler.

Kiselnitriden visning fönster med ultratunna membran av ca 13 nm tjocka är en nyckel för att uppnå hög rumslig upplösning. Vid hantering sådana flytande celler, särskild omsorg för att undvika att bryta membranet under tillverkning samt experiment. Exempelvis pincett med en plan främre rekommenderas. Och kan under membranet reningsprocessen, låg effekt och dos av O ₂ plasma införlivas (dvs. 30 Walt för 20-30 sek). Eftersom tillväxt kinetik kan vara starkt beroende av elektronstrålen valutort densitet, upprätthålla samma elektronstråle strömtäthet medan avbildning är viktigt. Den flytande celler TEM metod inte bara gör det möjligt att studera tillväxten dynamik nanokristaller i lösning i realtid, men också tillåter avslöjande andra dynamiska processer (dvs. spridning av nanopartiklar i vätskor, flytande droppar dynamik osv). Dessutom ger det en lovande väg för att visualisera biologiska processer i den nativa miljön.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Platinum(II) acetylacetonate	Aldrich	523038
Iron(II) acetylacetonate	Aldrich	413402
pentadecane	Aldrich	P3406
oleylamine	Aldrich	O7805
oleic acid	Sigma	O4137
Equipment
TEM	JEOL	JEOL 3010
Monochromated TEM	FEI	F20 UT Tecnai