Summary
我们已经开发了一个自包含的液晶单元，它允许通过使用透射电子显微镜的液体的成像。纳米颗粒在液体中的动态过程，可以亚纳米分辨率的实时显示。
Abstract
最近开发的原位透射电子显微镜，它可以通过液体具有高空间分辨率成像，吸引了显着的利益，整个材料科学，物理学，化学和生物学的研究领域。关键技术是液体电池。我们制作液体细胞与薄的观景窗，通过一个连续的微细加工过程，包括氮化硅膜沉积，光刻构图，晶片蚀刻，细胞接合，等，一种液体的细胞与定期TEM网格的尺寸可以适合在任何标准的TEM样品架。约100纳升反应溶液装入水库，并通过毛细管力约30皮升的液体被吸入的观察窗口。然后，将电池被密封，并加载到原位成像显微镜。加入的TEM，电子束穿过两个氮化硅膜夹着的薄液体层。动态PROC俄塞克的纳米颗粒在液体中，如纳米晶体成核和生长，扩散和组装的纳米粒子，等，已在实时成像亚纳米级的分辨率。这种方法也适用于其他研究领域， 例如 ，成像在水中的蛋白质。液体细胞TEM必将发挥了重要作用，揭示材料的动态过程，在他们的工作环境。它也可能带来高的影响，在他们的母语环境中的生物过程的研究。
Introduction
他们的母语环境的实时性和的成像生物材料在液体中的化学反应的研究一直在研究领域中1-5的重大利益。由于透射电子显微镜（TEM），通过液体TEM成像的空间分辨率高，吸引了很多关注4,5。然而，它一直是图像的液体样品TEM一个巨大的挑战，因为传统的显微镜操作在高真空环境。此外，液体样品必须足够薄，以允许电子束通过。 Williamson 等6报告为5nm的分辨率，使用电化学的液晶单元在TEM中操作，可以实现与电化学沉积的Cu成像。德容格等人 1能够图像serveral的微米厚的水生物样品通过使用扫描透射电子显微镜（S）。对比度低的生物样品的时间是不作为一个问题提出，由于黄金纳米粒子作为标记成像。粘稠液体样品是不是一个问题，因为STEM成像模式和纳米级分辨率达到了。最近，我们开发了一种自足的液晶单元，它允许实时TEM成像在液体中的胶体粒子与亚纳米分辨率5,7。这些新开发的的液体细胞，提供了更好的分辨率和更快的TEM成像（每秒30帧的高分辨率STEM成像尚未实现），使人们有可能在液体中的胶体纳米粒子动力学研究。的液体的细胞适合在一个标准的TEM保持器和可作定期TEM样品。少量的液体（约30皮升），可以检查在原位下一个扩展化学反应。可以应用于各种成像和分析（ 即 ，能量色散型X射线光谱法）技术。由于所述观察窗的总厚度（包括膜和液体层），可以被控制为100纳米或更低，没有金纳米微粒标记的生物样品（ 即蛋白）在液体水的直接成像也已取得8。
在过去的二十年中，已经有显著成绩的合成及应用胶体纳米晶9-11。但是，了解如何纳米粒子成核，生长和相互影响的，在液体中的主要经验，主要是基于易地分析11-13。液体细胞TEM我们的发展提供了一个独特的平台，研究纳米颗粒在液体中的动态过程的原位 5,7,14,15。
我们制作一个自包含的液体电池，使用超薄硅晶片（100微米），由连续的微细加工过程。它包括沉积氮化硅膜，光刻构图，晶片蚀刻，隔离物的沉积，和细胞粘接等约50纳升的反应溶液装入一个蓄水池，通过毛细管力被吸入到单元格。我们填充其它贮存的与另一50纳升的液体。然后，将电池被密封，并加载到原位成像显微镜。显微镜内部，液体夹着两个氮化硅膜（共约30皮升），可以检查。当电子束穿过的薄液体层，可以实时监测的纳米颗粒在液体中的动态过程。可诱导的纳米颗粒的成核和生长，通过电子束5,7或反应在某些情况下，可以由外部加热源14,16触发。当电子束损坏是一个关注，低电子束电流（剂量）应该被使用。
由于液态电池制造的硅微加工工艺和大批量，在膜或液体的变化个体间的液体细胞的厚度L6小型会议室。有基本微细培训的所有研究可以成功地使液体细胞。液体处理技术，并在 TEM 原位操作，也可以掌握后实践。据指出，除了使用的氮化硅膜作为观察窗时，可以使用其它材料，如二氧化硅，硅或碳（包括石墨烯）可以作为膜窗口，以及17日至19日 。由于我们的液体使用小的观景窗， 即 1 x 50微米，没有鼓鼓的膜细胞已被观察到。而且，液晶单元也是强大的操作， 即 ，低于1％的液体细胞已在实验过程中的破窗。此外，液体层的厚度，也可以被灵活地调谐，通过改变沉积的铟间隔件的厚度。一个密封的液体样品制备过程中，电池可以维持几天无泄漏的液体。少量的液体可以几个小时检查下的电子束，它允许实时扩展化学反应的研究。
到目前为止，我们有许多独特的动态过程可视化的纳米颗粒在液体中，例如，Pt纳米粒子的长大和聚合5,15，扩散的纳米粒子在薄的液体20,21，双向纳米粒子的增长波动的14，环 比增长3篇铁纳米棒纳米颗粒积木等，此外，我们也应用这种方法到其他领域， 例如 ，成像在液体水的蛋白质为2.7纳米的分辨率8。总之，我们的液体电池的TEM技术已被证明是一个非常宝贵的发展，在材料科学，物理学，化学和生物学的基本问题的研究范围很广。我们相信未来技术的进步和应用的液体TEM还有很大的空间，它必将是一个高IMPACT在广泛的科研。
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Protocol
1。微细加工的液体池
- 准备的硅晶片（p-掺杂的，厚度（100微米）和4英寸直径）和清洁程序的使用标准的晶片浴清洗晶片。
- 存款低应力氮化硅薄膜（厚度为20nm），通过低压化学汽相淀积（LPCVD）方法在硅晶片的两侧上。用于沉积，它允许生长的富硅氮化物（ 的 SiN x中，x <4/3）的自定义开发的配方。
- 制作底部的芯片（2.6×2.6毫米，3毫米直径）的观看窗口（1×50微米）和最佳的芯片（2.6×2.6毫米，3毫米直径）与观察窗（1×50微米）和两个储层（0.6×1.2×0.1毫米），由标准的制造工艺，包括光刻构图的 SiN x膜的等离子体蚀刻（使用SF 6作为活性气体），KOH湿etchin的序列后克的暴露的硅晶片等我们使用的最常见的光刻工艺，如旋涂的光致抗蚀剂（1分钟纺丝速度为每分钟3000转的正性光致抗蚀剂与光致抗蚀剂的厚度是大约1微米），紫外线曝光下的Cr掩膜的液体的细胞，使用的显影液和定影液（去离子水）等的光刻图案形成有用于旋涂的光致抗蚀剂和显影剂的图案化的不同的选择。而且，相应的参数的过程也可以变化。由于图案的特征是相对大（几百微米或更大），其过程是容易完成。的KOH溶液的制备是用氢氧化钾：水的重量比为1:2将氢氧化钾功率溶解到去离子水中。在蚀刻期间，被保持在80℃的KOH溶液。可以达到每分钟的蚀刻速率为1μm。 的 SiN x膜，是一种理想的防护面具KOH蚀刻硅。由于etching行使用，单独的芯片连接的KOH蚀刻后的蚀刻晶片的细线。枚芯片，可以容易地分离，从晶片，使用尖锐的镊子为后续处理。没有切割过程是必要的。
- 存款铟间隔的平面侧的底部芯片。首先，按照类似的过程在1.3做光刻图案化的芯片。协助处理芯片，坚持独立的芯片（可以是一段几个芯片），使用光致抗蚀剂上的薄板玻璃，让它风干5分钟前旋涂，紫外线的照射等。二，清洁图案芯片O 2等离子体清洗1分钟，在50瓦的，第三，存款铟薄膜的厚度为100nm的芯片上，通过使用蒸发器;第三，剥离工艺进行生成铟隔板的。
- 债券的底部和顶部芯片在一起。我们首先对齐两个氮化硅观景窗下的底部和顶部的芯片的光学microscope和施加约0.1 MPa的压力下，通过使用一个夹子。它需要的实践中，为了精确地对准彼此的顶部上的窗户。随后，液体细胞1小时，在真空烘箱中在120℃被烘烤。最后，我们收集细胞，并存储所制备的细胞，在真空干燥器中，以便将来使用。
是图1中所示的整个制造过程。我们所有的制造工艺进行大学，加州大学伯克利分校的纳米加工实验室。
2。反应溶液的制备
我们准备反应液的生长的Pt 3 Fe的纳米棒作为一个例子。铂（Ⅱ）乙酰丙酮化物（20毫克/毫升）和铁（II），乙酰丙酮（20毫克/毫升），溶解在正十五烷，油胺（7:3体积/体积），十五烷胺，油胺或它们的混合物的溶剂混合物中，并油酸（，6:3:1体积/体积/体积），用于比较surfactan吨的效果。
3。负载反应解决方案
- 约50 NL反应溶液装入一个在液体中的细胞的储层通过使用注射器和特氟隆的碳纳米管（购买从Cole-Parmer公司，IL）。然后，其他的水库中相同的方式填充。
- 通过毛细管力，被吸入到反应溶液中的约30复数细胞和形成的液体层（〜100nm）的2的氮化硅膜之间夹持在观看窗口。
- 使用一个薄的铜盖（〜50μm的TEM网格的单个时隙0.6毫米直径的孔，这是从大于tEDD培拉公司购买），随后被密封的液体细胞。真空润滑脂施加在一个侧盖和环氧树脂用于密封的边缘的液体的细胞。最终的液体单元的总厚度为约250-300微米。
4。将液体池TEM
- 工作在300千伏和FEI一个JEOL 3010透射电子显微镜单色F20 UT TEC奈为200 kV，用于原位成像。
- 装入的液体细胞作为一个标准的TEM样品的显微镜成像。
5。实时TEM成像
- 调整显微镜以一个完美的高分辨率TEM成像条件，和一个电子束电流密度为1-8×10 5 A / m 2的过程中保持的实时成像。
- 对PTFE系统，通过浇铸的液体层上的电子束，可以启动的纳米颗粒的成核和生长。
- 的VirtualDub软件结合与加坦DigitalMicrograph软件被用来记录的纳米粒子动力学。
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Representative Results
通过使用液晶单元TEM方法，我们已可视化的溶液生长的Pt 3铁纳米棒从纳米粒子积木图2示出描绘在不同的解决方案的情况下的Pt 3铁纳米棒的成长轨迹的顺序图像。假着色工艺使用Photoshop突出的纳米粒子。
当十五碳烷，油胺（7:3体积/体积）的溶剂混合物中，使用了三个不同的阶段的增长可以被识别（ 图2A）。首先，许多小的纳米粒子的形成，通过电子束照射时，Pt和Fe前体减少。他们中的一些成长单体附件;进行合并。其次，短纳米粒子链的形成，通过nanopaticle互动。第三，形成的短纳米粒子链作为构建模块，以形成相对漫长曲折的纳米粒子链。当的OLE十五烷，的混合物基胺，和油酸（，6:3:1体积/体积/体积）使用，缠绕的纳米粒子链形成的第一，然后在一个短的时间内（ 图2B）的纳米粒子链拉直和形成单晶纳米棒。
总之，我们已经形成单晶纳米棒形状的纳米粒子附着拉直，方向和形状的积木更正绕组多晶纳米粒子链的增长。统计和量化纳米粒子动态实时成像都具有重大意义的理解和控制的分层纳米材料生长和自组装功能器件的7。
图1。
图2的Pt 3铁纳米棒的生长在电子束曝光过程中的液体细胞。 （A）的顺序的TEM图像示出了从最初的成核和生长在其分子的前体溶液形成的纳米线形状的纳米粒子附着到稍后阶段演化。十五碳烷，油胺（7:3体积/体积）的溶剂混合物中使用。 （B）3篇扭曲的铁纳米棒的形成和随后的矫直过程。 （一）顺序TEM图像生长短的Pt 3 Fe的纳米棒。 （二）顺序TEM图像示出生长长的Pt 3 Fe的纳米棒。甲，十五烷胺，油胺，和油酸（，6:3:1体积/体积/体积）的混合溶剂中使用。在两者（A）和（B）中，时间显示为分钟：秒，以及初始时间是任意的7。
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Discussion
洁净室中的半导体器件，其中，已经完成了所有的制造工序。
铟的沉积之前，O 2等离子体清洗的筹码是必要的，以消除表面上的有机残基。因此，高品质的铟间隔件可以实现，从而可以提高顶部和底部芯片接合和泄漏游离液体的细胞的产率。
约13 nm厚的超薄膜硅氮化物观景窗是一键实现高空间分辨率。处理这种液体细胞时，需要特别小心，以避免破坏膜在制造过程中以及实验。例如，镊子配有平面前的建议。而且，在膜的清洗工艺，低功耗和剂量的O 2等离子体可以注册成立（ 如沃尔特为20-30秒，30）。 ，由于生长动力学可以是高度依赖于电子束柯伦吨密度，保持相同的电子束电流密度的同时，成像是重要。液体细胞TEM方法不仅可以实时的纳米晶体在溶液中生长动力学的研究，但也允许透露其他的动态过程（ 即扩散的纳米颗粒在液体中，液滴动态等）。此外，它提供了一个有希望的途径，以可视化在本地环境中的生物过程。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
EM液细胞的早期发展过程中，郑教授A.感谢保罗Alivisatos和乌尔里希·达门博士的有益讨论。她是美国能源部办公室科学的早期职业研究计划的支持表示感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Platinum(II) acetylacetonate | Aldrich | 523038 | |
| Iron(II) acetylacetonate | Aldrich | 413402 | |
| pentadecane | Aldrich | P3406 | |
| oleylamine | Aldrich | O7805 | |
| oleic acid | Sigma | O4137 | |
| Equipment | |||
| TEM | JEOL | JEOL 3010 | |
| Monochromated TEM | FEI | F20 UT Tecnai | |
References
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nature Nanotechnology. 6, 695-704 (2011).
- Sun, Y. G. Watching nanoparticle kinetics in liquid. Mater. Today. 15, 140-147 (2012).
- Tao, F., Salmeron, M. In Situ Studies of Chemistry and Structure of Materials in Reactive Environments. Science. 331, 171-174 (2011).
- de Jonge, N., Poirier-Demers, N., Demers, H., Peckys, D. B., Drouin, D. Nanometerresolution electron microscopy through micrometers-thick water layers. Ultramicroscopy. 110, 1114-1119 (2010).
- Zheng, H., et al. Observation of Single Colloidal Platinum Nanocrystal Growth Trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nature Materials. 2, 532-536 (2003).
- Liao, H. -G., Cui, L., Whitelam, S. Real-Time Imaging of Pt3Fe Nanorod Growth in Solution. Science. 336, 1011-1014 (2012).
- Mirsaidov, U. M., Zheng, H., Casana, Y., Matsudaira, P. Imaging Protein Structure in Water at 2.7 nm Resolution by Transmission Electron Microscopy. Biophysical Journal. 102, L15-L17 (2012).
- Yin, Y. D., et al. Formation of hollow nanocrystals through the nanoscale Kirkendall Effect. Science. 304, 711-714 (2004).
- Kan, S., Mokari, T., Rothenberg, E., Banin, U. Synthesis and size-dependent properties of zinc-blende semiconductor quantum rods. Nature Materials. 2, 155-158 (1038).
- Peng, X. G., et al. Shape control of CdSe nanocrystals. Nature. 404, 59-61 (2000).
- Skrabalak, S. E., et al. Gold Nanocages: Synthesis, Properties, and Applications. Accounts of Chemical Research. 41, 1587-1595 (2008).
- Zhang, Q. B., Xie, J. P., Yang, J. H., Lee, J. Y. Monodisperse Icosahedral Ag, Au, and Pd Nanoparticles: Size Control Strategy and Superlattice Formation. Acs Nano. 3, 139-148 (2009).
- Xin, H. L., Zheng, H. In Situ Observation of Oscillatory Growth of Bismuth Nanoparticles. Nano Letters. 12, 1470-1474 (2012).
- Murray, C. B. Watching Nanocrystals Grow. Science. 324, 1276-1277 (2009).
- Xin, H. L., et al. Revealing Correlation of Valence State with Nanoporous Structure in Cobalt Catalyst Nanoparticles by In Situ Environmental TEM. ACS Nano. 6, 4241-4247 (2012).
- Daulton, T. L., Little, B. J., Lowe, K., Jones-Meehan, J. In situ environmental celltransmission electron microscopy study of microbial reduction of chromium(VI) using electron energy loss spectroscopy. Microscopy and Microanalysis. 7, 470-485 (2001).
- Mohanty, N., Fahrenholtz, M., Nagaraja, A., Boyle, D., Berry, V. Impermeable Graphenic Encasement of Bacteria. Nano Letters. 11, 1270-1275 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-Resolution EM of Colloidal Nanocrystal Growth Using Graphene Liquid Cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Zheng, H., Claridge, S. A., Minor, A. M., Alivisatos, A. P., Dahmen, U. Nanocrystal Diffusion in a Liquid Thin Film Observed by in Situ Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 9, 2460-2465 (2009).
- Park, J., et al. Direct Observation of Nanoparticle Superlattice Formation by Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy. Acs Nano. 6, 2078-2085 (2012).
