Summary
Bu doğal sularda da uygulanabilir magnetotactic bakteriler (MTB) toplamak için bir yöntem göstermektedir. MTB izole ve bakteri doğal manyetizma yararlanır nispeten basit bir kurulumu kullanarak sediment örneklerinin zenginleştirilebilir. İzole MTB sonra ışık ve elektron mikroskobu kullanarak hem ayrıntılı olarak incelenebilir.
Abstract
Magnetotactic bakteriler (MTB) ilk başta Massachusetts (ABD) tuzlu bataklıklar toplanan sediment örnekleri 1975 1 tarif edilmiştir sucul mikroorganizmalardır. O zamandan beri MTB tüm dünyada 2 yerinden tabakalı su ve sediman-sütunlarında tespit edilmiştir. Her MTB ile ortak bir özelliği, hücre içi, zar bağlı manyetik magnetit nanokristaller (Fe 3 O 4) ve / veya greigite (Fe 3 S 4) ya da her ikisi de 3, 4, magnetosomes, yer almasıdır. Güney yarımkürede genellikle bir mıknatıs 3,5 kuzey ucunda çekiliyor ise Kuzey yarımkürede, MTB tipik bir bar mıknatısın güney ucuna çekilir. Çevresel numunelerden MTB izole etmek için çalışırken bu özellik kullanılabilir.
MTB zenginleştirmek için en yaygın yollarından biri, bir doğal kaynak sediment ve su toplamak için net bir plastik kap kullanmaktırbir tatlı su birikintisi gibi. Kuzey yarımkürede, bar mıknatısın güney ucunda sadece sediman-su ara sediman Yukarıdaki kabın dışına karşı yerleştirilir. Bir süre sonra, bakteri bir pipet ile mıknatıs yakınında kabın içine çıkarılabilir ve daha sonra bir kılcal yarış pisti 6 ve bir mıknatıs kullanılarak daha da zenginleştirilmiş. Bir kez, zenginleştirilmiş bakteri asılı damla yöntemi kullanarak bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilebilir ve bir ışık mikroskobu gözlenen veya bir bakır ızgara üzerine yatırılır ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak gözlenmiştir.
Bu yöntemi kullanarak, izole MTB mikroskobik gibi yüzme gibi özelliklerini belirlemek için incelenebilir hücreleri, manyetik kristallerin şekli, magnetosomes sayısı, her hücrede magnetosome zincirlerinin sayısı, kompozisyonu flagella, hücre morfolojisi davranışları, tipi ve sayısı nanomineral kristaller ve intrasellüler vakuoller varlığı.
Protocol
1. MTB Koleksiyonu
- Magnetotactic bakteri toplamak için bir tatlı su sitede (MTB) karar verirken, genellikle yumuşak bir çamurlu tortu tabakası olan bir gölet veya yavaş hareket akışı ile başlamak en iyisidir. Bu gösteri biz Columbus Ohio State Üniversitesi (OSU), Ohio (ABD) kampüsünde Olentangy Nehri kenarında bir örnek toplanmıştır. Bu bizim gösteri için elverişli bir konumda iken, burada açıklanan protokol herhangi bir sucul yere uygulanabilir. Bu protokolde kullanılan malzemeler Tablo 1'de bulunabilir. Su derinliği 10 ile 100 cm arasında bir konuma bulun. Böyle bir yerde, sen sediment açık, vida-top konteyner kullanarak üst-en tabaka toplamak gerekir. O bir buçuk katı kadar üçte biri ve tortu su ile geri kalan hacim ile doldurulana kadar kap içine tortu su ve kepçe. Su ile dolana kadar daldırılmış bir kapta muhafaza edin ve sonra sıkıca konteyner w kapITH onun vida-üst kapak. Bu tortu karıştırmak için gerekli değildir. Bir havlu ile kurulayın kabın dışını silin ve sonra laboratuvara numune alır. Bu sizin laboratuar geri örnek acele gerekmez. Biz laboratuvar onları geri getirmeden önce birkaç gün boyunca alanında plastik kaplarda MTB örnekleri bıraktım. Eğer alanında gölge ve serin bir yerde saklayın örnekleri olarak MTB sürece birkaç hafta ay için geçerli olmalı.
- ÖRNEK laboratuarda sonra, kap gevşetmek ve buharlaşma miktarını azaltmak için konteyner kaplama bırakın. Karanlık bir odada, çekmece içinde oda sıcaklığında saklayın konteyner ya da tamamen alüminyum folyo ile kap kapağı. Tortu ve ince parçacıklar tamamen bir veya birkaç gün birkaç saat boyunca rahatsız edilmeden örnek bırakarak kabın dibine yerleşmek için izin verin. Bu tortu karıştırmak için gerekli değildir, MTB kesintisiz bir ortamı tercih ederler. Plastik kabın açık duvarlarEğer parçacıklar altına yerleşmiş olduğunu doğrulamanızı sağlar. Numunenin bağlı MTB aylarca örnek hayatta kalabilir.
2. MTB İzolasyon
- Eğer yaklaşık 1 cm sediment-su ara (Şekil 1A) Yukarıdaki plastik kabın yüzüne MTB, yer mıknatıslar yalıtmak için hazır olduğunuzda. Kabın dibinde tortu rahatsız etmemek için dikkatli olun. Karşı tarafında (Şekil 1A) üzerinde konteyner ve başka bir bar mıknatısın kuzey tarafında bir tarafında bir çubuk mıknatısın güney kutbu yerleştirin. Hemen hemen her mıknatıs bu tür bir manyetik karıştırma çubuğu ya da büyük soğutma mıknatıs olarak, kullanılabilir. Her şey tortu-su ara yukarıda doğru yükseklikte mıknatısları desteklemek için kullanılabilir. Bir karton ya da plastik kutu üst mıknatıs dayanma en iyi, ancak, aynı zamanda mıknatıs plastik kabın dış tarafına yapıştırılabilir olduğunu tespit ettik. Birkaç 30 dk bekleyinbakteriler için saat mıknatıs yüzmek.
- Dikkatle güney kutbu çubuk mıknatıs (Kuzey yarımkürede toplanan numuneler için) konumunu yakın konteyner (Şekil 1A) içindeki suyu toplamak için steril bir pipet kullanın. Bu su güney kutup çubuk mıknatıs için çekici olmuştur MTB içermelidir. Daha sonra, bir kapiler yarış pisti daha fazla MTB zenginleştirmek için kullanılabilir.
3. MTB Racetrack
- Magnetotactic bakteriler ile örnek zenginleştirmek için, kılcal bir yarış pisti (Şekiller 1B ve 1C) gereklidir. Bu berrak plastik kap gelen hücreler izole önce yapılmış olması gerekir.
- Bir yarış pisti yapmak için 5,75 inç (146 mm) cam Pasteur pipeti kullanın. Pipet üst kesmek için elmas kalem veya dosyayı kullanın, pipet uzunluğu önemli değildir, ancak bu suyun yaklaşık 1-2 ml içeren gerekir. Sonra, ucu eritmek için bir Bunsen beki kullanın, böylece(Şekil 1C) sızdırmaz olur. Elde edilen pipet bir açık uç ve bir kapalı ucu sahip olmalıdır.
- Bu pistlerde birkaç sonra otoklav olun. Ayrıca, pamuk ve birkaç uzun metal iğnelerin otoklavlamayın gerekir.
- Süzülmüş bir enjektöre bağlanmış uzun metal iğne kullanarak bir otoklavlanmış hipodroma Şekil 1A gösterilen sediment su arabiriminin yanında toplanan filtrelenmiş su numunesinin, ekleyin. Filtre gözenek boyutu su pisliği ve kirletici maddeleri ortadan kaldırmak için 0.22 mm olmalıdır. Bu kılcal cam içinde hiçbir hava kabarcığı olduğunu kesinlikle emin olmak için önemlidir.
- Steril pamuk (Şekil 1B) ile pist alt takın. Uzaklıkta mühürlü ucu (Şekil 1C) 1 cm - 0.5 o yüzden yarış pisti mühürlü sonuna doğru pamuk itmek için metal iğne kullanın.
- Steril bir pipet kullanarak, örnek MTB içeren su (bölüm 2.2) ekleyin rhazırlanmış bir MTB yarış pisti (Şekil 1B) eservoir (açık uçlu).
4. MTB Zenginleştirme
- Racetrack örnek sıvı ile doldurulduktan sonra, yatay bir yüzey üzerinde yan yatıyordu (örneğin, bir benchtop) ve yarış pisti kapalı ucu (Şekil 1B yanında (Kuzey yarımkürede) bir çubuk mıknatısın güney kutbu yerleştirin ve 1C).
- Pamuk yoluyla göç MTB için 5 ila 30 dakika bekleyin. Sonra pistin ucuna yakın sıvı toplamak gerekir. Çok uzun bekliyorum kılcal ucu gibi diğer hareketli bakteri gibi kirleticileri, tanıtabilirsiniz. İsteğe bağlı olarak, pistin ucu görüntülemek ve MTB Racetrack'in ucunda toplamak izlemek için ışık mikroskobu kullanabilirsiniz. Bu onu pamuk yumağı içinden geçirmek MTB ne kadar sürer belirlemek için izin verir.
- Yavaşça pamuk tapa yakınındaki küçük bir çizik yapıp pistin sonuna koparmak için elmas bıçak kullanın. <li> pistin ucundan sıvı kaldırmak için dar bir iğne (25 ya da 27 gauge) ile 1 ml şırınga kullanın. Bu, sıvı numune hemen zenginleştirilmiş MTB içermelidir.
5. Işık Mikroskobu ile MTB Gözlem
- Bir lamel üzerine zenginleştirilmiş MTB örnek bir damla (10-20 ul) yerleştirin.
- Hızla yüzden bırak şimdi aşağı bakacak ve lamel asılı olduğu üzerine lamel çevirin.
- Bir cam slayt üzerine oturan bir o-ring üzerine lamel yerleştirin. O-ring sonra biraz daha küçük bir çapı lamel (; Şekil 2, yaklaşık 1 cm) sahip olmalıdır.
- Bir ışık mikroskobu sahneye bu asılı damla yerleştirin ve açılan bir kenarına odaklanmak. Ama asılı damla yöntemi (Şekil 2) için kullanmak zordur yağ, gerekmez; çoğu yüksek sayısal açıklık (örneğin, 0.93 NA) çünkü bir 60X kuru hedefi çok iyi çalışıyor.
- Asılı d bir çubuk mıknatıs yakın güney ucunda yerleştirinrop ve MTB mıknatıs (Şekil 3) en yakın damla kenarına doğru göç etmeye başlayacaktır. Birkaç dakika içinde çok sayıda MTB damla kenar (Şekil 3) olmalıdır. Bakteri mıknatıs kutup geri tarafından manyetik olduğu kendine kanıtlamak ve daha sonra bakteri ters yönde yüzmek dikkate alınmalıdır.
6. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) tarafından MTB Gözlem
- Bakır ızgara üzerine zenginleştirilmiş MTB bir damla (~ 20 ul) yerleştirin ve bakteriler 10 dakika için yerleşmek için izin.
- Temiz filtre kağıt parçası ile fazla su Wick.
- İsteğe bağlı olarak, ızgara olumsuz% 2 uranil asetat,% 2 fosfotungstik asit, pH 7.2,% 2.5 ya da sodyum molibdat 7, 8, 9 ile boyanmış olabilir. Bu, hemen zenginleştirilmiş MTB ile ızgara inkübe sonra leke üzerine bir damla bakır ızgara yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Negatif leke ile ızgara inkübe kez st bağlı olarak değişirain kullanılan ve sonra temiz filtre bir parça kağıt ile sıvı kapalı fitil.
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM, Şekil 4) kullanılarak MTB gözlemleyin. Iş Burada anlatılan MTB Formvar stabilize ve karbon kaplı 200 mesh bakır ızgaralar (Ted Pella # 01800) adsorbe edilmiştir. Şebekelerini 10 dk için hücre süspansiyonu damla karbon tarafı aşağıya doğru yerleştirildi, ardından hemen 30 saniye süreyle bir su damlası üzerinde ızgara yerleştirilmesi ile bir kez yıkanmıştır. Boyanması için, ızgaralar saniye 5 dakika için 30 için% 2 uranil asetat (Ted Pella # 19481), bir damla üzerine yerleştirilir ve daha sonra tamamen filtre kağıdı parçası kullanarak kurutuldu. Izgaraları TEM 200KV yüksek açılı halkasal karanlık alan KÖK kullanarak 80kV veya FEI Tecnai F20 ya hiç bir FEI Tecnai Ruh kullanılarak analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir mıknatıs çevresel örneklerde (Şekil 1A) bulunan magnetotactic bakteriler (MTB) izole etmek için kullanılan etkili bir araçtır. Bir kılcal racetrack (Şekil 1B) aynı zamanda çevresel numune içinde bulunan sigara magnetotactic mikroorganizmalar ayrılabilir bir pamuk yumağı içinden onları çekmek için MTB manyetik özelliklerini kullanır.
Şekil 1. Sediman ve su numunesi içeren şeffaf plastik şişe Columbus, Ohio (ABD) Olentangy River toplanmıştır. Şişe, yaklaşık bir buçuk tortu, bir yarı-su içerir. Bir mıknatısın güney ucunu (A) birkaç saat için sediman üzerinde yaklaşık 1 cm kadar yerleştirilir. Kap içine üzerinde mıknatıs yakın alınan bir sıvı bazı çıkardıktan sonra, bir kapiler r içine yerleştiriliracetrack nerede bir çubuk mıknatıs (B) Güney sonuna doğru bir pamuk yumağı (ok) yoluyla MTB yüzmek. Pamuk örnek göstererek kılcal pistin görünümü kadar yakın bir, filtrelenmiş sıvı, kılcal boru ve çubuk mıknatıs (C) güneyinde sonu kapalı ucu.
MTB Hipodromun zenginleştirilmiş sonra Şekil 2., Küçük bir damla sonra baş aşağı çevirdi ve bir slayt üzerine oturan bir o-ring üzerine yerleştirilen bir lamel, yerleştirilebilir. Bu slayt o-ring-lamel sandviç ışık mikroskop sahne üzerine yerleştirilen ve bir 60X kuru hedefi (yağ lensler asılı damla kullanmak sakıncalı) kullanılarak izlenebilir.
Şekil 3. MTB yüzme Aydınlık alan mikroskobu görüntüsü (inceuzun oklar) ve bar mıknatısın güney kutbu yanında asılı damla (kısa oklar) kenarında topluyor.
Şekil 4. Çevresel bir sediment örneği zenginleştirilmiş tek magnetotactic bakterinin Transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü. Hücre (spirillum) ve magnetosomes morfolojisi, tek bir kamçı ile kolaylıkla görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Magnetotactic bakteriler mutlaka her sucul ortamda 8 bulunmayan ancak ortaya çıktığında, onlar 100 sipariş üzerine bulunabilir - mililitrede 2 başına 1.000 hücreleri. Optik mikroskop kullanılarak MTB gözlemlemek için, yaklaşık 50 bakteri / numunenin 8 ml gerekir. Sizin örnek hiç veya az MTB varsa, o zaman ya da örnekleri toplamak veya sonraki bölümde ele tekniklerden birini veya birkaçını deneyin gerekir yeni bir çevresel sitesi seçmeniz gerekecektir.
Öncelikle, büyük bir plastik küvet 8 kullanarak çevreden daha fazla posa toplama denemelisiniz. Kültüre edilemeyen MTB çok sayıda ihtiyaç vardır, bu özellikle yararlıdır. Çevresel örnek bağlı olarak, hemen numune toplama sonra en az 50 bakteri / ml 'lik bir konsantrasyon sahip olan MTB örnekleri izole etmek mümkün olmayabilir. Bu nedenle, la için geri çevresel numune getirmekboratory, bir çubuk mıknatıs kullanılarak MTB izole etmek denemeden önce laboratuar şartlarında gelmesini örnek beklemek yararlı olabilir. Bu alıştırma periyodundan bakteriyel topluluk MTB yüksek konsantrasyonlarda giden kültür olgun ve yeniden doldurmak için izin verir. Genellikle daha konsantre MTB örnekleri üretir başka basit bir teknik daha uzun bir süre (örneğin, birkaç gün) için numune kabı (Şekil 1A) tarafında çubuk mıknatısı bırakmaktır. Bu mıknatıs göç etmeye daha MTB zaman tanımak gerekir. Bir son teknik yararlı olabilir, bir örnek her bir yarış pistindeki MTB birleştirmek sonra, aynı anda birkaç koşu (Şekil 1B) kullanmak ve. Eğer bir yarış pisti ya da zenginleştirilmiş örnek çok kirleten mikroorganizmalar (örneğin, non-MTB) varsa, onlar pamuk plu ile yüzmek gibi MTB gözlemlemek için bir ışık mikroskobu altında hipodroma yerleştirebilirsiniz bir sorun olduğunu düşünüyorsanızg ve ucu içine. Bu kontamine mikroorganizmalar da pamuk yumağı içinden geliyor ve ne zaman zenginleştirme işlemini durdurmak için, belirlemenize izin verir.
Biz MTB yalıtmak için daha sofistike yollar olduğunu belirtelim, ancak bu yöntemlerin daha özel ekipman kullanımı gerektirir. Bir örnek tatlı su sedimanları 10, 11 MTB izole etmek için bir manyetik bobinin kullanılması yerine, bir çubuk mıknatıs ve özelleştirilmiş bir cam kap içerir. Burada açıklanan protokol çevresel sitesi MTB içerip içermediğini belirlemek için ucuz ve etkili bir yöntemi temsil eder. Bu izolasyon ve zenginleşmesi protokolü mikrobiyoloji öğrencileri MTB yüksek verim elde edilebilir, böylece "ince ayar" kolay ana ve sağlayacak kadar basittir. MTB izole edildikten sonra, bu tür floresan in-situ hibridizasyon gibi diğer analizler, 16S toplum analizi, enerji saçılım spektrometresi (EDS), TEM, optik mikroskopi için dizileme rRNAve manyetik ölçüm MTB 12, 13, 14 üzerinde gerçekleştirilebilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
ABD Ulusal Bilim Vakfı Doğu Asya ve Pasifik Yaz Enstitüleri;; Amerika'da Araştırma Bursu Programı Jeoloji Derneği'nin ve Lisansüstü Araştırma ve Burs Mezunlar Hibeler Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı (EAR-0920299 ve EAR-0745808) hibe tarafından desteklenen Ohio Eyalet Üniversitesi. Biz onların anlayışlı yorum yapmak için editör ve iki anonim teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
- Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
- Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
- Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
- Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
- Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
- Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
- Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
- Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
- Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
- Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
- Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).
