Summary
我々は、天然水に適用できる磁性細菌（MTB）を収集する方法を示しています。 MTBを単離して、細菌の自然な磁気を利用しています比較的簡単なセットアップを使用して堆積物試料から濃縮することができます。孤立したMTBは、次に光学および電子顕微鏡の両方を用いて詳細に調べることができます。
Abstract
走磁性細菌（MTB）は、最初、特にマサチューセッツ州（米国）の塩性湿地に収集する堆積物試料から1975年1に記載された水生微生物である。それ以来、MTBは世界2世界中から層状水と土砂の列が発見されました。すべてのマウンテンバイクに共通する一つの特徴は、マグネタイト（Fe 3 O 4）および/ またはグレイジャイト鉄（Fe 3 S 4）、またはその両方3、4の細胞内、膜結合型磁気ナノ結晶であるmagnetosomesを含むことである。南半球では、それらは通常、磁石3,5の北の端に惹かれながら、北半球では、MTBは、典型的には、棒磁石の南の端に魅了されています。環境試料からMTBを隔離しようとするときに、このプロパティを利用することができる。
MTBを豊かにするための最も一般的な方法の1つは、天然源から堆積物と水を収集するために透明なプラスチック容器を使用することです淡水池など。北半球では、棒磁石の南の端は、堆積物 - 水界面でちょうど堆積物の上に容器の外側に接して配置されています。しばらくすると、細菌がピペットを用いて磁石の近くに容器内から削除することができ、その後キャピラリー競馬6と磁石を使用してさらに充実。かつて豊かに、細菌はハンギングドロップ法を用いた顕微鏡スライド上に配置し、光学顕微鏡で観察または銅グリッド上に堆積され、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて観察することができます。
この方法を使用して、孤立したMTBは、行動、鞭毛の種類と数、細胞の細胞形態、磁性結晶の形状、magnetosomes数、各セル内magnetosome鎖の数の組成を水泳などの特性を決定するために顕微鏡的に研究することができるnanomineral結晶、細胞内の液胞が存在する。
Protocol
1。 MTBのコレクション
- 磁性細菌を収集する淡水サイト（MTB）を決定する際に、それが柔らかい泥質堆積物の層を有する池や動きの遅い流れから開始するのが最適であることが多い。このデモでは、コロンバスのオハイオ州立大学（OSU）、オハイオ州（アメリカ）のキャンパス内にOlentangy川の端でサンプルを収集した。これは私たちのデモのために便利な場所でしたが、ここで説明されたプロトコルは任意の水生場所に適用可能である。このプロトコルで使用される材料は、 表1に記載されています。水の深さは10〜100センチメートルである場所を探します。そのような場所では、土砂クリア、スクリュートップコンテナを使用しての最上部層を収集する必要があります。それは半分土砂と水で残量3分の1で満たされるまでコンテナに土砂と水をすくう。それが水で満たされるまで水没容器をそのままにして、しっかりと容器wを締めくくるi番目のそのねじぶた。これは、堆積物を混合する必要はありません。タオルで乾燥した容器の外側を拭いてから、研究室にサンプルを取る。それはあなたの研究室に戻ってサンプルを急いでする必要はありません。我々は、我々の研究室に戻し持ち込む前に数日間フィールドにプラスチック容器にMTBのサンプルを残してきた。あなたがフィールドに涼しい、日陰でサンプルを格納するようにMTBは限りヶ月に数週間のための実行可能でなければなりません。
- サンプルでは、あなたの研究室に入ったら、キャップを緩め、それが蒸発量を削減するための容器をカバーしておきます。暗い部屋で、引き出しの中に室温で容器を保管し、または完全にアルミホイルで容器をカバーしています。堆積物と微粒子が完全に数時間〜数日のために邪魔されずにサンプルを残すことによって、容器の底に沈殿することができます。それは堆積物を混合する必要はありませんが、MTBは邪魔されない環境を好む。プラスチック容器の透明な壁あなたは、粒子が底に沈殿していることを確認することができます。あなたのサンプルによって、MTBは何ヶ月も試料中に生き続けることができます。
2。 MTBのアイソレーション
- あなたが約1cm堆積物-水界面（ 図1A）上記プラスチック容器の両側にMTB、場所の磁石を分離する準備ができたら。容器の底に沈殿を乱さないように注意してください。コンテナと反対側のもう1つの棒磁石の北側（ 図1A）の片側に棒磁石のS極を配置します。ほぼすべての磁石は、磁気攪拌棒や大型冷蔵庫のマグネットを使用することができる。何は、堆積物 - 水界面上に正しい高さに磁石をサポートするために使用することができます。我々は、段ボールやプラスチック製の箱の上に磁石を休んでいることが最善であることがわかりました、しかし、磁石は、プラスチック容器の外側にテープで固定されていることができます。いくつかに30分待って磁石に泳ぐ細菌のための時間。
- 慎重に南極の棒磁石の位置の近くにコンテナ（ 図1A）、（北半球で収集されたサンプルのための）内側から水を集めるために滅菌ピペットを使用しています。この水は、南極の棒磁石に引き寄せされたMTBを含める必要があります。次に、キャピラリー競馬場は、さらにMTBを豊かにするために使用されるべきである。
3。 MTBの競馬場
- 走磁性細菌とサンプルを豊かにするために、毛細管競馬場が必要である（ 図1B及び1C）。これらはクリアプラスチック容器から細胞を単離する前に行う必要があります。
- 競馬場を作るために5.75インチ（146ミリメートル）のガラスパスツールピペットを使用しています。ピペットの上部をカットするダイヤモンドペンまたはファイルを使用して、ピペットの長さは重要ではありませんが、それは水の約1〜2 mlを含んでいることができるはずです。次に、先端を溶かすためにブンゼンバーナーを使用するようにそれは（ 図1C）密封されたとなります。結果のピペットは、開放端と密封端を持っている必要があります。
- これらの競馬場のいくつかの後、オートクレーブを行います。また、綿、いくつかの長い金属針をオートクレーブする必要があります。
- ろ過シリンジに取り付け長い金属針を用いてオートクレーブした競馬場に、 図1Aに示すように土砂と水の界面付近から採取し、ろ過した試料水を追加します。フィルターの孔径は、水から破片や汚染物質を除去するために0.22ミリメートルである必要があります。ガラスキャピラリー内に気泡がないことを必ず確認することが重要です。
- 滅菌綿棒（ 図1B）と競馬場の底に差し込みます。封印先端（ 図1C）から1cm -それが0.5であるので、競馬場の密封された端の方に綿をプッシュするために金属針を使用します。
- 滅菌ピペットを用いて、試料にMTB含有水（2.2節）を追加R準備されたMTBのレーストラック（ 図1B）のeservoir（開放端）。
4。 MTBの濃縮
- 競馬場は、サンプル流体で満たされたら、水平な面の上に、その側にそれを置く（ 例えば 、卓上型）と競馬場の密封された先端部（ 図1Bの隣に（北半球の）棒磁石のS極を配置及び図1C）。
- 綿を通って移動し、MTBの場合は5〜30分待ちます。その後、競馬場の先端付近の流体を収集する必要があります。長すぎる待って、キャピラリの先端にそのような他の運動性細菌などの汚染物質を、導入することができます。必要に応じて、競馬場の先端を見るとMTBが競馬場の先端に集めて見て光学顕微鏡を使用することができます。これは、あなたがそれを綿栓を通って移動し、MTBのにかかる時間を決定することができます。
- 優しく綿栓の近くの小さな傷を作り、競馬場の端を折り、ダイヤモンドナイフを使用しています。 <LI>競馬の先端から流体を除去するために細い針（25または27ゲージ）を1mlシリンジを使用してください。この液体試料は現在、濃縮MTBを含める必要があります。
5。光学顕微鏡で観察MTB
- カバースリップ上に濃縮されたMTBのサンプルの液滴（10〜20μl）を置きます。
- 迅速ので、ドロップが現在ダウンして直面しているとカバースリップの上からぶら下がってカバースリップを反転させます。
- スライドガラス上に載っているOリングの上にカバースリップを置きます。 Oリングは、その後わずかに小さい直径カバースリップ（; 図2約1cm）を持っている必要があります。
- 光顕微鏡ステージ上にこのハンギングドロップを置き、ドロップのいずれかの端に焦点を当てる。しかし、ハンギングドロップ法（ 図2）のために使用することは困難である石油を必要としないが、ほとんどは、高開口数（ 例えば 、0.93 NA）を持っているので、60X乾燥対物レンズは非常によく動作します。
- 絞首刑dに近い棒磁石の南の端を置きますROPとMTBは磁石（ 図3）に最も近いドロップの端に向かって移動を開始します。数分以内に多くのMTBはドロップの端（ 図3）であるべきである。細菌は磁石の極を反転させることにより、磁気であることを自分で証明してから、細菌が反対方向に泳ぐ観察する。
6。透過型電子顕微鏡（TEM）によるMTB観測
- 銅グリッド上に濃縮されたMTBの滴（約20μL）を配置し、細菌が10分のために解決することができます。
- クリーンフィルタ一枚の紙で余分な水分をオフウィック。
- 必要に応じて、グリッドに悪影響を2％酢酸ウラニル、2％リンタングステン酸のpH 7.2、または2.5％のモリブデン酸ナトリウム、7,8,9で染色することができます。これは、濃縮されたMTBでグリッドをインキュベートした後、直ちに染色一滴の上に銅グリッドを配置することによって行われます。負の汚れでグリッドをインキュベートし、倍はstに応じて異なりますアインは、使用した後、きれいなろ紙の切れ端で流体を切る芯。
- 透過型電子顕微鏡（TEM、 図4）を使用して、MTBを守ってください。ここでMTBを説明された仕事のためにFormvar安定化と炭素コーティングされた200メッシュの銅グリッド（テッド·ペラ＃01800）に吸着させた。グリッドは、最大10分までのために細胞懸濁液の一滴にカーボン側を下に置かれ、その後すぐに30秒間水の一滴にグリッドを配置することによって、1時間洗浄した。染色のために、グリッドは30秒〜5分間、2％酢酸ウラニル（テッド·ペラ＃19481）のドロップに置かれ、その後完全に濾紙を用いて乾燥した。グリッドは、TEMは200kVで高角度環状暗視野STEMを用いて80kVまたはFEI Tecnai F20のいずれかで、FEI Tecnaiスピリットを用いて分析した。
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Representative Results
磁石は、環境試料（ 図1A）に含まれる磁性細菌（MTB）を単離するために使用することができる効果的なツールです。キャピラリー競馬場（ 図1B）は 、彼らはまた、環境試料中に含まれ、非走磁性微生物から分離することができる綿栓を介してそれらを誘致するためにMTBの磁気特性を使用しています。
コロンバス、オハイオ州（アメリカ）でOlentangy川から採取した堆積物と水のサンプルが格納されている1。透明なプラスチックボトルフィギュア 。ボトルは約半分土砂と半分水が入っています。磁石の南の端（）は数時間のために堆積物上約1cmまで配置されます。容器の内側に磁石付近から流体の一部を除去した後、それが毛細血管rの内側に配置され棒磁石（B）の南の端に向かって綿栓（矢印）を介して、MTB泳ぐacetrack。間近でサンプルを示すキャピラリー競馬場のビュー、綿、濾過された流体は、キャピラリーチューブの密封端と棒磁石（C）の南の端。
MTBが競馬場から濃縮された後は、図2、小滴は、その後逆さまに反転し、スライド上に載っているOリングに配置されているカバーガラス、上に配置することができます。このスライドは、-o-リングカバーガラスサンドイッチは、光学顕微鏡のステージ上に配置され、60X乾燥対物レンズ（油レンズはハンギングドロップで使用するのは不便である）を使用して閲覧することができます。
図3のMTB水泳の明視野顕微鏡像（薄い長い矢印）と棒磁石のS極の隣にあるハンギングドロップ（短い矢印）の端に集まって。
図4：環境の堆積物試料から濃縮単走磁性細菌の透過型電子顕微鏡像。セル（らせん菌）とmagnetosomesの形態は単鞭毛と一緒にはっきりと見える。
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Discussion
走磁性細菌は、必ずしもすべての水生環境8で発見されていないが、それらが発生した場合、それらは100のオーダーで見つけることができます- 2ミリリットル当たり1000個の細胞。光学顕微鏡を用いて、MTBを観察するためには、あなた自身のサ ンプル8で約50細菌/ mlが必要になります。あなたのサンプル中にないか、または少数のMTBがない場合は、どちらかあなたのサンプルを収集したり、次のセクションで説明したテクニックの1以上を試行しなければならない新たな環境のサイトを選択する必要があります。
まず、大規模なプラスチック浴槽8を使用している環境からより多くの沈殿物を収集してみてください。 unculturable MTBの多数が必要とされる場合に特に便利です。環境試料に応じて、サンプルを採取した後、直ちに50細菌/ mlの濃度を有するMTBサンプルを単離することができない場合があります。したがって、ラに戻ってあなたの環境サンプルを持ってきたときboratory、それは棒磁石を使用し、MTBを隔離しようとする前に、実験室の条件に順応するためにサンプルを待つことが有益であるかもしれません。この順応期間は細菌群集はMTBの高濃度につながる文化を成熟させ、再設定することができます。多くの場合、より濃縮されたMTBのサンプルを生成する別の簡単な方法は、時間の長い期間（ 例えば 、数日間）の試料容器（ 図1A）の側面に棒磁石を残しておくことです。これは、磁石に移行するためのMTBより多くの時間を許可する必要があります。有用であるかもしれない1つの最後のテクニックは、1試料に各競馬場からMTBを組み合わせた後、一度に複数の競馬場があります（ 図1B）を使用することです。あなたは、競馬場に問題があると信じてか、豊かにサンプルであまりにも多くの汚染微生物（ すなわち 、非MTB）がある場合、あなたは彼らが綿PLUを泳ぐようにMTBを観察する光学顕微鏡下で競馬場を配置することができる場合グラム、チップに。これは、汚染微生物はまた、綿栓を通って来ると時濃縮プロセスを停止しようとしているかどうかを判断することができます。
私たちは、MTBを分離するために、より洗練された方法があることに言及する必要がありますが、これらの方法は、より専門的な機器を使用する必要があります。一例としては、淡水堆積物10、11からMTBを隔離するために代わりに棒磁石の磁気コイルの使用、およびカスタマイズされたガラス容器を伴います。ここで説明されたプロトコルは、環境サイトはMTBを含むかどうかを決定するための安価で効果的な方法を表しています。この分離·濃縮·プロトコルは、微生物学の学生はMTBの高い収率が達成できるように "微調整"簡単に習得することができないほど簡単です。 MTBが単離されたら、このような蛍光in-situハイブリダイゼーションなどの他の分析では、16Sは、コミュニティ分析、エネルギー分散分光法（EDS）、TEM、光学顕微鏡に順序付けrRNAのと磁気測定をMTB 12、13、14日に行うことができる。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、米国国立科学財団（EAR-0920299およびEAR-0745808）からの補助金によって支えられて、米国国立科学財団（東アジア·太平洋担当）サマー研究所、アメリカ研究助成プログラムと大学院研究奨学金同窓会助成地質学会をオハイオ州立大学から。我々は彼らの洞察に満ちたコメントのためのエディタと二人の匿名査読者に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
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