Summary
Vi viser en metode for å samle magnetotactic bakterier (MTB) som kan brukes til naturlig vann. MTB kan bli isolert og beriket fra sedimentprøver ved hjelp av en relativt enkel oppsett som tar nytte av bakterier naturlig magnetisme. Isolert MTB kan deretter undersøkes i detalj ved hjelp av både lys-og elektronmikroskopi.
Abstract
Magnetotactic bakterier (MTB) er vannlevende mikroorganismer som først ble særlig beskrevet i 1975 en fra sedimentprøver i saltmyrene i Massachusetts (USA). Siden da MTB har blitt oppdaget i stratifisert vann-og sediment-kolonner fra hele verden 2. En funksjon som er felles for alle MTB er at de inneholder magnetosomes, som er intracellulære, membran-bundet magnetiske nanokrystaller av magnetitt (Fe 3 O 4) og / eller greigite (Fe 3 S 4) eller begge 3, 4. I den nordlige halvkule, er MTB vanligvis tiltrukket sørenden av en bar magnet, mens i den sørlige halvkule de er vanligvis tiltrukket til nordenden av en magnet 3,5. Denne egenskapen kan utnyttes når du prøver å isolere MTB fra miljøprøver.
En av de vanligste måtene å berike MTB er å bruke en klar plastbeholder til samle sediment og vann fra en naturlig kilde,for eksempel en ferskvann tjern. På den nordlige halvkule, er sør enden av en bar magnet plassert mot utsiden av beholderen like over sedimentet på sedimentet-vann-grensesnittet. Etter noen tid, kan bakteriene fjernes fra innsiden av beholderen nær magneten med en pipette og deretter anriket ytterligere ved hjelp av en kapillær Ovalt 6 og en magnet. Når beriket, bakteriene kan plasseres på et objektglass med en hengende dråpe fremgangsmåte og observert i et lysmikroskop eller deponeres på en kobber rutenett og observert ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM).
Ved hjelp av denne metoden, kan isolert MTB studeres mikroskopisk å bestemme egenskaper som svømming atferd, type og antall flageller, cellemorfologi av cellene, form av magnetiske krystaller, antall magnetosomes, antall magnetosome kjeder i hver celle, sammensetning av de nanomineral krystaller, og tilstedeværelse av intracellulære vakuoler.
Protocol
1. MTB Collection
- Når de bestemmer seg et settefiskanlegg for å samle magnetotactic bakterier (MTB), er det ofte best å starte med en dam eller saktegående bekk som har en myk gjørmete sedimentlag. I denne demonstrasjonen samlet vi en prøve på kanten av Olentangy River på campus av Ohio State University (OSU) i Columbus, Ohio (USA). Selv om dette var et passende sted for demonstrasjonen vår, er protokollen som er beskrevet her gjelder for alle vannlevende sted. Materialene som brukes i denne protokollen kan bli funnet i Tabell 1. Finne et sted hvor dybden av vannet er mellom 10 og 100 cm. På et slikt sted, bør du samle det øverste lag av sediment med en klar, skrue-top container. Scoop sedimentet og vann inn i beholderen inntil det er fylt med en tredjedel til halvparten sediment og den resterende mengden med vann. Hold beholderen neddykket inntil det er fylt med vann og deretter tett cap beholderen wed sin skrue-top lokk. Det er ikke nødvendig å blande sedimentet. Tørk utsiden av beholderen tørr med et håndkle og deretter ta prøven til laboratoriet. Det er ikke nødvendig å jag prøven tilbake til laboratoriet. Vi har forlatt MTB prøver i plastbeholdere i feltet i flere dager før bringe dem tilbake til vårt laboratorium. MTB skal være levedyktig i flere uker til måneder, så lenge du lagrer prøvene i et skyggefullt sted i feltet.
- Når prøven er i laboratoriet, løsne hetten og la den dekker beholderen for å redusere mengden av fordampning. Oppbevar beholder ved romtemperatur i et mørkt rom, skuff, eller fullstendig dekke beholderen med aluminiumsfolie. Tillat sedimentet og fine partikler til å fullstendig faller til bunnen av beholderen ved å la prøven uforstyrret i flere timer til flere dager. Det er ikke nødvendig å blande sedimentet, MTB foretrekker en uforstyrret miljø. De klare vegger plastbeholdervil tillate deg å bekrefte at partiklene har lagt seg på bunnen. Avhengig prøven, kan MTB forbli i live i utvalget for mange måneder.
2. MTB Isolasjon
- Når du er klar til å isolere MTB, sted magneter på sidene av plastbeholder ca 1 cm over sediment-vann-grensesnittet (Figur 1A). Vær forsiktig så du ikke forstyrrer sedimentet i bunnen av beholderen. Plasser sydpolen av en bar magnet på den ene siden av beholderen og nordsiden av annen bar magnet på motsatt side (figur 1A). Nesten enhver magnet kan benyttes, for eksempel en magnetisk rørestav eller store kjøleskap magnet. Alt kan brukes til å støtte magnetene i riktig høyde over bunnfallet-vann-grensesnittet. Vi har funnet ut at hvile magnetene på toppen av en papp-eller plast-boksen er best, kan imidlertid magnetene også tapet til utsiden av plastbeholderen. Vent 30 min til fleretimer for bakterier å svømme til magneten.
- Bruk en steril pipette til nøye samle opp vannet fra innsiden av beholderen (fig. 1A) nær posisjonen til sør polet bar magnet (for prøver innsamlet i den nordlige halvkule). Dette vannet skal inneholde MTB som er tiltrukket av den sør-polet bar magnet. Deretter bør en kapillær veddeløpsbane brukes til ytterligere berike MTB.
3. MTB Racetrack
- For å berike din prøven med magnetotactic bakterier, er en kapillær veddeløpsbanen nødvendig (Tall 1B og 1C). Disse må gjøres før isolere cellene fra klart plastbeholder.
- Bruk en 5,75 tommer (146 mm) glass Pasteur pipette for å lage en racerbane. Bruk en diamant penn eller fil å kutte av toppen av pipetten, er lengden av pipetten ikke avgjørende, men det bør være i stand til å inneholde omtrent 1-2 ml vann. Deretter bruker en bunsenbrenner å smelte spissen slik atdet blir forseglet (figur 1C). Den resulterende pipetten bør ha en åpen ende og en forseglet ende.
- Lage flere av disse banene og deretter autoklav. I tillegg må du autoklaveres bomull og flere lange metall nåler.
- Legg filtrert prøve vann, samlet fra nær sedimentet vann grensesnittet vist i figur 1A, til en autoklavert baneoddsen hjelp av en lang nål av metall festet til en filtrert sprøyte. Porestørrelsen filteret skal være 0,22 mm for å eliminere avfall og forurensninger fra vannet. Det er viktig å være helt sikker på at det ikke er noen luftbobler i glasset kapillær.
- Plugg bunnen av banen med steril bomull (figur 1B). Bruk metallnippel å skyve bomull mot den forseglede ende av banen, slik at det er 0,5 til 1 cm fra den forseglede spiss (figur 1C).
- Ved hjelp av en steril pipette, tilsett MTB-inneholdende vann (fra avsnitt 2.2) til prøven reservoir (åpen ende) av en forberedt MTB veddeløpsbanen (figur 1B).
4. MTB Enrichment
- Når banen er fylt med prøvemedium, lå den på høykant på en horisontal flate (f.eks en stasjonær) og plassere den sørlige polen på en bar magnet (på den nordlige halvkule) ved siden av den forseglede spissen av banen (Tall 1B og 1C).
- Vent 5 til 30 min for MTB til å migrere gjennom bomull. Da bør du samle væsken nær tuppen på racerbanen. Venter for lenge kan innføre forurensninger, for eksempel andre bevegelige bakterier, til spissen av kapillæret. Eventuelt kan du bruke en lett mikroskop for å se spissen av banen og se MTB samle på veddeløpsbanen i tips. Dette vil tillate deg å finne ut hvor lang tid det tar MTB til å migrere gjennom bomull plugg.
- Forsiktig bruk diamant kniv for å lage en liten ripe i nærheten bomull plugg og fest på slutten av banen. <li> Bruk en 1 ml sprøyte med en smal nål (25 eller 27 gauge) for å fjerne fluidet fra spissen av banen. Denne væsken prøven skal nå inneholde beriket MTB.
5. MTB Observasjon ved lysmikroskopi
- Plasser en dråpe (10-20 pl) av det anrikede MTB prøven ut et dekkglass.
- Raskt snu dekkglasset over så fallet er nå vender ned og hengende fra dekkglasset.
- Plasser dekkglasset på en o-ring som hviler på et glass lysbilde. O-ringen bør ha en litt mindre diameter og deretter dekkglasset (ca 1 cm, Fig. 2).
- Plasser denne hengende dråpe på en lysmikroskop scene og fokusere på den ene kanten av bloddråpen. En 60X tørr mål fungerer veldig bra fordi de fleste har en høy numerisk apertur (NA, for eksempel, 0,93), men ikke krever olje, som er vanskelig å bruke for hengende slipp-metoden (figur 2).
- Plasser den sørlige enden av en bar magnet nær hengende dROP og MTB vil begynne å migrere mot kanten av dråpen nærmest magneten (Figur 3). Innen noen få minutter mange MTB bør være på kanten av dråpe (fig. 3). Bevise for selv at bakteriene er magnetisk ved å reversere pol av magneten og deretter observere bakteriene svømme i motsatt retning.
6. MTB Observasjon av transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
- Plasser en dråpe (~ 20 ul) av det anrikede MTB bort på en kobber rutenett og tillate bakterier å avgjøre for 10 min.
- Veke av overflødig vann med et stykke ren filter papir.
- Eventuelt kan gitteret negativt farget med 2% uranyl-acetat, 2% phosphotungstic syre pH 7,2, eller 2,5% natrium 7 molybdat, 8, 9. Dette gjøres ved å plassere kobber rutenettet på en dråpe flekk umiddelbart etter inkubering av gitteret med det anrikede MTB. Inkuber rutenettet med den negative flekken vil varierer avhengig på stain brukes, og deretter transportere av fluidet med et stykke rent filterpapir.
- Observer MTB hjelp transmisjonselektronmikroskopi (TEM, figur 4). For arbeidet er beskrevet her MTB ble adsorbert til Formvar stabilisert og karbon belagt 200 mesh kobber nett (Ted Pella # 01800). Ristene ble plassert med karbon side ned på en dråpe cellesuspensjon for opp til 10 min, og deretter umiddelbart vasket en gang ved å plassere rutenettet på en dråpe vann i 30 sek. For farging ble ristene plassert på en dråpe 2% uranyl acetat (Ted Pella # 19481) i 30 sek til 5 min og deretter tørket fullstendig med et stykke filterpapir. Tavlene ble analysert ved TEM hjelp av en FEI Tecnai Spirit på 80kV eller en FEI Tecnai F20 med høy vinkel ringformet mørke feltet STEM på 200kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En magnet er et effektivt verktøy som kan brukes til å isolere magnetotactic bakterier (MTB) inneholdt i miljøprøver (figur 1A). En kapillær Racetrack (figur 1B) bruker de magnetiske egenskapene MTB å tiltrekke dem gjennom en bomull plugg der de kan skilles fra ikke-magnetotactic mikroorganismer også innbefattes i miljømessige prøven.
Figur 1. En klar plastflaske med et sediment og vannprøver samlet inn fra Olentangy River i Columbus, Ohio (USA). Flasken inneholder omtrent halvparten sediment og en halv vann. Sørenden av en magnet plasseres omtrent 1 cm over sedimentet i opptil flere timer (A). Etter å fjerne noe av fluidet fra i nærheten av magneten på inne i beholderen, er det plassert inne i en kapillær racetrack hvor MTB svømme gjennom en bomull plugg (pil) mot den sørlige enden av en bar magnet (B). En nær opp visning av kapillær veddeløpsbanen viser prøven, bomull, filtrert væske, forseglet enden av kapillarrør og sørenden av en bar magnet (C).
Figur 2. Når MTB har blitt beriket av banen, kan en liten dråpe plasseres på et dekkglass, som deretter snudd opp ned og plassert på en o-ring som hviler på et lysbilde. Dette slide-o-ring-dekkglass sandwich kan plasseres på et lysmikroskop scenen og vises ved hjelp av en 60X tørr mål (olje linser er upraktisk å bruke med en hengende dråpe).
Figur 3. Bright feltet mikroskop bilde av MTB svømming (tynnlange piler) og samle på kanten av den hengende dråpen (korte piler) som er ved siden sydpolen av en bar magnet.
Figur 4. Girkasse elektronmikroskop bilde av en enkelt magnetotactic bakterie beriket fra et miljømessig sediment prøven. Morfologi av cellen (spirillum) og magnetosomes er godt synlig sammen med en enkelt flagellum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Magnetotactic bakterier er ikke nødvendigvis finnes i hver vannmiljøet 8, men når de forekommer, kan de bli funnet på størrelsesorden 100 - 1000 celler per milliliter 2. For å observere MTB med optisk mikroskopi, må du omtrent 50 bakterier / ml i prøven 8. Hvis det er ingen eller få MTB i prøven din, så du må enten velge en ny miljø-nettsted for å samle dine prøver eller du må prøve en eller flere av de teknikkene som diskuteres i neste avsnitt.
Først, bør du prøve å samle mer sediment fra miljøet ved hjelp av en stor plast kar 8. Dette er spesielt nyttig hvis et stort antall unculturable MTB er nødvendig. Avhengig miljømessige prøven, kan det ikke være mulig å isolere MTB eksempler hadde en konsentrasjon på 50 bakterie / ml umiddelbart etter innsamling av prøven. Derfor, når du tar den negative prøven tilbake til laboratory, kan det være fordelaktig å vente for prøven å akklimatisere seg til laboratorieforhold før prøver å isolere MTB med en bar magnet. Dette akklimatiseringsperiode vil tillate bakteriell samfunnet til å modnes og repopulate kulturen fører til høyere konsentrasjoner av MTB. En annen enkel teknikk som ofte gir mer konsentrerte MTB prøvene er å forlate baren magnet på siden av prøvebeholderen (figur 1A) for en lengre periode (f.eks, flere dager). Dette bør tillate MTB mer tid til å migrere til magneten. En siste teknikk som kan være nyttig, er å bruke flere racerbaner (figur 1B) på en gang og deretter kombinere MTB fra hver veddeløpsbanen i én prøve. Hvis du mener det er et problem med en racerbane, eller hvis det er for mange forurensende mikroorganismer (dvs. ikke-MTB) i din beriket prøve, kan du plassere banen under en lys mikroskop for å observere MTB som de svømmer gjennom bomull plug og i spissen. Dette vil tillate deg å avgjøre om forurensende mikroorganismer kommer også gjennom bomull pluggen og når du skal stoppe anriking prosessen.
Vi bør nevne at det er mer sofistikerte måter å isolere MTB, men disse metodene krever bruk av mer spesialisert utstyr. Ett eksempel innebærer bruk av en magnetisk spole, i stedet for en bar magnet, og tilpassede glassbeholdere å isolere MTB fra ferskvann sedimenter 10, 11. Protokollen er beskrevet her representerer en billig og effektiv metode for å avgjøre om en miljømessig nettstedet inneholder MTB. Denne isolasjonen og berikelse protokollen er grei nok til at mikrobiologi studentene kan mestre og enkelt "fine-tune" slik at høyere avkastning av MTB kan oppnås. Når MTB er isolert, andre analyser som fluorescens in situ hybridisering, rRNA 16S sekvensering for fellesskap analyse, energi dispersiv spektroskopi (EDS), TEM, optisk mikroskopiog magnetiske målinger kan utføres på 12 MTB, 13, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det amerikanske National Science Foundation (EAR-0920299 og EAR-0745808), US National Science Foundation Øst Asia og Stillehavet Summer Institutes, Geological Society of America Research Grant Program og Alumni Tilskudd til Graduate Forskning og stipend fra The Ohio State University. Vi vil gjerne takke redaktøren og to anonyme anmeldere for sine innsiktsfulle kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
- Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
- Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
- Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
- Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
- Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
- Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
- Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
- Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
- Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
- Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
- Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).
