Summary
Vi demonstrera en metod för att samla magnetotactic bakterier (MTB) som kan tillämpas på naturliga vatten. MTB kan isoleras och anrikas från sedimentprover med en relativt enkel installation som tar fördel av bakteriernas naturliga magnetism. Isolerad MTB kan sedan granskas i detalj med både ljus-och elektronmikroskopi.
Abstract
Magnetotactic bakterier (MTB) är vattenlevande mikroorganismer som först bland beskrivs i 1975 1 från sedimentprover samlats in salta våtmarker i Massachusetts (USA). Sedan dess MTB har upptäckts i skiktad vatten och sediment-kolumner från hela världen 2. Ett gemensamt drag för alla MTB är att de innehåller magnetosomes, vilka är intracellulära, membranbundna magnetiska nanokristaller av magnetit (Fe 3 O 4) och / eller greigite (Fe 3 S 4) eller båda 3, 4. På norra halvklotet är MTB vanligtvis attraheras till södra änden av en stavmagnet, medan det södra halvklotet som de brukar lockas till norra änden av en magnet 3,5. Denna egenskap kan utnyttjas när man försöker isolera MTB från miljöprover.
En av de vanligaste sätten att berika MTB är att använda en klar plastbehållare för att samla sediment och vatten från en naturlig källa,såsom sötvatten damm. På norra halvklotet är den södra änden av en stavmagnet placeras mot utsidan av behållaren ovanför sedimentet på sediment-vatten-gränssnittet. Efter en tid kan bakterierna avlägsnas från insidan av behållaren nära magneten med en pipett och sedan berikas ytterligare genom att använda en kapillär travbana 6 och en magnet. När berikad, bakterierna kan placeras på ett objektglas med hjälp av en hängande droppe metod och observeras i ett ljusmikroskop eller deponeras på en koppar nät och observerade med transmissionselektronmikroskop (TEM).
Med denna metod kan isolerad MTB studeras i mikroskop för att bestämma egenskaper såsom simning beteende, typ och antal flagella, cellmorfologin av cellerna, formen på de magnetiska kristaller, antal magnetosomes, antal magnetosome kedjor i varje cell, sammansättning de nanomineral kristallerna, och närvaro av intracellulära vakuoler.
Protocol
1. MTB Insamling
- När beslut fattas om en sötvatten plats att samla magnetotactic bakterier (MTB), är det ofta bäst att börja med en damm eller långsamma flöde som har en mjuk lerig sedimentlager. I denna demonstration vi samlat ett urval på kanten av Olentangy River på campus vid Ohio State University (OSU) i Columbus, Ohio (USA). Även om detta var ett bra läge för vår demonstration, är protokollet som beskrivs här tillämpas på alla vattenlevande plats. De material som används i detta protokoll kan hittas i tabell 1. Hitta en plats där vattendjupet är mellan 10 och 100 cm. Vid en sådan plats ska du samla översta lagret av sediment med en tydlig, skruvlock behållare. Scoop sediment och vatten i behållaren tills den är fylld med en tredjedel till hälften sediment och den återstående volymen med vatten. Förvaras nedsänkt tills den är fylld med vatten och sedan tätt tak behållaren wed sin skruv-lock. Det är inte nödvändigt att blanda sediment. Torka utsidan av torrt med en handduk och sedan ta provet till laboratoriet. Det är inte nödvändigt att rusa provet tillbaka till ditt laboratorium. Vi har lämnat MTB prover i plastbehållare inom flera dagar innan föra dem tillbaka till vårt laboratorium. MTB ska vara lönsamt för flera veckor till månader så länge du lagra proverna på en sval, skuggig plats i fältet.
- När provet är i laboratoriet, lossa locket och låt den täcker behållaren för att minska mängden avdunstning. Förvara behållaren vid rumstemperatur i ett mörkt rum, låda, eller helt täcka behållaren med aluminiumfolie. Låt sedimentet och fina partiklar att helt sedimentera till botten av behållaren genom att lämna provet ostört under flera timmar till flera dagar. Det är inte nödvändigt att blanda sedimentet, MTB föredrar en ostörd omgivning. De klara väggar plastbehållarenkan du bekräfta att partiklarna har sjunkit till botten. Beroende på ditt prov kan MTB leva i provet i flera månader.
2. MTB Isolering
- När du är redo att isolera MTB, placera magneter på sidorna av plastbehållaren ca 1 cm ovanför sedimentet-vatten-gränssnittet (Figur 1A). Var noga med att inte störa sediment i botten av behållaren. Placera sydpol en stavmagnet på ena sidan av behållaren och den norra sidan av en annan stavmagnet på motsatt sida (Figur 1A). Nästan alla magnet kan användas, såsom en magnetisk omrörarstav eller stora kylskåpsmagneten. Allt kan användas för att stödja magneterna på rätt höjd ovanför sedimentet-vatten gränsytan. Vi har upptäckt att vila magneterna på toppen av en kartong eller plastlåda är bäst, emellertid, kan magneterna även tejpas till utsidan av plastbehållaren. Vänta 30 minuter till fleratimmar för bakterierna att simma till magneten.
- Använd en steril pipett noggrant samla upp vattnet från inuti behållaren (Figur 1A) nära läge syd-pol stavmagnet (för prov som tagits vid norra halvklotet). Detta vatten bör innehålla MTB som har lockat till söder-pol stavmagnet. Därefter bör en kapillär rundat användas för att ytterligare berika MTB.
3. MTB Racetrack
- För att berika ditt prov med magnetotactic bakterier, är en kapillär rundat nödvändig (figurerna 1B och 1C). Dessa måste göras innan isolera cellerna från klar plastbehållare.
- Använd en 5,75 tum (146 mm) glas pasteurpipett att göra en racerbana. Använd en diamant penna eller fil för att skära av den övre delen av pipetten, är längden av pipetten inte avgörande, men det bör kunna innehålla ungefär 1-2 ml vatten. Sedan använder en Bunsenbrännare att smälta spetsen så attblir förseglad (figur 1C). Den resulterande pipett bör ha en öppen ände och en sluten ände.
- Gör flera av dessa tävlingsbanor och sedan autoklav. Dessutom kommer du att behöva autoklav bomull och flera långa nålar metall.
- Lägg filtrerat prov vatten, som samlats in från nära sediment vatten gränssnittet visas i figur 1A, till en autoklaverad travbana användning av en lång metall nål fäst till en filtrerad spruta. Porstorleken i filtret bör vara 0,22 mm för att eliminera skräp och föroreningar från vattnet. Det är viktigt att vara helt säker på att det inte finns några luftbubblor i glaset kapillär.
- Anslut botten tävlingsbanan med steril bomull (Figur 1B). Använd metallnål att skjuta bomullen mot den tätade änden av rundat så det är 0,5 - 1 cm bort från den förseglade spetsen (figur 1C).
- Med hjälp av en steril pipett, tillsätt MTB-innehållande vatten (från avsnitt 2,2) till provet reservoir (öppna änden) av en beredd MTB rundat (Figur 1B).
4. MTB Anrikning
- När banan är fylld med prowätska, lägg det på sin sida på en horisontell yta (t.ex. en bänk) och placera sydpol en stavmagnet (på norra halvklotet) bredvid den förseglade spetsen av tävlingsbanan (figur 1B och 1C).
- Vänta 5 till 30 min för MTB att migrera genom bomull. Då ska du samla vätskan nära toppen av tävlingsbanan. Väntar alltför länge kan införa föroreningar, såsom andra rörliga bakterier, till spetsen av kapillären. Alternativt kan du använda ett ljusmikroskop för att visa spetsen av tävlingsbanan och titta på MTB samlas vid travet spets. Detta gör att du kan avgöra hur lång tid det tar MTB att migrera genom bomullspropp.
- Försiktigt använda diamant kniv för att göra en liten repa nära bomullspropp och bryt av i slutet av banan. <li> Använd en 1 ml spruta med en smal nål (25 eller 27 gauge) för att ta bort vätskan från spetsen på tävlingsbanan. Denna vätskeprov bör nu innehålla berikade MTB.
5. MTB Observation genom Ijusmikroskopi
- Placera en droppe (10-20 pl) av det anrikade MTB provet på ett täckglas.
- Snabbt vänder täckglas över så droppen nu nedåt och hängande från täckglaset.
- Placera täckglaset på en O-ring som vilar på en glasskiva. O-ringen bör ha en något mindre diameter än täckglaset (ca 1 cm, figur 2).
- Placera detta hängande droppe på ett ljusmikroskop stadium och fokusera på den ena kanten av droppen. En 60X torr mål fungerar mycket bra eftersom de flesta har en hög numerisk apertur (NA, t.ex. 0,93) men inte kräver olja, som är svår att använda för hängande droppe-metoden (figur 2).
- Placera den södra änden av en stavmagnet nära hängande dROP och MTB börjar migrera mot kanten av droppen närmast magneten (figur 3). Inom några minuter många MTB ska vara vid kanten av droppen (Figur 3). Bevisa för dig själv att bakterierna är magnetiska genom att vända på polen på magneten och observera bakterierna simmar i motsatt riktning.
6. MTB observation av transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Placera en droppe (~ 20 | il) av den anrikade MTB på en koppar-rutnät och låta bakterierna sedimentera under 10 minuter.
- Wick bort överflödigt vatten med en bit ren filterpapper.
- Eventuellt kan nätet vara negativt färgas med 2% uranylacetat, 2% fosforvolframsyra pH 7,2, eller 2,5% natriummolybdat 7, 8, 9. Detta görs genom att placera koppar gallret på en droppe fläck omedelbart efter inkubering gallret med den anrikade MTB. Inkubera gallret med den negativa fläcken, kommer varierar beroende på main används och sedan transportera bort vätskan med en bit ren filterpapper.
- Beakta MTB med transmissionselektronmikroskop (TEM, figur 4). För det arbete som beskrivs här MTB adsorberades till Formvar stabiliserad och kol belagda 200 mesh galler koppar (Ted Pella # 01.800). Gallren placerades med kol nedåt på en droppe av cell-suspensionen upp till 10 minuter, sedan omedelbart tvättas en gång genom att placera gallret på en droppe vatten under 30 sek. För färgning var galler placerades på en droppe av 2% uranylacetat (Ted Pella # 19.481) under 30 sek till 5 min och torkades sedan fullständigt med användning av en bit filterpapper. Gallren analyserades med TEM antingen en FEI Tecnai Spirit på 80kV eller FEI Tecnai F20 med hög vinkel ringformig mörka fält STEM vid 200kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En magnet är ett effektivt verktyg som kan användas för att isolera magnetotactic bakterier (MTB) som finns i miljöprover (Figur 1A). En kapillär travet (Figur 1B) använder de magnetiska egenskaperna hos MTB att locka dem genom en bomullspropp där de kan skiljas från icke-magnetotactic mikroorganismer också finns inom miljö-provet.
Figur 1. En klar plastflaska med ett sediment och vatten prov som tagits på den Olentangy River i Columbus, Ohio (USA). Flaskan innehåller ungefär en halv sediment och en halv vatten. Den södra änden av en magnet placeras ca 1 cm ovanför sedimentet upp till flera timmar (A). Efter avlägsnande en del av fluiden från nära magneten på insidan av behållaren, placeras inuti en kapillär racetrack där MTB simma genom en bomullspropp (pil) mot den södra änden av en stavmagnet (B). En närbild av den kapillära tävlingsbanan visar provet, bomull, filtrerad vätska, förseglade änden av kapillärröret och södra änden av en stavmagnet (C).
Figur 2. När MTB har berikats från banan, kan en liten droppe placeras på ett täckglas, som sedan vänds upp och ner och placeras på en o-ring som vilar på en bild. Denna slide-o-ring-täckglas sandwich kan placeras på ett ljusmikroskop scen och visas med en 60X torr mål (olja linser är obekväma att använda med en hängande droppe).
Figur 3. Ljusfält mikroskop bild av MTB simning (tunnlånga pilar) och samla vid kanten av den hängande droppe (korta pilar) som ligger i anslutning till Sydpolen för en stavmagnet.
Figur 4. Transmissionselektronmikroskop bilden av en enda magnetotactic bakterie berikad ur miljösynpunkt sediment prov. Morfologin av cellen (spirillum) och magnetosomes är klart synliga tillsammans med en enda flagell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Magnetotactic bakterier inte nödvändigtvis finns i varje vattenmiljön 8 men när de inträffar, kan de finnas i storleksordningen 100 - 1.000 celler per milliliter 2. För att observera MTB med hjälp av optisk mikroskopi, behöver du ungefär 50 bakterier / ml i prov 8. Om det inte finns några eller få MTB i ditt prov, då du kommer antingen behöva välja en ny miljö plats för att samla dina prover eller måste du försöka en eller flera av de tekniker som diskuteras i nästa avsnitt.
Först bör du försöka samla in mer sediment från omgivningen med hjälp av en stor plast tub 8. Detta är speciellt användbart om ett stort antal unculturable MTB behövs. Beroende på miljöprov, är det kanske inte möjligt att isolera MTB prover med en koncentration av 50 bakterier / ml omedelbart efter upptagning av provet. Därför, när du tar miljöprov tillbaka till laboratory, kan det vara fördelaktigt att vänta på provet anpassa sig till laboratorieförhållanden innan du försöker isolera MTB med en stavmagnet. Denna acklimatiseringsperiod gör det möjligt för bakterier samfundet att mogna och återbefolka kulturen leder till högre koncentrationer av MTB. En annan enkel teknik som ofta ger mer koncentrerade MTB prover är att lämna stavmagnet på sidan av provbehållaren (figur 1A) under en längre tid (t.ex. flera dagar). Detta bör göra det möjligt MTB mer tid att migrera till magneten. En sista teknik som kan vara användbar, är att använda flera tävlingsbanor (Figur 1B) på en gång och sedan kombinera MTB från varje travbanan i ett prov. Om du tror att det finns ett problem med en racerbana eller om det finns för många kontaminerande mikroorganismer (dvs. icke-MTB) i din berikat prov, kan du placera banan under ett ljusmikroskop att observera MTB när de simmar genom bomull PLUg och in i spetsen. Detta gör att du kan avgöra om förorenande mikroorganismer också kommer genom bomullspropp och när du ska sluta anrikningsprocessen.
Vi bör nämna att det finns mer sofistikerade sätt att isolera MTB, men dessa metoder kräver användning av mer specialiserad utrustning. Ett exempel innefattar användning av en magnetisk spole, i stället för en stavmagnet, och anpassade fartyg glas att isolera MTB från sötvatten sediment 10, 11. Protokollet som beskrivs här representerar en billig och effektiv metod för att bestämma huruvida en miljö webbplatsen innehåller MTB. Denna isolering och anrikning protokoll är enkel nog att mikrobiologi eleverna kan behärska och enkelt "finjustera" så att högre utbyten av MTB kan uppnås. När MTB har isolerats, andra analyser såsom fluorescens in situ hybridisering, rRNA 16S sekvensering för gemenskap analys, energi spridd spektroskopi (EDS), TEM, optisk mikroskopioch magnetiska mätningar kan utföras på MTB 12, 13, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från amerikanska National Science Foundation (EAR-0.920.299 och EAR-0.745.808), US National Science Foundation East Asien och Stillahavsområdet Sommar institut, Geological Society of America Research Grant Program och Alumni Bidrag för Graduate forskning och stipendium från The Ohio State University. Vi vill tacka redaktören och två anonyma granskare för deras insiktsfulla kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
- Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
- Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
- Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
- Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
- Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
- Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
- Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
- Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
- Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
- Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
- Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).
