Summary
כאן אנו מציגים שיטה היסטולוגית ללכיד, סימון, ניקוי אופטי, והדמית ממשק רקמת המוח השלם סביב microdevices המושתל כרוני ברקמת מוח מכרסם. תוצאות מהטכניקות הכוללות בשיטה זו הן שימושיות להבנת ההשפעה של-שתלים במוח חודרניים שונים ברקמות המקיפות אותם.
Abstract
מחקר לעיצוב והניצול של microdevices מוח מושתל-, כגון מערכי microelectrode, שואף לייצר מכשירים רלוונטיים קליני כי ממשק כרוני עם רקמות מוח. רקמה הסובבת שתלים אלה היא חשב להגיב לנוכחות של המכשירים לאורך זמן, הכוללת את הקמתה של "צלקת גלייה" בידוד סביב את המכשירים. עם זאת, ניתוח היסטולוגית של רקמות שינויים אלה מבוצע בדרך כלל לאחר explanting המכשיר, בתהליך שיכול לשבש את המורפולוגיה של הרקמה של עניין.
כאן אנו מדגימים פרוטוקול שבו התקנים מושתלים-קליפת המוח נאספים שלמים ברקמות מוח מכרסם. אנו מתארים כיצד, perfused פעם אחת עם מייצב, מוח מוסרים ופרוסים בדרך שתמנע מכשירי explanting. אנחנו נתווה תיוג נוגדן ניאון ושיטות סליקה אופטיות שימושיות לייצור רקמות אינפורמטיבי, עדיין עבותסעיף. לבסוף, אנחנו מדגימים את ההרכבה וההדמיה של חלקי רקמות אלו על מנת לחקור את הממשק הביולוגי סביב מכשירי מוח מושתל.
Introduction
תחום neuroprosthetic המחקר נועד לסייע לאנשים הסובלים ממוגבלויות והפרעות שונות, תוך עקיפת מבנים חולים או פגומים בגוף דרך מערכת העצבים מרכזיים המשיקה 1,2 התקנים. microdevices מוח מושתל-, כגון מערכי microelectrode (MEAs), ניתן להשתמש בו כדי להקליט או לגרות מבנים מוחיים, וכך תאפשר את הקמת ממשקים ארוכי טווח בין אלקטרוניקה ורקמות CNS 3-5. MEAs החודרני, מכשירים המונעים לרקמת המוח, לקיים הבטחה מסוימת כממשקים דו כיווניים בשל סמיכות שבמסגרתו הם מציגים את האלקטרודות לקבוצה קטנה יחסית של נוירונים סמוכים 6.
עם זאת, תוצאה מורכבת רקמת תגובות מהשתלה לטווח הארוך של MEAs הנוקב, לעתים קרובות וכתוצאה מכך יחסים אלקטרופזיולוגים משתנים ובהדרגה משפילים אות לרעש מעל ימים עד חודשים, ועלייה בimped החשמליאהה בין אתרים אלקטרודה והקרקע 7,8. מקורותיה המשוערים של שינויים אלה כוללים הפעלה של מיקרוגליאה, astrocytosis תגובה לאורך microdevices, והפסד או הגירה של תאי עצב מהרקמה הסובבת להתקנים מושתלים 9-11. אתגר מרכזי להבנת שינויים ברקמות מסביב, MEAs חדירה הכרוני הוא הקושי בלכידת נתונים היסטולוגית של ממשק הרקמה השלם מסביב התקנים מושתלים כרוני 12. ניתוח היסטולוגית של הרקמה עם הממשק עדיין קיים מכשיר / רקמות הייתי לשפר את הפרוטוקולים היסטולוגית מכשיר להסרה הנוכחיות. עם מכשיר ללא הפרעה שנותר ברקמה, ההשפעה הביולוגית של אינטראקציות יחסית עדינות, כגון ניצול של ציפויים ביולוגיים 13,14 או סליקה החשמלית של משטח אלקטרודה 15,16, יכולה להיות צלמה ונתחה ביחס לשתל.
Hפה אנחנו מדגימים שיטה לאסוף, לעבד, ותמונת ממשק microdevice השלם לניתוח מפורט מבוסס מיקרוסקופיה של רקמת המוח שמסביב. בשיטה זו, המכשיר ורקמות מוח נאספים בתוך עבה (> 250 מיקרומטר) סעיף רקמות באמצעות vibratome. כדי לשפר את חדירת תווית היסטולוגית לפרוסות עבות האלה, תוויות וhistochemical immunohistochemical ניאון מיושמות בריכוזים גבוהים בפתרונות המכילים סרום וחומר ניקוי חסימה למספר רבים של ימים. פתרון סליקה אופטית מועסק לשפר מעמקי הדמיה מיקרוסקופית, והרקמה היא רכובה בתאים 2-צדדיים למיקרוסקופיית ליזר לאחר confocal 17. כדי ללכוד את הממשק היסטולוגית המלא, שלב translational מבוקר מחשב משמש במהלך ההדמיה לאסוף פנורמות Z-מחסנית לאורכו של שתלים. בנוסף להדמיה להחיל תוויות רקמות, איסוף החזרת ליזר חזרה משתליםוהעברת אור דרך הרקמה הן לסייע בתרגום ממשק המכשיר ביחס לרקמות. רקמה הוכנה באמצעות "התקן-Capture היסטולוגיה" זה (DCHist) פרוטוקול מספק גישת הדמיה לאינטראקציות השתמרה מורפולוגית הרקמות / מכשיר, ובכך משפר עם פרוטוקולי מכשיר להסרה היסטולוגית קודמים 18.
Protocol
פתרונות
נאגר מלוח פוספט (PBS) - בג' / הליטר; 9 גרם NaCl, 0.144 גרם KH 2 4 ת.ד., 0.795 גרם Na 2 4 HPO, ב-pH 7.4
4% פורמלדהיד - במ"ל / הליטר; 202 נתרן פוספט פתרון מ"ל dibasic (0.4 מ 'Na 2 HPO 4), נתרן פתרון 48 מ"ל פוספט monobasic (0.4 מ' Nah 2 PO 4), 8% מיליליטר תמיסת פורמלדהיד 500, 250 המ"ל מילי- ש DDI מים, ב-pH 7.4
HEPES נאגר מלוח של האנק עם יזיד נתרן (HBHS) - בג' / הליטר; 7.5 גרם NaCl, 0.3 גרם KCl, 0.06 גרם KH 2 4 ת.ד., 0.13 גרם Na 2 HPO 4, 2 גלוקוז גרם, 2.4 HEPES גרם, 0.05 גרם MgCl 2 6 חלקים H 2 O, 0.05 גרם MgSO 4 7 חלקים H 2 O, 0.165 גרם CaCl 2, 0.09 גר '3 במספר NaN pH 7.4
פתרון Wash (WS) - 1% כרך / כרך, גםmal סרום עיזים, 0.3% Triton X-100, בHBHS עם יזיד הנתרן (3 NaN). מקרר WS ב 4 ° C לפני השימוש בשלבים הבאים.
פתרון U2 SCA l דואר - 4 M אוריאה, 30% גליצרול ו -0.1% טריטון X-100 17
נוהל
כל הניסויים נעשו תחת פיקוחו של הטיפול בבעלי חי פרדו והשתמש ועדה ותכנית חי המעבדה באוניברסיטת Purdue.
1. כירורגיה
- שיטות ניתוחיות אספטיים שונות תואמות את השיטה היסטולוגית שהוצגה. השימוש במסגרת stereotaxic ומחדירים אוטומטיים מומלץ כדי לשפר את השחזור ובקרה של מערכי microelectrode (MEA) זווית השתלה ביחס למטוסי stereotaxic.
הערה: בהפגנה זו השיטה כירורגית שלנו היא כדלקמן: החזק את נושא המכרסם בearbars whil stereotaxicדואר בהרדמת isoflurane (בין% 1-3) בוצע על ידי חמצן רפואי כיתה. מבחן לחוסר בוהן קמצוץ משקף בחולדה או חוסר רפלקס קמצוץ זנב בעכבר כדי לאשר שהחיה היא מורדמת באופן מלא. החל משחת עיניים ולנקות את האתר כירורגית עם שלוש כביסות מתחלפות של פולידין ואתנול. לשטוף ידות, כפפות כירורגיות שחר, רשת שיער, facemask ושמלה. להזריק בולוס של לידוקאין כדי להרדים את אזור הניתוח, יוצר חתך בשימוש במספריים או קרום עצם אזמל, ברור עם מגרד עצם וapplicators כותנה, וליצור באמצעות craniotomy handpiece שיני מקדחה ומקדח. סע-שוק יחיד MEA לתוך קליפת המוח באמצעות micromanipulator. יש סיוע עוזר כירורגית בשמירת תנאים אספטיים ניתוח ולתעד את ההתקדמות של הניתוח.
- לאחר ההשתלה של MEA לתוך המוח, לאסוף תמונות דרך מיקרוסקופ ניתוחי להודיע הסרה הסופית של הגולגולת מרחבי bגשם. מנות מושתלות של ההתקנים תישמרנה באתר.
הערה: האוסף הסופי של רקמות עם התקנים באתרו מסתמך על התאמת המטוס של החדרת מכשיר באופן הדוק עם המטוס של חתך רקמות. הערות מפורטות על מטוס החדרת המכשיר יחסית למוח ולכן מאוד חשובות.
- לאחר השתלת מכשיר, תחול סיליקון אלסטומר Kwik-סיל (WPI), סביב כל חשוף MEA אנקס או כבלים, ולאפשר לריפוי. חתיכת פלסטיק מעוקר, כגון קצה פיפטה לחתוך, יכולה לשמש כדי לעזור מכיל סיליקון אלסטומר בקטן גם סביב craniotomy תוך ריפוי.
- להניח שכבה של שני חלקי אקריליק שיניים ("נוזלי ג'ט" ו" אבקת ג'ט "מלאנג שיניים) מעל Kwik-סיל וכל גולגולת חשופה.
הערה: בשלב מאוחר יותר, תהיה headcap נמסה דרך כדי לאפשר לשתל להיות מופרדיםמהגולגולת. אקריליק UV-ריפוי יש להימנע מעל Kwik-סיל וcraniotomy, כאקריליק מאוד קשה זה קשה להסיר מאוחר יותר. חומרים חזותיים אטומים סביב השתל צריכים להיות גם נמנעו; ברור Kwik-סיל מספק תצוגה של השתל במהלך השלבים הבאים של פרוטוקול זה.
- בצע נהלי טיפול לאחר הניתוח לפי הפרוטוקול המקומי של תקנות צער בעלי החיים, ולחזור לנושאים אמבולטוריים כלוב תיבות אחת בתוכם שכן.
2. זלוף ואוסף רקמות
הערה: ראה גייג' et al. לקבלת הדרכה מפורטת בהליך זלוף מודל חית חולדת 19.
- השתמש בהרדמה ופרוטוקול זלוף אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים של המוסד וועדת שימוש. לאחר הרדמה עמוקה המכרסם (אושר ע"י חוסר רפלקס בוהן קמצוץ בחולדה או רפלקס זנב צביטה בעכברים) וחושף את הלב, לבצע חתכים במספריים רדודיםלחדר השמאלי והעלייה ימנית. הכנס מחט בוטה לחדר השמאלי ולספק חדר טמפ PBS. לספק כולל של ~ 10 המ"ל PBS ב ~ 5 מ"ל / דקה בעכברים ו~ 200 המ"ל PBS ב ~ 100 מ"ל / דקה בחולדות. חפש פינוי דם מכבד במהלך.
- הזרק תוויות כימיות היסטולוגיה רלוונטיות transcardially, אם כך רצוי, על ידי מסירת מזרק בזהירות לנקוט כדי למנוע החדרת בועות.
הערה: תוויות כלי דם (למשל DiI) וצבעי counterstain חומצות גרעין (למשל, 33342 Hoechst) הן דוגמאות לתוויות כימיות תוצר במהלך זלוף. כאשר מנוהלים כראוי, הסמנים ההיסטולוגיים הללו צריכים לתייג את כל בעלי חי 20.
- לספק נאגרה, בטמפרטורת החדר, פורמלדהיד 4% transcardially לתקן את החיה. הימנע מניקוב מחיצה פני לב, שיכול להיות שמעיד ניקוז ריאת אף במהלך זלוף. חפש רעידות קיבעון בשרירים הגדוליםכדי לציין זלוף מלא. לספק כולל של 10 ~ מקבע מ"ל ב ~ 5 מ"ל / דקה בעכברים ומקבעים ~ 200 מ"ל ב ~ 100 מ"ל / דקה בחולדות.
- בעקבות זלוף, לערוף את החיה, חושף חלק מגזע המוח או המוח הקטן באמצעות rongeurs או מספריים, ואת הראש במקום 4% פורמלדהיד פתרון ללילה ב 4 ° C.
- שטוף את הראש בשלושה שינויים של PBS עם 1-4 מרווחי שעה בין כביסות.
- אחסן ראשים קבועים בHBHS המכיל נתרן יזיד ב 4 מעלות צלזיוס במשך ימים עד חודשים.
3. הסרת מוח עם התקנים באתרו
שים לב: ביצוע סעיף זה במנדף זמן לבש ציוד מגן אישי מתאים. הימנע מהתייבשות רקמות על ידי חזרת הראש הקבוע לHBHS פתרון מעת לעת.
- זהירות לנתח את העור ורקמות אחרות מרחבי כיפה אקריליק באמצעות מלקחיים ומספריים קטנים.
- אמנם לובש חום אניכפפות nsensitive, השתמשו מלחם להסיר אקריליק ולחשוף שיניים על שטח של בסיס ברור Kwik-סיל (איור 2 א).
הערה: מטרתו של שלב זה היא לאפשר למספרי מייקרו זווית מתאימה של גישה לעמדות שבו ההתקנים המושתלים נכנסים למוח, כך שרכיבי המוח מושתל יכולים להיות מופרדים מרכיבים המובטחים לגולגולת.
- תחת מיקרוסקופ ניתוחי, חתוך לאלסטומר סיליקון עם מספרי מייקרו מעוגלים, הסרת חתיכות קטנות של קוויק-סיל עם פינצטה עד למצב שבו המכשירים להזין את המוח.
- המשך חיתוך לאורך פני השטח של craniotomy עם מספרי מייקרו מעוקלים לרכיבי מכשיר נפרדים מצורפים לפוליסיליקון וגולגולת מהרכיבים המושתלים במוח. שוב להשתמש בהגדלת מיקרוסקופ וזהירות רבה בעת חיתוך דרך רכיבי המכשיר החשוף, מקפיד להתרחק דחיפה או גרירת השדlants ברקמה הקבועה.
- הסרת עצם סביב headcap עם טיפול באמצעות rongeurs. השתמש במרית כדי להפריד את המוח עם התקנים מושתלים מהגולגולת. אחסן את המוח בפתרון HBHS עד מוכן לפריסה.
- מניח את המוח בצלחת פטרי זכוכית מלאה HBHS, ולהשתמש בסכין גילוח להסרת רקמה מיותרת, כגון חוט שדרה, מוח קטן, או פקעת הרחה, תלויים אם הם רלוונטיים למיקום של השתלת המכשיר. השתמש בלוק מוח (טד פלה) וסכיני גילוח לסעיף במוח וליצור מישור שטוח התאמת הזווית של ההתקנים המושתלים באופן הדוק; זה נעשה על ידי נחת המוח בבלוק מוח בגודל המתאים,, את מכוון את המוח כך שכל חלק נראה של השתל הוא מקביל עם מדריך סכין הגילוח, והצבת סכין גילוח במדריך להב של לפחות 2 מ"מ מהשתל. לחץ על סכין הגילוח דרך הרקמות. משטחית זה לפלטפורמת vibratome. חלופותtively, סכין גילוח רכוב micromanipulator ניתן להשתמש בצורה מבוקרת באופן דומה כמו בלוק המוח כדי ליצור התאמת מטוס לכיוון של השתל באופן הדוק.
- מקום קרח תחת פלטפורמת vibratome, ולאחר שנתן למשטח הרקמה לבקצרה להתייבש על מגבת נייר, לדבוק מוח vibratome באמצעות דבק. דבק מטוס הרקמה השטוחה שנוצר בשלב הקודם הוא על הבמה. עם ממדי רקמות סימטריים, להתמצא במדגם כזה שהממד הרחב מודבק למטה מקביל לכיוון התנועה של להב vibratome כדי למנוע את הלהב פוטנציאלי מתדפק על הרקמות. אחרי שהדבק יתייבש (~ 1-2 דקות), להוסיף מצונן (~ 4 ° C) PBS למנת vibratome סביב הרקמה.
- איסוף פרוסות רקמות עבות בין 200-400 מיקרומטר, כולל רקמת שליטה, תוך שימוש בשיעור המרבי הרטט (~ 100 הרץ) וקצב התקדמות איטי להב (<0.2 מ"מ לשנייה), עם זווית להב של 10 מעלות מהוrizontal. איסוף פרוסות בזהירות בעזרת מרית או כף ומברשת חנות בHBHS בצלחת גם 24 ב 4 ° C.
- ברגע שהמכשיר באתרו הוא גלוי לעין בלתי מזוין או במיקרוסקופ ניתוחי, לאסוף חלקים רזים להתקרב למכשיר במרווחים פרוסים של 100 מיקרומטר או פחות.
הערה: סיליקון מייקרו שתלים אופייניים הם גלויים בעין בלתי המזוינת ברקמת פורמלדהיד קבועת מכרסם קליפת מוח בין 300 ל 500 מיקרומטר ממשטח המכשיר.
- עם המכשיר באתרו כעת קרוב אל פני השטח של הרקמה, לאסוף פרוסת רקמה> 250 מיקרומטר המכיל בתוך המכשיר. הערכת העובי הדרוש יכולה להיות בעזרת התייחסות פרוסות גבה.
הערה: מכשירים גדולים יותר, מכשירים והתקני multishank זווית עשויים לדרוש פרוסות עבות רקמות (> 500 מיקרומטר) כדי ללכוד את המכשיר בפיסת רקמה אחת; מחדש חבר שגם החדירה של תוויות מוחלות ועומק ההדמיה המיקרוסקופית תהיינה מוגבלות בסופו של דבר אוסף נתונים מהפרוסות עבות מאוד האלה. אם אפשר, להימנע מהתנגשות במכשיר עם להב vibratome, כמו זה יכול לגרום לגרירה של המכשיר דרך הרקמות ומורפולוגית העיוות.
4. עיבוד רקמות וסליקה
- שטוף את הפרוסות ב3x 5 דקות לשטיפה בHBHS
- הדגירה בborohydride נתרן (5 מ"ג NaBH 4/1 מ"ל של HBHS) לסך 30 דקות (15 דקות כל צד של הפרוסה). להעיף את הפרוסות בעזרת כף מייקרו מצופה טפלון או נירוסטה ומכחול קטן (טד פלה). תנועות איטיות ומהורהרות לשפר את ההצלחה של כל להעיף פרוסה. הימנע מלגעת באזורים סביב המכשיר המושתל במברשת. במידת ההאפשר, והוסיף באופן משמעותי יותר מאשר פתרון הנדרש (> 2 מ"ל) מאפשר לתמרן ולהפוך את פרוסות רקמות בקלות רבה יותר.
> שים לב: שלב זה מפחית אנדוגני autofluorescence; לדלג על שלב זה אם תוויות ניאון יושמו במהלך זלוף או סמנים מהונדסים XFP הם הווה.
- שטוף את הפרוסות ב3x 5 דקות לשטיפה בתמיסת שטיפה בטמפרטורת חדר.
הערה: במהלך תסיסת צעדים לשטוף ודגירה היא אופציונלית. החוקרים משערים כי עדין צורם של השתל הנוקשה ביחס לרקמות המוח עלול להתרחש בהתרגשות רבה. עם זאת, מיקסר הקפה נע בקצב עדין (<60 סל"ד) יכול למנוע זאת תוך הגדלת התנועה של פתרונות.
- חסום עבור 2 שעות בפתרון לשטוף בטמפרטורת חדר (פרוסות להעיף לאחר שעה אחת).
- דגירה בנוגדנים ראשוניים (דילול בפתרון Wash) לכ 48 שעות (24 שעות בכל צד של הפרוסה) ב 4 ° C.
- בצע 6 3 כביסות דקות מהירות עם פתרון לשטוף.
- בצע 6, 1 (3 כביסות hr לשטוףes בכל צד של פרוסת הרקמה) בפתרון Wash (חנות ב 4 ° C, אם כביסה למשך הלילה).
- דגירה בנוגדנים משניים (מדולל עם פתרון לשטוף) לכ 48 שעות (24 שעות בכל צד) ב4 ° C.
- בצע 6 3 כביסות דקות מהירות עם פתרון לשטוף.
- בצע 6, 1 כביסות hr (3 כביסות בכל צד) בפתרון לשטוף: חנות ב 4 ° C, אם כביסה בן הלילה.
- הסר לשטוף פתרון ולהוסיף את "U2 - דואר SCA l" גליצרול הפתרון המבוסס על סליקה. אפשר לנקות כ 1 שבוע לפרוסות עבות (250-500 מיקרומטר) או 2-3 שבועות לחלקי רקמה עבים מאוד (> 500 מיקרומטר) ב 4 ° C.
- לכסות בנייר כסף וצלחת חנות ב 4 ° C.
- הר בשקופיות האדיבות חלקי רקמה עבים (האיור 2b, 2c) באמצעות פתרון סליקה כתקשורת הרכבה ואיטום עם לק השקוף. חנות ב 4 ° C הרחק מאור.
5. פנורמה של הדמיה המלאה Tiממשק ssue והתקנים
- השימוש במיקרוסקופ יעדי מרחקים ארוכים יותר עובדים-(> 2 מ"מ), מתחיל הדמיה עם סריקת ליזר מיקרוסקופ confocal מיקרוסקופ או 2-פוטון. אנחנו נדגים עם Zeiss LSM 710, Carl Zeiss תוכנת "זן" (2010), ובמה ומתרגמת XY מבוקרת מחשב לתמונת פנורמת 3D סביב שתל.
הערה: נכון למקדם השבירה של פתרון הסליקה או בתוכנה, דרך צווארון מתקן במטרה, או בעיבוד נתונים לאחר איסוף. בהפגנה זו אנו נכנסים ערך מקדם שבירה לפתרון "U2" הסליקה של 1.4 לתוכנת מיקרוסקופ זן היקה; הגדרה זו מתאימה עדינות מרווחי z צעד כדי להסביר אי התאמת מקדם שבירה.
- ברקמה סמוך להתקן, בערך להעריך את חלון ההגדרות ונתוני ציר Z-המתאימות איסוף בZ-ממד לכל ערוץ באמצעות ניאון כוח ליזר נמוך (~ 0.5-5%) ומידות גדולות Z-צעד (> 25 מיקרומטר).
הערה: לכלול שטח נוסף מעל ומתחת בעת הגדרת ציר Z-בעת הגדרה לאיסוף נתונים פנורמי, כמו הרקמה לא יכולה לשקר לגמרי שטוחה בשקופית הזכוכית (~ 20 מיקרומטר לכל כיוון).
- הגדר את המטרה בxy מרכז פנורמת סופו של הדבר שלך, תוך שימוש בתוכנת פנורמת הזן, לקבוע את מספר עמדות איסוף נדרשות לכל ציר (x ו-y) כדי לכסות את האזור של עניין שלך.
- הערכה מחודשת ולסיים את חלון אוסף ציר Z-.
- להגדיר באופן ידני את רגישות הגלאי וכוח הליזר להגביר כראוי עם עומק גדל; המטרה היא בדרך כלל כדי לשמור בערך באותה עצמת תמונה ללא עומק הדמיה לתוך פרוסת הרקמה, אלא גם כדי למנוע רעש רקע גבוה.
- איסוף כל סדרת נתוני תמונת ניאון. במידת צורך, כדי למנוע חפיפת אותות, להפעיל קו ליזרשל רצף.
הערה: אם זמין, להגדיר את התוכנה באופן אוטומטי כדי לשמור את הנתונים בכונן הקשיח במהלך איסוף.
- לשנות את גדרות תוכנה לאיסוף "החזר" ונתונים "העברה", ושימוש בליזר רב יותר, חודר יותר אורך גל (633 ננומטר למשל) כדי ללכוד ערוצים אלה. לקבוע את כוח הליזר המתאים ורגישות גלאי ל" החזרה "ואוסף" העברה "ולחזור על אותה סדרת האוסף סביב המכשיר המושתל.
- לייצא את הנתונים לעיבוד מאוחר יותר, כימות, וניתוח.
Representative Results
MEAs מוח מושתל-ניתן לאסוף בפרוסות רקמה על ידי הפרדת רכיבים כלשהם גולגולת רכובה ראשונה ממרכיבי המוח המשובץ-. 2a האיור מציג את התוצאות של הסרת צד אחד של מלט headcap שיניים וחלק מKwik-סיל מקיף MEA כבל בגולגולת חולדה. מלחם רגיל מסיר מלט השיניים וKwik-סיל במנדף. הכבלים וכל מבנים שאינם מושתלים MEA-קוצצו הבאים עם מספרי מייקרו בחפירות באיטיות דרך Kwik-סיל מטה אל פני השטח של המוח הקבוע.
אחרי שחתך, תיוג, וניקוי רקמות, שקופיות פשוטות מחוייט שימושיות להרכבה על פרוסות רקמה העבות (האיור 2b). פרוסת מוח רכוב מכילה microdevice מושתל מוצגת באיור 2 ג. דימות באמצעות שני הצדדים של השקופית יכולה לאפשר לך להעריך את הממשק סביב מכשיר, כפי שמודגם באיור 3 (איור 3 א) והמיקרוגליאה יחד אתרים אלקטרודה ועקבות גלויים בצד השני (איור 3 ב).
ברגע שעלה, רקמה יכולה להיות צלמה באמצעות תרגום במת XY. סקירה של תוויות ניאון ברחבי פרוסות רקמות שלמות יכולה להיוצר בכל הרזולוציה הרצויה (איור 4). בחינה מפורטת של ממשק הרקמה נשמר מורפולוגית סביב microdevices המושתל ניתן לאסוף בהגדלה חזקה לניתוח של תגובת הרקמות המקומית (איור 5).
איור 1. ניתוחי מוח סקירה כללי של הליך. (AC) מייקרו שתל הם finalized בשכבת Kwik-סיל פולימר המקיף את המכשיר באופן מיידי, ולאחר מכן כיסוי בטון אקרילי. (ד, ה) המתת חסד להלן, שכבת אקריליק נשרפה, ורכיבי גולגולת רכובה של המכשיר מופרדים מרכיבים מושתלים על ידי חיתוך באמצעות סיליקון אלסטומר. (ו, ז) המוח אז הוסר מהגולגולת והוא חתך ועלה לבמת vibratome. (HK) פרוסות רקמות נאספות, כוללת פרוסת רקמה המכילה את המכשיר. (יב) רקמות אז יכולות להיות מעובד ורכובות בתאים מותאמים אישית למיקרוסקופיה המפורטת. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. () למחוק su סיליקון אלסטומר Kwik-סילrrounding כבל האלקטרודה מערך (חץ) נחשף על ידי שריפה את החלון בכיפת בטון השיניים בראש מכרסם perfused באמצעות מלחם. (ב) כדי להתאים את ההדמיה לכל צד של פרוסת רקמה עבה, פשוט "Slide-תאים" יכול להתבצע על ידי גזירת שקופיות פלסטיק ודבקות coverglass לכל צד סביב הרקמות והרכבת פתרון. (ג) פרוסת רקמת מוח חולדה עם שתל שלם (חץ אדום) מוצגת לאחר ההרכבה. כל הצד של הרקמה הוא במהירות נגיש להדמיה מיקרוסקופית עם ההגדרה הזאת. לקנה מידה, פנל (א) הוא 25 מ"מ לרוחב בתחתית, בעוד שפנלים (ב, ג) הם 80 מ"מ לרוחב בתחתית.
איור 3. Int המקסימאליZ-תחזיות של 40 ערימות של תמונות עבות מיקרומטר, ensity נאסף מסביב לחלק האחורי (א) ו (ב) מול מערך microelectrode מושתל. Microglia (מסומן עם אנטי Iba1 וAlexa פלואוריד 633, לבן) והחזרת אור ליזר (אדום), שנאספה מפני השטח של המכשיר, שצלמו ברצף משני הצדדים של פרוסת רקמה 400 מיקרומטר עבה. ככל שהשתלים במוח הם לעתים קרובות אטומים, גובר עם גישה אופטית לשני הצדדים מספק תצוגה ברורה של מבני שכותרתו "מאחורי רקמות" השתל ביחס למטרת מיקרוסקופ. 50 מיקרומטר סרגל קנה מידה.
איור 4. פרוסת DCHist מתויגת צלמה באמצעות שלב מבוקר מחשב בסריקת ליזר מיקרוסקופ confocal. (א) גרעין תא (מוכתם בHoechst 33342) וכן (ב) מונוציטים / מיקרוגליאה(מסומן באנטי Iba1) היו צלם במקביל בערוצים נפרדים. (ג) העברת אור וההחזרה היו גם נאספו, המראים את המיקום של השתל 4-השבוע ביחס לHoechst וIba1 נתונים. (ד) כיסוי של כל ערוצי שידור, אלא מצוין גם כן. אזור המלבן הלבן הרחיב בתמונות המופיעות בצד ימין. מ"מ היקף בר 1.
איור 5. שימוש במיקרוסקופ הבמה מבוקר מחשב ותוכנה מתאימה, נתוני הדמיה פנורמי ניתן לאסוף סביב השתל. החזרה () והעברה (ב) לאפשר לוקליזציה של המכשיר, בעוד תוויות נוגדנים או כימיות ניאון (ג, תיוג אנטי Iba1 של המיקרוגליאה ומקrophages) לאפשר הדמיה מפורטת של מרכיבי רקמות לאורך ממשק הרקמה השלמה. 200 מיקרומטר סרגל קנה מידה.
Discussion
שיטה "התקן-Capture היסטולוגיה" (DCHist) הפגינה כאן מאפשרת הערכה היסטולוגית הקרובה של אינטראקציות השתמרו מורפולוגית בין רקמת מוח ושתלי רקמות. אוסף רקמות DCHist דורש הפרדה זהירה של רכיבי מכשיר גולגולת רכובה מרכיבים המושתלים במוח. DCHist דורש גם אוסף של פרוסת רקמה היסטולוגית עבה (> 250 מיקרומטר). סעיפי רקמות אלה, שכותרתו פעם אחת, פינה, משובצים, והדמיה, יכולים לספק תובנה חדשות לפציעה או השתלת תגובה כרונית לאחר התקני שכינה. שימוש בכלים מתקדמים מיקרוסקופיה, בממשק בין רקמות ומכשיר יכול להיות צלם ונתח בפירוט גבוה כפי שמוצג במספרי 3-5.
את הטכניקות שהוצגו בצורתם הנוכחית מסתמכות על היכולת לחפור לאט headcap עשוי מבטון בשני חלקי שיניים וKwik-סיל עד לנקודה של השתלת מכשיר.ניצול מלט שיניים שניתן נשרף או אחר הוסר ואלסטומר סיליקון ברור שדרכו ניתן להנחות מספריים קטנים חזותי לסייע מאוד בהפרדת המכשיר המושתל בהצלחה ממרכיביה גולגולת רכובה. מנסה לחתוך את המכשיר תחת הגולגולת ומעל למוח על מנת לאסוף אותו באתרם אינו מומלץ, כמו שתל גולגולת הרכובה יהיה נשלף ממוח כמות משמעותית.
אמנם רזים שתלים, קטנים יותר, כגון MEAs סבך בודד מטכנולוגיות NeuroNexus, ניתנים ביותר DCHist, העקרונות אינם מוגבלים למכשיר אחד שאנקס או מערכי microelectrode. אוסף ואסטרטגיות הדמיה הם רחב החל על מכשירים רב סבך ושתלים גדולים יותר כגון cannulas, בדרישות להיות שהם חייבים להיות מופרדים מכל הר גולגולת ואספו בתוך קטע רקמה עבה. למרות שהכותבים מתמקדים בניתוח של רקמהשתלי קליפת מוח שמסביב, מכשירים המונעים עמוק יותר לתוך המוח יכולים גם להיות שנאספו וצלמו. עומק החדרת שתל לא אמור להשפיע על לכידתו של השתל בפרוסה ספקה המכשיר אינו חורג בפראות מהזווית הידועה של כניסה.
מגבלות קיימות ליישום היעיל של שיטת DCHist. חלקי רקמת המוח מאתגרים לתמונה באמצעות מאה מיקרומטרים, במיוחד באזורים של חומר לבן, אם כי פתרוני סליקה אופטיים יכולים לשפר מעמקי הדמיה ברקמות שונות 21 באופן משמעותי. כדי לשפר עוד יותר את עומק הדמיה, מיקרוסקופיה העירור שני פוטונים יכולה להיות מועסקת יחד עם הסליקה האופטית תארה.
מגבלה אפשרית נוספת של השיטה שתוארה יכולה להיות השיטות הספציפיות ניאון אימונוהיסטוכימיה ונוגדנים המועסקים על ידי חוקרים. דיפוזיה פסיבית בדרך כלל מניעה את השילוב של סמנים אלה דרך רקמות קבועותועל אתרי אנטיגן מחייבים. ריכוזים עובדים נוגדנים סופיים צריכים להיקבע על ידי חוקרים בכל מקרה לגוף על מנת למקסם את חדירת תווית תוך הימנעות רמות גבוהות של תיוג רקע. תיוג נוגדן לא צריך להיות משתנה בין פרוסות המעובדות באופן זהה, אך נוגדנים שונים עשויים להשתנות במידה ניכרת ביכולתם לחדור ולתייג אנטיגן שלהם, עם כמה נוגדני תיוג קלות אנטיגנים מאה רבות של מיקרומטר עמוקות ואחרים תיוג אנטיגנים רק עשרות של מיקרומטרים עמוקים. אנו מתארים שיפור דיפוזיה זו על ידי החלת תוויות נוגדנים בריכוזים גבוהים יותר מרגילים, לימים מרובים של יישום, ובתמיסה המכילות חומר ניקוי מהול וחסימה בסרום. מעת לעת מרפרף את הפרוסות גם מקדם אף תיוג. צעדי אחזור Antigen ותהליכי קיבעון חלופיים (glutaraldehyde, מיקרוגל, וכו 'למשל) עשויים להיות מתאימים לאנטיגנים ספציפיים. נוגדני fluoroch משניconjugates rome עשוי גם להשתנות בביצועים שלהם תיוג חלקים עבים, למרות שזה לא נצפה על ידי המחברים באמצעות תוויות Alexa פלואוריד מInvitrogen. לחלופין, נושאי בעלי חיים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון בסוגי התאים של עניין עשויים להיות מנוצלים כדי למנוע בעיות עם חדירת תווית נוגדנים, כמו חלבוני ניאון רבים, כגון eGFP, לשמור הקרינה שלהם לאחר טיפול פורמלדהיד, ועלול להיות מייד דמיינו בסעיפי רקמות.
DCHist היא קבוצה חזקה של טכניקות כדי ללכוד ולנתח את ההשפעה של microdevices מושתל ברקמת המוח. צימוד זה עם פרוטוקול היסטולוגית בהערכת vivo של איכות electrophysiology ונתוני עכבת אלקטרודה 22 יכול לשפר באופן משמעותי את הבנתנו את המקורות הביולוגיים של השתנות פיזיולוגיה והשפלה שלנו. התחום תותב עצבי מושתל בפרט עשוי ליהנות מDCHist ima המפורטגינג של ממשק שלמות המכשיר / רקמות להודיע פיתוח נוסף של מכשירי MEA ביולוגי ניטראליים.
Disclosures
המחברים אין גילויים רלוונטיים להכריז, כספי או אחר.
Acknowledgments
כל הניסויים נעשו תחת פיקוחו של הטיפול בבעלי חי פרדו והשתמש ועדה ותכנית חי המעבדה באוניברסיטת Purdue.
עבודה זו מומנה על ידי הגנת המחקר המתקדם פרויקטי הסוכנות (DARPA) Microsystems טכנולוגית המשרד (MTO), תחת חסותו של ד"ר ג'ק וו ג'ודי (jack.judy @ darpa.mil) כחלק מתכנית לטכנולוגיה העצבית האמינה, דרך החלל וחיל ים Warfare מערכות פיקוד (SPAWAR) מערכות המרכז (SSC) השקט גרנט מס N66001-11-1-4013.
המחברים מבקשים להודות למיכאל Slipchenko, דון מוכן, גרג ריכטר, אהרון טיילור, וקווין Eliceiri לשיתוף המומחיות המיקרוסקופית שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).
