Summary
هنا نقدم طريقة لالتقاط النسيجية، ووضع العلامات، وتطهير بصريا، والتصوير في أنسجة المخ واجهة سليمة حول الأجهزة بالغة الصغر مزروع مزمن في أنسجة المخ القوارض. النتائج من التقنيات تشمل هذه الطريقة مفيدة لفهم تأثير مختلف اختراق يزرع في الدماغ على الأنسجة المحيطة بها.
Abstract
البحث في تصميم واستخدام الأجهزة بالغة الصغر زرع المخ، مثل صفائف مسرى مكروي، ويهدف إلى إنتاج أجهزة ذات الصلة سريريا تلك الواجهة مزمنة مع الأنسجة المحيطة الدماغ. ويعتقد الأنسجة المحيطة زرع هذه للرد على وجود الأجهزة على مر الزمن، والذي يتضمن تشكيل "ندبة الدبقية" العازلة حول الأجهزة. ومع ذلك، عادة ما يتم إجراء التحليل النسيجي لهذه التغييرات بعد الأنسجة شرحا الجهاز، في عملية يمكن أن يعطل التشكل من الأنسجة من الاهتمام.
هنا علينا أن نبرهن على بروتوكول التي يتم جمعها القشرية-زرع الأجهزة المحيطة سليمة في نسيج المخ القوارض. ونحن تصف كيفية، مرة واحدة مع perfused مثبت، تتم إزالة العقول وشرائح في مثل هذه الطريقة لتجنب أجهزة شرحا. نحن الخطوط العريضة الفلورسنت وضع العلامات الأجسام المضادة وطرق تبادل المعلومات البصرية مفيدة لإنتاج إعلامي، والأنسجة السميكة حتى الآنالقسم. وأخيرا، علينا أن نبرهن على تركيب وتصوير هذه المقاطع الأنسجة من أجل التحقيق حول واجهة الأجهزة البيولوجية في الدماغ مزروع.
Introduction
مجال البحث neuroprosthetic يهدف إلى مساعدة الأفراد الذين يعانون من إعاقات مختلفة واضطرابات من خلال تجاوز الهياكل المريضة أو التالفة في الجسم عن طريق الجهاز العصبي المركزي تفاعل الأجهزة 1،2. ويمكن استخدام الأجهزة بالغة الصغر زرع المخ، مثل صفائف مسرى مكروي الأطراف، لتسجيل أو تحفيز الدماغ الهياكل، وبالتالي السماح بإنشاء واجهات طويلة الأجل بين الإلكترونيات والأنسجة CNS 3-5. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف اختراق والأجهزة التي يقودها في أنسجة المخ، تبشر سيما فيما ثنائية الاتجاه واجهات نظرا لقربها الوثيق داخل الأقطاب التي تقدم لمجموعة صغيرة نسبيا من الخلايا العصبية المجاورة 6.
ومع ذلك، معقدة نتيجة الاستجابات من غرس الأنسجة على المدى الطويل من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف اختراق، مما أدى في كثير من الأحيان في متغير والمهينة تدريجيا نسب الإشارة إلى الضوضاء الكهربية على مدى الأيام إلى شهور، وزيادة في imped الكهربائيةتعصب بين المواقع الكهربائي والأرض 7،8. أصول المفترضة لهذه التغيرات تشمل تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة، كثرة الخلايا النجمية على رد الفعل على طول الأجهزة بالغة الصغر، وفقدان أو هجرة الخلايا العصبية من الأنسجة المحيطة إلى الأجهزة مزروع 9-11. ومن التحديات الرئيسية لفهم هذه التغيرات النسيجية المزمنة حول الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الاختراق، هو صعوبة في التقاط البيانات النسيجية واجهة الأنسجة المحيطة سليمة الأجهزة مزروع المزمن 12. والتحليل النسيجي لأنسجة الجهاز مع واجهة / الأنسجة لا تزال موجودة على تحسين البروتوكولات الحالية إزالة الجهاز النسيجي. مع جهاز دون عائق المتبقية في الأنسجة، يمكن تصوير الأثر البيولوجي للتفاعلات خفية نسبيا، مثل استخدام الطلاء حيويا 13،14 أو المقاصة الكهربائية من سطح القطب 15،16، وتحليلها فيما يتعلق الزرع.
Hيحرث نحن يبرهن على وجود طريقة لجمع وتجهيز واجهة وصورة microdevice سليمة للتحليل المجهري القائمة المفصلة للأنسجة المخ المحيطة بها. في هذه الطريقة، يتم جمع الجهاز والأنسجة المحيطة الدماغ داخل قسم الأنسجة سميكة (> 250 ميكرون) باستخدام vibratome. لتحسين النسيجية اختراق في هذه التسمية شرائح سميكة، يتم تطبيق الفلورسنت التسميات النسيجية والمناعية في تركيزات عالية في محاليل تحتوي على مصل منع والمنظفات لأيام متعددة. يعمل حل المقاصة البصرية لتحسين التصوير المجهري أعماق، ويتم تحميل الأنسجة في الجانب 2-غرف ليزر متحد البؤر المجهر اللاحقة 17. لالتقاط واجهة كاملة النسيجية، يتم استخدام مرحلة الكمبيوتر التي تسيطر عليها أثناء التصوير متعدية لجمع Z-مكدس الإستعراضات على طول يزرع. بالإضافة إلى تطبيق التسميات النسيج التصوير، وجمع الانعكاس الليزر مرة أخرى من يزرعونقل الضوء من خلال مساعدة كل من الأنسجة تعريب واجهة الجهاز فيما يتعلق الأنسجة المحيطة. أعد استخدام هذا النسيج "جهاز التقاط علم الأنسجة" (DCHist) بروتوكول يوفر الوصول إلى التفاعلات التصوير الأنسجة / جهاز الحفاظ شكليا، ويحسن بالتالي على بروتوكولات جهاز إزالة السابقة النسيجية 18.
Protocol
حلول
التخزين المؤقت المالحة الفوسفات (PBS) - في غرام / لتر و 9 ز كلوريد الصوديوم، 0،144 ز KH 2 PO 4، 0،795 ز نا 2 HPO 4، في درجة الحموضة 7.4
4٪ فورمالديهايد - في مل / لتر؛ 202 مل حل ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (0.4 M نا 2 HPO 4)، 48 مل حل أحادى الفوسفات الصوديوم (0.4 M ناه 2 PO 4)، 500 مل محلول الفورمالديهايد 8٪، 250 مل الملة، س DDI المياه، في درجة الحموضة 7.4
التخزين المؤقت HEPES المالحة هانك مع أزيد الصوديوم (HBHS) - في غرام / لتر؛ 7.5 غ كلوريد الصوديوم، 0.3 ز بوكل، 0.06 غ KH 2 PO 4، 0،13 ز نا 2 HPO 4، 2 غرام السكر، 2.4 HEPES غرام، 0.05 غ MgCl 2 6 أجزاء H 2 O، 0.05 غ MgSO 4 7 أجزاء H 2 O، ز 0،165 CaCl 2، 0،09 ز نان 3 في درجة الحموضة 7.4
غسيل الحل (WS) - 1٪ المجلد / المجلد، كماالمال مصل الماعز، 0.3٪ تريتون X-100، في HBHS مع أزيد الصوديوم (نان 3). بردت WS في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام في الخطوات اللاحقة.
U2 هيئة السلع التموينية ل ه الحل - 4 M اليوريا، الجلسرين 30٪ و 0.1٪ تريتون X-100 17
PROCEDURE
وقد أجريت جميع التجارب تحت إشراف ورعاية الحيوان واللجنة بوردو الاستخدام وبرنامج الحيوان المعملية في جامعة بوردو.
1. جراحة
- مختلف الطرق الجراحية العقيم متوافقة مع أسلوب عرض النسيجية. ويوصى باستخدام إطار التجسيمي وinserters الآلي لتحسين إمكانية استنساخ والسيطرة على صفائف مسرى مكروي (MEA) زاوية غرس فيما يتعلق طائرات التجسيمي.
ملاحظة: في هذه المظاهرة لدينا وسيلة جراحية هي كما يلي: الاستمرار على الموضوع القوارض في whil earbars التجسيميه تحت التخدير isoflurane (بين٪ 1-3) الأكسجين التي يحملها الصف الطبية. اختبار لعدم وجود قرصة أخمص القدمين تعكس في الفئران أو عدم وجود الذيل منعكس قرصة في الماوس للتأكد من أن الحيوانات للتخدير الكامل. تطبيق مرهم العين وتنظيف الموقع الجراحية مع ثلاثة من يغسل بالتناوب Betadine والايثانول. غسل اليدين، والقفازات الجراحية الفجر، hairnet، قناع وثوب. حقن بلعة من يدوكائين لتخدير منطقة العمليات الجراحية، وخلق شق باستخدام مقص أو مشرط، السمحاق واضحة مع مكشطة العظام وتطبيقها والقطن، وإنشاء حج القحف باستخدام قبضة حفر الأسنان وقمة الحفر. قيادة MEA احد عرقوب في القشرة باستخدام مياداة مجهرية. لديك المساعدات مساعد الجراحية في الحفاظ على ظروف معقمة وجراحة توثيق التقدم المحرز في عملية جراحية.
- بعد زرع MEA في الدماغ، وجمع الصور من خلال الميكروسكوب الجراحي للإعلام في نهاية المطاف إزالة الجمجمة من مختلف أنحاء بالمطر. سيتم الحفاظ أجزاء مزروع من الأجهزة في الموقع.
ملاحظة: في نهاية المطاف مجموعة من الأنسجة مع الأجهزة في الموقع يعتمد على مطابقة عن كثب طائرة من الإدراج الجهاز مع الطائرة من باجتزاء الأنسجة. ملاحظات تفصيلية حول الجهاز الطائرة الإدراج نسبة إلى الدماغ وبالتالي هي مهمة جدا.
- بعد زرع الجهاز، تطبيق السيليكون المطاط الصناعي كويك سيل (WPI)، حول أي السيقان المكشوفة أو كابلات MEA، والسماح لعلاج. قطعة بلاستيكية معقمة، مثل قطع تلميح ماصة، قد يتم استخدامها للمساعدة في احتواء المطاط الصناعي السيليكون في الصغيرة جيدا في جميع أنحاء حج القحف بينما علاج.
- تطبيق طبقة من جزء اثنين والاكريليك الأسنان ("جت السائل" و "جت مسحوق" من الأسنان لانغ) خلال كويك سيل وأي الجمجمة عرضة للخطر.
ملاحظة: في خطوة لاحقة، سيتم ذاب مترسة الرأس من خلال السماح لزرع يمكن فصلهامن الجمجمة. وينبغي تجنب الأشعة فوق البنفسجية علاج الاكريليك على كويك سيل وحج القحف، وهذا من الصعب جدا الاكريليك من الصعب إزالة في وقت لاحق. وينبغي أيضا مواد مبهمة بصريا حول زرع تجنبها؛ واضحة كويك سيل يوفر إطلالة على زرع خلال الخطوات اللاحقة من هذا البروتوكول.
- تنفيذ إجراءات الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية وفقا لبروتوكول المحلي لوائح الرفق بالحيوان، والعودة إلى المواضيع الإسعافية واحد يضم صناديق القفص.
2. ونضح الأنسجة كوكتيل
ملاحظة: انظر غيج وآخرون. للحصول على إرشادات مفصلة نضح الداخلي في الفئران نموذج حيواني 19.
- استخدام التخدير والتي وافقت عليها بروتوكول نضح رعاية الحيوانات المؤسسة واللجنة الاستخدام. بعد تخدير عميق ومكافحة القوارض (أكدت بسبب عدم وجود إصبع القدم قرصة منعكس في الفئران أو الذيل قرصة منعكس في الفئران) وتعريض القلب، إجراء تخفيضات مقص الضحلة فيإلى البطين الأيسر والأذين الأيمن. اضافة الى وجود إبرة حادة إلى البطين الأيسر وتسليم الغرفة TEMP PBS. تقديم ما مجموعه 10 مل PBS ~ ~ 5 في مل / دقيقة في الفئران و~ 200 مل PBS في ~ 100 مل / دقيقة في الفئران. البحث عن تطهير الدم من الكبد خلال.
- حقن التسميات الكيميائية ذات الصلة تشريحيا transcardially، إذا رغبت في ذلك، عن طريق التسليم المحاقن مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات.
ملاحظة: التسميات الأوعية الدموية (مثل مبادرة ديزرتك الصناعية) وحمض النووي الأصباغ ملون مباين (مثل هويشت 33342) هي أمثلة على التسميات الكيميائية تسليم خلال نضح. عندما تدار بشكل صحيح، يجب تسمية هذه العلامات النسيجية كل الحيوانات 20.
- تقديم مخزنة درجة حرارة الغرفة، والفورمالدهايد 4٪ transcardially لإصلاح الحيوان. تجنب ثقب الحاجز عبر القلب، والتي يمكن يتضح من الرئة الأنف الصرف خلال نضح. البحث عن الهزات التثبيت في العضلات الكبيرةللإشارة نضح كاملة. تقديم ما مجموعه 10 مل مثبت ~ ~ 5 في مل / دقيقة في الفئران و~ 200 مل مثبت في ~ 100 مل / دقيقة في الفئران.
- بعد نضح، قطع رأس الحيوان، تعرض جزء من جذع الدماغ أو المخيخ أو باستخدام مقص قراضة، ورئيس المركز في محلول الفورمالديهايد 4٪ بين عشية وضحاها في لC. ° 4
- غسل الرأس في ثلاثة تغييرات من PBS مع فترات 1-4 ساعة بين يغسل.
- تخزين رؤساء الثابتة في HBHS تحتوي على أزيد الصوديوم في C ° 4 أيام إلى شهور.
3. إزالة الدماغ مع الأجهزة في الموقع
ملاحظة: إجراء هذا القسم في غطاء الدخان في حين يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة. تجنب جفاف الأنسجة من خلال العودة إلى الرأس ثابت HBHS الحل بشكل دوري.
- تشريح بعناية بعيدا الجلد والأنسجة الأخرى من جميع أنحاء غطاء الجمجمة باستخدام ملقط والاكريليك مقص صغير.
- في حين يرتدي الحرارة-Iقفازات nsensitive، استخدم حام الحديد لإزالة الاكريليك الأسنان وفضح مساحة الكامنة واضحة كويك سيل (الشكل 2A).
ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو السماح الدقيقة مقص زاوية مناسبة من حيث الوصول إلى المناصب الأجهزة مزروع دخول الدماغ، بحيث يمكن فصل مكونات الدماغ مزروع من مكونات لتأمين الجمجمة.
- تحت المجهر الجراحي، قطع المطاط الصناعي في سيليكون مع مقص منحني الصغيرة، وإزالة قطع صغيرة من كويك سيل مع ملاقط إلى المركز حيث تدخل الأجهزة الدماغ.
- مواصلة قطع على طول سطح حج القحف مع مقص منحني الدقيقة لمكونات الجهاز البولي سيليكون منفصلة تعلق على الجمجمة من مكونات وزرعها في الدماغ. استخدام مرة أخرى التكبير المجهر وعناية كبيرة عند قطع من خلال مكونات الجهاز المكشوفة، مع الحرص على تجنب دفع أو سحب عفريتlants في الأنسجة الثابتة.
- إزالة العظام في جميع أنحاء مترسة الرأس بعناية باستخدام قراضة. استخدام ملعقة لفصل الدماغ مع الأجهزة مزروع من الجمجمة. تخزين الدماغ في حل HBHS حتى على استعداد لشريحة.
- وضع الدماغ في طبق بتري زجاجية مملوءة HBHS، واستخدام شفرة حلاقة لإزالة الأنسجة الدخيلة، مثل النخاع الشوكي، المخيخ، أو البصلة الشمية، اعتمادا على ما إذا كانت ذات صلة إلى موقع غرس الجهاز. استخدام كتلة الدماغ (تيد بيلا) وشفرات الحلاقة لقسم المخ وإنشاء مسطح الطائرة عن كثب مطابقة زاوية من الأجهزة مزروع؛ ويتم إنجاز هذا عن طريق وضع الدماغ في كتلة الدماغ بشكل مناسب الحجم، وتوجيه الدماغ مثل أن أي الجزء المرئي من زرع هو بالتوازي مع الحلاقة دليل شفرة، ووضع شفرة حلاقة في دليل شفرة لا يقل عن 2 ملم من الزرع. اضغط على شفرة حلاقة من خلال الأنسجة. تحميل هذا السطح إلى منصة vibratome. ALTERNAأيدي العاملة، التي شنت شفرة حلاقة لمياداة مجهرية يمكن استخدامها بطريقة تخضع للمراقبة وبالمثل كما كتلة الدماغ لإنشاء طائرة تتطابق إلى حد بعيد اتجاه الزرع.
- مكان الجليد تحت منصة vibratome، وبعد السماح للسطح الأنسجة لتجف لفترة وجيزة على منشفة ورقية، والتمسك الدماغ إلى vibratome باستخدام الغراء سوبر. الغراء الطائرة الأنسجة شقة التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة هو المسرح. مع أبعاد الأنسجة غير المتماثلة، توجيه العينة بحيث يتم لصقها على أوسع نطاق البعد أسفل بالتوازي مع اتجاه حركة شفرة vibratome للمساعدة في تجنب النصل يطرق يحتمل أكثر من الأنسجة. بعد غروب الغراء (~ 1-2 دقيقة)، إضافة المبردة (~ 4 ° C) PBS إلى الطبق vibratome حول الأنسجة.
- جمع شرائح الأنسجة سميكة بين 200-400 ميكرون، بما في ذلك الأنسجة السيطرة، وذلك باستخدام معدل الاهتزاز الأقصى (~ 100 هرتز) وتقدم شفرة بطء معدل (<0.2 مم في الثانية)، مع زاوية شفرة من 10 ° هو منrizontal. جمع شرائح بعناية مع ملعقة أو مغرفة فرشاة وتخزينها في HBHS في 24 لوحة جيدا في 4 درجات مئوية.
- وبمجرد أن الجهاز في الوضع الطبيعي يكون مرئيا بالعين المجردة لأو الميكروسكوب الجراحي، وجمع أقسام أرق من الاقتراب من الجهاز بزيادات شريحة من 100 ميكرون أو أقل.
ملاحظة: نموذجي السيليكون الصغيرة يزرع مرئية بالعين المجردة مع الفورمالديهايد في الأنسجة الثابتة القوارض قشرة الدماغ ما بين 300 و 500 ميكرومتر من سطح الجهاز.
- مع الجهاز في الوضع الطبيعي الآن إغلاق إلى سطح النسيج، وجمع شريحة الأنسجة> 250 ميكرون يحتوي الجهاز داخل. يمكن بمساعدة تقدير سمك اللازمة عن طريق الرجوع شرائح التي تم جمعها سابقا.
ملاحظة: قد أكبر الأجهزة، أجهزة multishank، والأجهزة الزاوية تتطلب شرائح الأنسجة سمكا (> 500 ميكرون) لالتقاط الجهاز في قطعة نسيج واحد؛ إعادة الأعضاء التي ستقتصر على حد سواء اختراق التسميات التطبيقية والتصوير المجهري عمق في جمع البيانات في نهاية المطاف من هذه شرائح سميكة جدا. إذا كان ذلك ممكنا، وتجنب ضرب الجهاز مع شفرة vibratome، لأن هذا يمكن أن يسبب سحب الجهاز من خلال تشوه النسيج والصرفية.
4. معالجة الأنسجة والمقاصة
- غسل 3X شرائح في 5 دقائق في غسل في HBHS
- احتضان في بوروهيدريد الصوديوم (5 ملغ NABH 4/1 مل من HBHS) لإجمالي 30 دقيقة (15 دقيقة لكل جانب من شريحة). الوجه شرائح باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ أو تفلون المغلفة ملعقة صغيرة والرسام الصغير (تيد بيلا). حركات بطيئة ومدروسة تحسين نجاح كل شريحة الوجه. تجنب لمس أي المناطق المحيطة الجهاز مزروع مع الفرشاة. عندما يكون ذلك ممكنا، مضيفا حل أكثر بكثير من المطلوب (> 2 مل) يسمح احد لمعالجة الوجه وشرائح الأنسجة بسهولة أكبر.
> ملاحظة: هذه الخطوة يقلل الذاتية تألق ذاتي؛ تخطي هذه الخطوة إذا طبقت التسميات الفلورسنت خلال نضح أو علامات المعدلة وراثيا XFP موجودة.
- غسل 3X شرائح في 5 دقائق في محلول الغسيل في غسل في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الانفعال خلال خطوات غسل والحضانة اختيارية. ويخمن المؤلفون بأنه خفية التنافر من زرع شديدة فيما يتعلق أنسجة المخ المحيطة قد تحدث مع الانفعالات. ومع ذلك، قد خلاط المدارية تتحرك بمعدل طيف (<60 دورة في الدقيقة) تجنب هذا مع زيادة حركة الحلول.
- منع لمدة 2 ساعة في محلول الغسيل في درجة حرارة الغرفة (شرائح الوجه بعد ساعة واحدة).
- احتضان في الأجسام المضادة الأولية (مخففة في محلول الغسيل) لحوالي 48 ساعة (24 ساعة على كل جانب من الشريحة) في C. ° 4
- 6 يغسل أداء سريع مع حد أدنى 3 الحل يغسل.
- أداء 6، 1 ساعة يغسل (3 غسلوفاق على كل جانب من الشريحة الأنسجة) في محلول الغسيل (المتجر في 4 درجات مئوية خلال الليل إذا الغسيل).
- احتضان في الأجسام المضادة الثانوية (مخفف مع محلول الغسيل) لحوالي 48 ساعة (24 ساعة على كل جانب) في C. ° 4
- 6 يغسل أداء سريع مع حد أدنى 3 الحل يغسل.
- أداء 6، 1 ساعة يغسل (3 يغسل على كل جانب) في محلول الغسيل؛ المحل في 4 درجات مئوية إذا غسل يلة وضحاها.
- إزالة الحل اغسل وإضافة الجلسرين على أساس "U2 - هيئة السلع التموينية ل ه" حل المقاصة. السماح لمسح ما يقرب من 1 في الاسبوع لشرائح سميكة (250-500 ميكرون) أو 2-3 أسابيع لأقسام الأنسجة سميكة جدا (> 500 ميكرون) في C. ° 4
- مع لوحة غطاء احباط وتخزينها في C. ° 4
- تحميل الشرائح في استيعاب أقسام الأنسجة سميكة (الشكل 2B، 2C) باستخدام محلول تطهير وسائل الإعلام تصاعد وختم مع طلاء الأظافر واضحة. المحل في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
5. بانوراما التصوير من تي كاملةssue وجهاز واجهة
- استخدام أطول مسافة المجهر أهداف العمل (> 2 مم)، وتبدأ التصوير مع ليزر متحد البؤر المسح الضوئي المجهر أو الميكروسكوب 2-الفوتون. سوف نظهر مع LSM زايس 710، كارل زايس "زين" البرمجيات (2010)، ومرحلة XY الكمبيوتر التي تسيطر عليها ترجمة لصورة بانوراما 3D حول وجود الزرع.
ملاحظة: تصحيح لمعامل الانكسار من الحل إما تطهير في مجال البرمجيات، من خلال طوق التصحيحية على الهدف، أو في معالجة البيانات بعد جمعها. في هذا التظاهرة التي قمنا بإدخال قيمة معامل الانكسار من أجل حل "U2" المقاصة من 1.4 في المجهر لايكا البرمجيات زن؛ هذا الإعداد بضبط بمهارة Z-الخطوة فترات لحساب عدم تطابق معامل الانكسار.
- في الأنسجة قرب الهاتف، وتقييم ما يقرب من المناسب جمع البيانات ونافذة Z-المحور الإعدادات في Z-البعد عن كل قناة الفلورسنت باستخدام الليزر منخفض الطاقة (~ 00،5 حتي 5٪) والكبيرة Z-الخطوة الأحجام (> 25 ميكرون).
ملاحظة: تشمل مساحة إضافية فوق وتحت عند تعيين Z-المحور عند إعداد بانورامية لجمع البيانات، والأنسجة قد لا الاستلقاء تماما على زجاج الشريحة (~ 20 ميكرون كل اتجاه).
- تعيين الهدف في مركز بانوراما من XY الخاص في نهاية المطاف، واستخدام برنامج بانوراما زن، تحديد عدد المناصب المطلوبة لجمع كل محور (x و y) لتغطية المنطقة اهتمامك.
- إعادة تقييم ووضع الصيغة النهائية للإطار جمع Z-المحور.
- يدويا تعيين حساسية كاشف وقوة الليزر لرفع مناسب مع عمق زيادة، والهدف من ذلك هو عادة للحفاظ على ما يقرب من كثافة الصورة نفسها بغض النظر عن عمق التصوير في شريحة الأنسجة، ولكن أيضا لتجنب ارتفاع ضجيج في الخلفية.
- جمع كل الفلورسنت سلسلة بيانات الصورة. إذا لزم الأمر لتجنب التداخل إشارات، تشغيل خط ليزرق بشكل تسلسلي.
ملاحظة: إذا كان متوفرا، تعيين البرنامج لحفظ البيانات تلقائيا على القرص الصلب أثناء جمع.
- تغيير إعدادات البرنامج لجمع "الانعكاس" و "النفاذية" البيانات، واستخدام أطول وأكثر الليزر الطول الموجي مخترق (على سبيل المثال 633 نانومتر) لالتقاط هذه القنوات. تحديد قوة الليزر المناسبة للكشف عن الحساسية ول "الانعكاس" و "النفاذية" جمع وتكرار نفس المجموعة حول سلسلة الجهاز المزروع.
- تصدير البيانات للمعالجة في وقت لاحق، الكمي، والتحليل.
Representative Results
ويمكن جمع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الدماغ مزروع في شرائح الأنسجة عن طريق فصل الأول أي مكونات الجمجمة محمولة من مكونات الدماغ المضمنة. 2A الشكل يظهر نتائج إزالة جانب واحد من الاسمنت الأسنان مترسة الرأس وجزء من كويك سيل المحيطة برقية MEA على جمجمة الفئران. تم استخدام الحديد لحام لإزالة الأسنان والاسمنت كويك سيل في غطاء الدخان. وقطعت كابلات المقبل وأي غير مزروع الهياكل MEA مع الدقيقة مقص من حفر ببطء من خلال كويك سيل وصولا الى سطح الدماغ ثابتة.
بعد تشريح، ووضع العلامات، وتطهير الأنسجة وبسيطة حسب الطلب الشرائح هي مفيدة لتركيب شرائح الأنسجة سميكة (الشكل 2B). ويرد شريحة الدماغ شنت تحتوي على microdevice مزروع في الشكل 2C. يمكن من خلال التصوير جانبي الشريحة تسمح لك لتقييم واجهة الجهاز حول، كما هو موضح في الشكل (3) (الشكل 3A) والخلايا الدبقية الصغيرة على طول القطب مواقع وآثار واضحة على الجانب الآخر (الشكل 3B).
شنت مرة واحدة، يمكن تصويرها باستخدام الأنسجة مرحلة الترجمة XY. يمكن أن تتولد لمحات عامة من التسميات عبر شرائح الأنسجة الفلورسنت كامل في القرار المطلوب (الشكل 4). ويمكن جمع دراسة تفصيلية من واجهة الأنسجة الحفاظ شكليا حول الأجهزة بالغة الصغر مزروع تحت التكبير عالية لتحليل استجابة الأنسجة المحلية (الشكل 5).
الشكل 1. نظرة عامة الداخلي. (AC) الدماغ جراحات زرع الصغيرة هي الاتحاد الدولي للسباحةيتبع lized بطبقة من البوليمر كويك سيل المحيطة فورا الجهاز، عن طريق تغطية الاسمنت الاكريليك. (د، ه) القتل الرحيم وبعد، يتم حرق طبقة الاكريليك بعيدا، ويتم فصل الجمجمة محمولة على مكونات الجهاز من مكونات مزروع من خلال قطع المطاط الصناعي السيليكون. (و، ز) ثم تتم إزالة الدماغ من الجمجمة وقطع وشنت إلى مرحلة vibratome. (هونج كونج) يتم جمع شرائح الأنسجة، بما في ذلك الأنسجة التي تحتوي على شريحة الجهاز. يمكن (ل) ثم تتم معالجة الأنسجة والتي تقام في غرف مخصصة للفحص المجهري تفصيلا. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2 (أ) حذف كويك سيل سو الاستومر سيليكونrrounding كبل كهربائي مصفوفة (السهم) تعرضت عن طريق حرق بعيدا نافذة في سقف الاسمنت الأسنان على رأس القوارض perfused باستخدام حام الحديد. (ب) لاستيعاب التصوير في جانبي شريحة الأنسجة سميكة وبسيطة "تنزلق للغرف" يمكن أن تدلي بها قطع شريحة من البلاستيك والالتزام ساترة إلى أي من الجانبين في جميع أنحاء الأنسجة وتصاعد الحل. (ج) ويرد أنسجة المخ الفئران مع شريحة زرع سليمة (السهم الأحمر) بعد التركيب. جانبي الأنسجة يمكن الوصول بسرعة إلى التصوير المجهري مع هذا الإعداد. لمقياس، لوحة (أ) هو 25 ملم عبر في القاع، بينما لوحات (ب، ج) هي 80 ملم عبر في الأسفل.
الشكل 3. الحد الأقصى الباحثensity Z-التوقعات من 40 ميكرومتر سميكة مداخن صورة، جمعها حول المؤخر (أ) والاستقبال (ب) من مجموعة مسرى مكروي مزروع. تم تصوير بالتسلسل الخلايا الدبقية الصغيرة (المسمى مع Iba1 المضادة للطائرات واليكسا فلور 633، البيضاء) وضوء الليزر الانعكاس (الحمراء)، التي تم جمعها من سطح الجهاز، من كلا الجانبين من شريحة 400 ميكرومتر سميكة الأنسجة. كما يزرع الدماغ وغالبا ما تكون مبهمة، وتصاعد مع وصول البصرية لكلا الجانبين يوفر رؤية واضحة للهياكل الأنسجة المسمى "وراء" زرع فيما يتعلق الهدف المجهر. مقياس بار 50 ميكرومتر.
الشكل 4. شريحة DCHist المسمى تصوير باستخدام الكمبيوتر التي تسيطر عليها المرحلة على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر. (أ) نوى الخلايا (ملطخة هويشت 33342) و (ب) حيدات / الخلايا الدبقية الصغيرةتم تصوير في وقت واحد (المسمى مع Iba1 مكافحة) على قنوات منفصلة. كما تم جمع (ج) نقل وضوء الانعكاس، والتي تبين مكان زرع لمدة 4 أسابيع فيما يتعلق هويشت والبيانات Iba1. (د) ويظهر أيضا من تراكب جميع القنوات ولكن انتقال العدوى. يتم توسيع منطقة المستطيل الأبيض في الصور التي تظهر على اليمين. مقياس شريط 1 مم.
الشكل 5. باستخدام المجهر مرحلة الكمبيوتر التي تسيطر عليها والبرامج المناسبة، يمكن جمع بيانات التصوير البانورامي حول الزرع. الانعكاس (أ) والنفاذية (ب) تسمح توطين الجهاز، في حين الفلورسنت أو الأجسام المضادة الكيميائية التسميات (ج، ومكافحة Iba1 توسيم الخلايا الدبقية الصغيرة وماكrophages) يسمح التصوير مفصل لمكونات النسيج على طول واجهة الأنسجة سليمة. مقياس بار 200 ميكرومتر.
Discussion
"جهاز التقاط علم الأنسجة" (DCHist) الأسلوب أظهر هنا يمكن من تقييم وثيقة النسيجي للتفاعلات بين الحفاظ شكليا أنسجة المخ وزرع الأنسجة. DCHist جمع الأنسجة يتطلب فصل دقيق للمكونات الجهاز الجمجمة محمولة من عناصر مزروع في الدماغ. DCHist يتطلب أيضا مجموعة من شريحة سميكة الأنسجة النسيجية (> 250 ميكرون). هذه المقاطع الأنسجة، وصفت مرة واحدة، مسح، التي شنت، والمصورة، ويمكن تقديم رؤى جديدة في زرع إصابة مزمنة أو استجابة لاحقة لأجهزة الساكن. باستخدام أدوات متقدمة المجهري، يمكن تصوير واجهة الجهاز وبين الأنسجة وتحليلها بالتفصيل عالية كما هو مبين في الأرقام 3-5.
التقنيات المعروضة في شكلها الحالي تعتمد على القدرة على حفر ببطء بعيدا مترسة الرأس المصنوعة من الاسمنت الأسنان جزئين وكويك سيل لأسفل إلى حد زرع الجهاز.استخدام الاسمنت الأسنان التي يمكن نسخها أو إزالتها بعيدا خلاف ذلك واضحا من خلال المطاط الصناعي السيليكون التي يمكن أن تسترشد مقص صغير بصريا تساعد بشكل كبير في فصل الجهاز بنجاح مزروع من مكونات الجمجمة محمولة على الخمسين. محاولة لقطع الجهاز تحت الجمجمة والدماغ أعلاه من أجل لأنه جمع في الموقع لا ينصح، كما سيتم سحب زرع الجمجمة محمولة من الدماغ كمية كبيرة.
على الرغم من أرق وأصغر حجما يزرع، مثل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف عرقوب واحدة من تقنيات NeuroNexus، هي الأكثر قابلية لDCHist، لا تقتصر على المبادئ السيقان جهاز واحد أو صفائف مسرى مكروي. جمع واستراتيجيات قابلة للتطبيق على نطاق واسع التصوير لأجهزة متعددة وساق أكبر يزرع مثل القنيات، مع متطلبات يجب أن يجري فصلهم عن أي جبل الجمجمة والتي تم جمعها خلال قسم الأنسجة سميكة. على الرغم من أن الكتاب يركز على تحليل الأنسجةيزرع القشرية المحيطة بها، يمكن أن أجهزة مدفوعة أعمق في الدماغ أيضا يتم جمع وتصوير. يجب عمق الإدراج لن يؤثر على زرع القبض على زرع شريحة في تقديم الجهاز لا تحيد بصورة عشوائية من زاوية معروفة من الإدراج.
القيود موجودة إلى تطبيق مفيد للأسلوب DCHist. أقسام أنسجة المخ تشكل تحديا لصورة من خلال مئات ميكرومتر، وخاصة في مجالات المادة البيضاء، على الرغم من حلول المقاصة البصرية يمكن أن تحسن كثيرا في أعماق التصوير الأنسجة المختلفة 21. لمزيد من تحسين عمق التصوير، قد تكون استخدمت ثنائي الفوتون المجهري الإثارة مع المقاصة البصرية وصفها.
يمكن الحد من إمكانات أخرى الطريقة الموضحة تكون محددة الطرق المناعية والأجسام المضادة المستخدمة الفلورسنت من قبل الباحثين. نشر السلبي يدفع عادة إدماج هذه العلامات من خلال الأنسجة الثابتةوعلى مواقع مستضد ملزمة. يجب تحديد تركيزات النهائي الأجسام المضادة من قبل الباحثين العاملين على أساس كل حالة على حدة لتحقيق أقصى قدر من الاختراق التسمية مع تجنب وضع العلامات مستويات عالية من الخلفية. يجب وضع العلامات الأجسام المضادة لا تكون متغيرة بين شرائح التي يتم معالجتها بشكل مماثل، ولكن الأجسام المضادة مختلفة قد تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها على اختراق وعلامة مستضد فيها، مع بعض الأجسام المضادة وصفها بسهولة مستضدات عدة مئات من ميكرومتر العميقة وغيرها وصفها مستضدات عشرات فقط من ميكرومتر عميقة. وصفنا تحسين هذا الانتشار من خلال تطبيق تسميات الأجسام المضادة في تركيزات أعلى من العادية، لأيام متعددة من التطبيق، و. في محلول يحتوي على المنظفات ومنع تمييع الدم التقليب دوري شرائح يعزز أيضا وضع العلامات حتى. قد الخطوات استرجاع مستضد وعمليات التثبيت البديلة (مثل غلوتارالدهيد، والموجات الدقيقة، الخ) تكون مناسبة لمستضدات معينة. الأجسام المضادة الثانوية fluorochقد تقارن روما تختلف أيضا في أدائها وصفها أبواب سميكة، على الرغم من هذا لم يلاحظ من قبل المؤلفين باستخدام اليكسا فلور من التسميات إينفيتروجن. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المواد المعدلة وراثيا الحيوانية معربا عن البروتينات الفلورية في أنواع الخلايا التي تهم تجنب المشاكل مع اختراق الأجسام المضادة التسمية، والبروتينات الفلورية كثيرة، مثل EGFP، في الحفاظ على مضان بهم بعد العلاج والفورمالديهايد، وربما يمكن تصور مباشرة في أقسام الأنسجة.
DCHist هو مجموعة قوية من تقنيات التقاط وتحليل أثر على الأجهزة بالغة الصغر زرع أنسجة المخ. يمكن توصيل هذا البروتوكول النسيجي في الجسم الحي مع تقييم جودة البيانات ومقاومة الكهربية الكهربائي 22 تحسن كثيرا فهمنا للمصادر البيولوجية تقلب علم وظائف الأعضاء وتدهورها. قد مجال زرع الأجهزة التعويضية العصبية على وجه الخصوص الاستفادة من معهد العالم العربي DCHist مفصلةجينج من واجهة الجهاز / الأنسجة سليمة لإعلام مواصلة تطوير الأجهزة MEA محايدة من الناحية البيولوجية.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم الإفصاحات ذات الصلة لإعلان أو مالية أو خلاف ذلك.
Acknowledgments
وقد أجريت جميع التجارب تحت إشراف ورعاية الحيوان واللجنة بوردو الاستخدام وبرنامج الحيوان المعملية في جامعة بوردو.
وقد رعت هذا العمل من قبل المتقدم الدفاع كالة مشاريع البحوث (DARPA) مايكروسيستمز تكنولوجيا المكاتب (MTO)، تحت رعاية الدكتور جورج جودي جاك (jack.judy @ darpa.mil) كجزء من برنامج تكنولوجيا العصبية موثوقة، من خلال الفضاء والحرب البحرية نظم القيادة (SPAWAR) نظم مركز (SSC) منحة رقم المحيط الهادئ N66001-11-1-4013.
فإن الكتاب أود أن أشكر ميخائيل سليبتشنكو، دون جاهز، جريج ريختر، تايلور هارون، وEliceiri كيفن لتبادل خبراتهم المجهري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).
