Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

मस्तिष्क प्रत्यारोपित microdevices और आसपास के ऊतकों के बरकरार histological विशेषता

Published: February 11, 2013 doi: 10.3791/50126
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Department of Biological Sciences, Purdue University

Summary

यहाँ हम पर कब्जा करने के लिए एक histological विधि मौजूद है, लेबलिंग, ऑप्टिकली समाशोधन, और कृंतक मस्तिष्क के ऊतकों में लंबे समय से प्रत्यारोपित microdevices के आसपास बरकरार मस्तिष्क ऊतक इंटरफ़ेस इमेजिंग. इस विधि शामिल तकनीक से परिणाम अपने आसपास के ऊतकों पर विभिन्न मर्मज्ञ मस्तिष्क प्रत्यारोपण के प्रभाव को समझने के लिए उपयोगी होते हैं.

Abstract

डिजाइन और microelectrode arrays के रूप में मस्तिष्क प्रत्यारोपित microdevices, उपयोग में अनुसंधान, चिकित्सकीय प्रासंगिक उपकरणों है कि मस्तिष्क के ऊतकों आसपास के साथ लंबे समय अंतरफलक का उत्पादन करना है. इन प्रत्यारोपण आसपास के ऊतकों के लिए समय पर उपकरणों की मौजूदगी है, जो एक इन्सुलेट उपकरणों के आसपास glial निशान "के गठन में शामिल करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए सोचा है. हालांकि, इन ऊतक परिवर्तन की histological विश्लेषण आमतौर पर डिवाइस explanting के बाद किया जाता है, एक प्रक्रिया है कि हित के ऊतक की आकारिकी को बाधित कर सकते हैं.

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल जिसमें cortical प्रत्यारोपित उपकरणों कृंतक मस्तिष्क के ऊतकों के आसपास में बरकरार एकत्र कर रहे हैं प्रदर्शित करता है. हम वर्णन कैसे, एक बार लगानेवाला साथ perfused, दिमाग हटा रहे हैं और इस तरह रूप में explanting उपकरणों से बचने के लिए में कटा हुआ. हम फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लेबलिंग और ऑप्टिकल समाशोधन एक जानकारीपूर्ण, अभी तक मोटी ऊतक के उत्पादन के लिए उपयोगी तरीकों रूपरेखाअनुभाग. अंत में, हम इन ऊतक वर्गों के बढ़ते और इमेजिंग प्रदर्शन के क्रम में मस्तिष्क प्रत्यारोपित उपकरणों के आसपास जैविक इंटरफ़ेस की जांच करने के लिए.

Introduction

neuroprosthetic अनुसंधान के क्षेत्र उपकरणों 1,2 interfacing सीएनएस के माध्यम से शरीर में बीमार या क्षतिग्रस्त संरचनाओं को दरकिनार करके विभिन्न विकलांग और विकारों से पीड़ित व्यक्तियों की सहायता करना है. Microelectrode सरणियों (meas) के रूप में मस्तिष्क प्रत्यारोपित microdevices, रिकॉर्ड या मस्तिष्क संरचना को प्रोत्साहित करने के लिए, और इस प्रकार इलेक्ट्रॉनिक्स और CNS ऊतक 3-5 के बीच लंबी अवधि के इंटरफेस की स्थापना की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मर्मज्ञ meas, उपकरणों जो मस्तिष्क के ऊतकों में संचालित कर रहे हैं, द्वि - दिशात्मक करीब निकटता के भीतर जो वे पास 6 न्यूरॉन्स की एक अपेक्षाकृत छोटे सेट करने के लिए इलेक्ट्रोड मौजूद है के कारण इंटरफेस के रूप में विशेष रूप से वादा पकड़.

हालांकि, लंबी अवधि के मर्मज्ञ meas का आरोपण से जटिल ऊतक प्रतिक्रियाओं परिणाम है, अक्सर चर और महीने के लिए दिन में धीरे - धीरे अपमानजनक electrophysiological संकेत करने वाली शोर अनुपात में जिसके परिणामस्वरूप, और बिजली imped में वृद्धि हुईइलेक्ट्रोड साइटों और 7,8 जमीन के बीच मंजूरी. इन परिवर्तनों के ख्यात मूल microglia की सक्रियण, microdevices साथ प्रतिक्रियाशील astrocytosis, और एक नुकसान या प्रत्यारोपित 9-11 उपकरणों के लिए आसपास के ऊतकों से पलायन न्यूरॉन्स की शामिल हैं. पुरानी, ​​प्रवेश meas के आसपास इन ऊतक परिवर्तन को समझने के लिए एक बड़ी चुनौती ऊतक बरकरार इंटरफ़ेस चिरकाल प्रत्यारोपित उपकरणों 12 आसपास के histological डेटा पर कब्जा करने में कठिनाई है. / डिवाइस अभी भी मौजूद ऊतक इंटरफेस के साथ ऊतक के histological विश्लेषण वर्तमान डिवाइस हटाने histological प्रोटोकॉल पर सुधार होगा. साथ एक undisturbed ऊतकों में शेष डिवाइस, biocompatible 13,14 कोटिंग्स या इलेक्ट्रोड 15,16 सतह के बिजली समाशोधन के उपयोग के रूप में अपेक्षाकृत सूक्ष्म बातचीत, जैविक प्रभाव और imaged किया जा सकता है समाविष्ट करने के लिए सम्मान के साथ विश्लेषण किया.

एचअरे हम एक विधि के लिए इकट्ठा, प्रक्रिया, और आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों के विस्तृत विश्लेषण के लिए माइक्रोस्कोपी आधारित बरकरार microdevice इंटरफ़ेस छवि प्रदर्शित करता है. इस विधि में, डिवाइस और आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों को एक मोटी (> 250 सुक्ष्ममापी) ऊतक एक vibratome का उपयोग अनुभाग के भीतर एकत्र कर रहे हैं. इन मोटी स्लाइस में पैठ histological लेबल में सुधार, फ्लोरोसेंट Histochemical और immunohistochemical लेबल अवरुद्ध और कई दिनों के लिए सीरम डिटर्जेंट युक्त समाधान में उच्च सांद्रता में लागू कर रहे हैं. एक ऑप्टिकल समाशोधन समाधान माइक्रोस्कोपी इमेजिंग गहराई में सुधार के लिए कार्यरत है, और ऊतक बाद confocal 17 माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर के लिए 2 तरफा कक्षों में मुहिम शुरू की है. पूर्ण histological इंटरफ़ेस पर कब्जा करने के लिए, एक कंप्यूटर नियंत्रित translational चरण इमेजिंग के दौरान प्रत्यारोपण की लंबाई के साथ z ढेर panoramas एकत्र करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इमेजिंग के अलावा के ऊतक लेबल लागू, लेजर reflectance प्रत्यारोपण से वापस इकट्ठा करनेपारेषण और ऊतक दोनों की मदद के माध्यम से ऊतक आसपास के संबंध में प्रकाश डिवाइस इंटरफ़ेस स्थानीयकरण का. ऊतक इस "डिवाइस कब्जा प्रोटोकॉल" का उपयोग कर तैयार प्रोटोकॉल (DCHist) इमेजिंग morphologically संरक्षित ऊतक / डिवाइस बातचीत करने के लिए पहुँच प्रदान करता है, और इस प्रकार पिछले डिवाइस हटाने histological 18 प्रोटोकॉल पर सुधार.

Protocol

समाधान

7.4 पीएच में 9 छ NaCl, .144 छ KH 2 4 पीओ, .795 छ ना 2 4 HPO, एल / छ - फास्फेट खारा (पीबीएस) buffered

4% Formaldehyde - मिलीग्राम / एल, 202 मिलीग्राम सोडियम फास्फेट dibasic (0.4 एम ना 2 4 HPO) समाधान, 48 मिलीग्राम सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार का समाधान (0.4 नाह एम 2 पीओ 4), 500 मिलीलीटर 8% formaldehyde समाधान, 250 मिलीलीटर मिल्ली क्यू DDI पानी पीएच 7.4,

7.5 छ NaCl, 0.3 छ KCl, 0.06 छ KH 2 4 पीओ, 0.13 छ ना 2 HPO 4, 2 छ ग्लूकोज, 2.4 छ HEPES, 0.05 छ 2 MgCl, एल / छ - HEPES सोडियम (HBHS) Azide के साथ हांक Saline Buffered 6 एच 2 हे, 0.05 ग्राम MgSO भागों 4 7 भागों एच 2 हे, 0.165 ग्राम CACL 2, 0.09 7.4 पीएच में 3 जी नेन

धो समाधान (WS) - 1% वॉल / वॉल न हीमल बकरी सीरम, 0.3% सोडियम azide (NaN 3) के साथ HBHS में ट्राइटन X-100,. बाद के चरणों में 4 डिग्री का उपयोग करने से पहले सी WS ठण्डा.

U2 Sca एल ई समाधान - 4 एम यूरिया, 30% ग्लिसरॉल और 0.1% ट्राइटन 17 X-100

प्रक्रिया

सभी प्रयोगों पर्ड्यू पशु की देखभाल और उपयोग समिति और पर्ड्यू विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु कार्यक्रम के पर्यवेक्षण के अंतर्गत किया गया.

1. सर्जरी

  1. विभिन्न सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा पद्धतियों प्रस्तुत histological विधि के साथ संगत कर रहे हैं. stereotaxic फ्रेम और स्वचालित inserters का उपयोग करने के लिए stereotaxic विमानों के लिए सम्मान के साथ reproducibility और microelectrode arrays (विदेश मंत्रालय) के नियंत्रण के आरोपण कोण में सुधार करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं.

नोट: इस प्रदर्शन में हमारे शल्य चिकित्सा पद्धति के रूप में इस प्रकार है: stereotaxic earbars whil में कृंतक विषय पकड़ई isoflurane संवेदनाहारी के तहत (1-3% के बीच) चिकित्सा ग्रेड ऑक्सीजन के द्वारा किया जाता है. एक पैर के अंगूठे चुटकी की कमी के लिए टेस्ट चूहे या माउस में एक पूंछ चुटकी पलटा के अभाव में प्रतिबिंबित पुष्टि करते हैं कि जानवर पूरी तरह anesthetized है. आँख मरहम लागू करें और Betadine और इथेनॉल के तीन बारी washes के साथ शल्य साइट को साफ. धो हाथ, भोर सर्जिकल दस्ताने, बाल के लिये जाल, facemask और गाउन. Lidocaine की एक सांस में सुई के लिए शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को सुन्न करने के लिए, एक कैंची या स्केलपेल, हड्डी खुरचनी और कपास applicators के साथ स्पष्ट periosteum का उपयोग चीरा बनाने, और एक एक दंत ड्रिल handpiece और ड्रिल बिट का उपयोग craniotomy बना. एक micromanipulator का उपयोग कर प्रांतस्था में एक एकल जूते के तल्ले का मध्य भाग विदेश मंत्रालय चलाओ. सड़न रोकनेवाला सर्जरी की स्थिति को बनाए रखने में एक शल्य चिकित्सा सहायक सहायता और सर्जरी की प्रगति दस्तावेज़.

  1. विदेश मंत्रालय के मस्तिष्क में आरोपण के बाद, एक शल्य माइक्रोस्कोप के माध्यम से छवियों को इकट्ठा करने के लिए ख भर से खोपड़ी के अंतिम हटाने को सूचितबारिश. उपकरणों की प्रत्यारोपित भागों में सीटू संरक्षित किया जाएगा.

नोट: स्वस्थानी उपकरणों में ऊतक के अंतिम संग्रह ऊतक सेक्शनिंग के विमान के साथ मिलकर डिवाइस प्रविष्टि के विमान मिलान पर निर्भर करता है. डिवाइस प्रविष्टि मस्तिष्क के लिए रिश्तेदार विमान के बारे में विस्तृत नोट इस प्रकार बहुत महत्वपूर्ण हैं.

  1. उपकरण आरोपण के बाद, सिलिकॉन elastomer Kwik - एसआईएल (डब्ल्यूपीआई) लागू करने के लिए, किसी भी उजागर विदेश मंत्रालय shanks या केबल बिछाने के आसपास, और का इलाज करने के अनुमति देते हैं. एक निष्फल एक कट विंदुक टिप के रूप में इस तरह के प्लास्टिक के टुकड़े, एक छोटे से अच्छी तरह से में craniotomy चारों ओर सिलिकॉन elastomer होते हैं जबकि का इलाज करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. दो भाग Kwik - एसआईएल पर दंत ऐक्रेलिक ("जेट तरल" और लैंग चिकित्सकीय से जेट पाउडर ") और किसी भी उजागर खोपड़ी की एक परत लागू.

नोट: बाद में एक चरण में, headcap के माध्यम से पिघल जाएगा प्रत्यारोपण अलग करने के लिए अनुमति देने के लिएखोपड़ी से. यूवी इलाज ऐक्रेलिक Kwik एसआईएल और craniotomy पर बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह बहुत मुश्किल ऐक्रेलिक बाद दूर करने के लिए मुश्किल है. प्रत्यारोपण के आसपास दिखने अपारदर्शी सामग्री भी परहेज किया जाना चाहिए, इस प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के दौरान स्पष्ट Kwik - एसआईएल प्रत्यारोपण के एक दृश्य प्रदान करता है.

  1. पशु कल्याण के नियमों के स्थानीय प्रोटोकॉल के प्रति के रूप में पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, और एकल पिंजरे रखे बक्से चल विषयों वापसी.

2. छिड़काव और ऊतक संग्रह

नोट: पण एट अल देखें. चूहे पशु मॉडल 19 में एक विस्तृत छिड़काव प्रक्रिया walkthrough के लिए.

  1. संज्ञाहरण और छिड़काव संस्था जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करें. गहरा कृंतक anesthetizing (चूहे या चूहों में पलटा पूंछ चुटकी में पैर के अंगूठे चुटकी पलटा की एक कमी द्वारा पुष्टि) और दिल को उजागर करने के बाद, उथले कैंची से काटना कटौती करने केबाएं वेंट्रिकल और सही atrium. बाएं वेंट्रिकल में एक कुंद सुई डालें और वितरित करने के लिए कमरे में अस्थायी पीबीएस. ~ 10 मिलीलीटर पीबीएस की एक में कुल उद्धार ~ 5 मिलीग्राम / चूहों में मिनट और ~ 200 मिलीलीटर पीबीएस ~ चूहों में 100 मिलीग्राम / मिनट. जिगर से रक्त मंजूरी के लिए के दौरान देखो.
  2. Histologically प्रासंगिक रासायनिक लेबल transcardially सुई, इसलिए यदि वांछित बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए लिया देखभाल के साथ सिरिंज वितरण द्वारा.

नोट: संवहनी (DiI उदाहरण के लिए) लेबल और न्यूक्लिक एसिड counterstain रंजक (33,342 Hoechst जैसे) रासायनिक छिड़काव के दौरान deliverable लेबल के उदाहरण हैं. जब ठीक से प्रशासित, इन histological मार्करों पूरे जानवर 20 लेबल चाहिए.

  1. Buffered, कमरे के तापमान, 4% transcardially formaldehyde के लिए पशु को ठीक उद्धार. दिल है, जो छिड़काव दौरान फेफड़ों नाक जल निकासी के द्वारा evidenced जा सकता है पार पट वेध से बचें. बड़े मांसपेशियों के में नियतन झटके के लिए देखोपूरा छिड़काव से संकेत मिलता है. ~ 10 मिलीलीटर लगानेवाला के एक में कुल उद्धार ~ 5 मिलीग्राम / चूहों में मिनट और ~ ~ 200 मिलीलीटर लगानेवाला चूहों में 100 मिलीग्राम / मिनट.
  2. छिड़काव के बाद, पशु वध करना, 4 डिग्री सेल्सियस के में मस्तिष्क स्टेम या रात भर के लिए 4% formaldehyde समाधान में rongeurs या कैंची, और जगह सिर का उपयोग कर सेरिबैलम का हिस्सा का पर्दाफाश
  3. पीबीएस के तीन परिवर्तन में washes के बीच एक से चार घंटे के अंतराल के साथ सिर धो लें.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर महीने के लिए दिनों के लिए सोडियम azide युक्त HBHS में निश्चित सिर स्टोर.

3. मस्तिष्क हटाने स्वस्थानी डिवाइस में

नोट: इस खंड एक धूआं हुड में प्रदर्शन करते हुए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने. निश्चित सिर लौटने के समय - समय पर करने के लिए समाधान HBHS ऊतक शुष्क्ीकरण से बचें.

  1. सावधानी दूर ऐक्रेलिक खोपड़ी संदंश और छोटे कैंची का उपयोग टोपी के आसपास से त्वचा और अन्य ऊतकों काटना.
  2. जबकि गर्मी मैं पहनेnsensitive दस्ताने, एक टांका लोहे का उपयोग करने के लिए दंत एक्रिलिक हटाने और अंतर्निहित स्पष्ट Kwik एसआईएल (2a चित्रा) के एक क्षेत्र का पर्दाफाश.

नोट: इस चरण के लक्ष्य के लिए माइक्रो कैंची स्थिति है जहां प्रत्यारोपित उपकरणों मस्तिष्क में प्रवेश करने के लिए उपयोग की एक उपयुक्त कोण की अनुमति है, तो यह है कि मस्तिष्क प्रत्यारोपित घटकों खोपड़ी को सुरक्षित घटकों से अलग किया जा सकता है.

  1. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, घुमावदार सूक्ष्म कैंची के साथ सिलिकॉन elastomer में कटौती, Kwik - एसआईएल चिमटी के साथ के छोटे टुकड़े को हटाने के नीचे की स्थिति जहां उपकरणों मस्तिष्क में प्रवेश.
  2. अलग डिवाइस मस्तिष्क में प्रत्यारोपित घटकों से polysilicon और खोपड़ी के लिए संलग्न घटकों घुमावदार सूक्ष्म कैंची के साथ craniotomy की सतह के साथ कटौती जारी रखें. फिर खुर्दबीन बढ़ाई और महान देखभाल का उपयोग जब उजागर उपकरण घटकों के माध्यम से काटने, देखभाल करने के लिए धक्का या खींचने छोटा सा भूत से बचनेनिश्चित ऊतकों में lants.
  3. देखभाल के साथ headcap rongeurs का उपयोग कर के आसपास हड्डी निकालें. खोपड़ी से प्रत्यारोपित उपकरणों के साथ मस्तिष्क को अलग करने के लिए एक रंग का उपयोग करने के लिए. HBHS समाधान में टुकड़ा करने के लिए तैयार है जब तक मस्तिष्क स्टोर.
  4. HBHS साथ भरा एक गिलास पेट्री डिश में मस्तिष्क प्लेस, और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए बाहरी ऊतक निकालने के लिए, रीढ़ की हड्डी, सेरिबैलम, या घ्राण बल्ब के रूप में, चाहे वे उपकरण आरोपण के स्थान के लिए प्रासंगिक हैं पर निर्भर करता है. मस्तिष्क अनुभाग एक मस्तिष्क (टेड पेला) ब्लॉक और रेज़र ब्लेड का प्रयोग करें और एक फ्लैट निकट प्रत्यारोपित उपकरणों के कोण मिलान विमान बनाने, यह एक उचित आकार के मस्तिष्क ब्लॉक में मस्तिष्क रखने के द्वारा पूरा किया है, इस तरह के किसी भी है कि मस्तिष्क orienting प्रत्यारोपण के दृश्य भाग धार गाइड के साथ समानांतर है, और एक ब्लेड गाइड प्रत्यारोपण से कम से कम 2 मिमी में एक धार दे. प्रेस के माध्यम से ऊतक धार. इस सतह एक vibratome मंच करने के लिए माउंट. Alternatively, एक रेजर ब्लेड एक micromanipulator के लिए मुहिम शुरू की है एक इसी तरह नियंत्रित फैशन में मस्तिष्क के लिए एक बारीकी से मिलान प्रत्यारोपण की दिशा विमान बनाने के लिए ब्लॉक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. Vibratome मंच के तहत रखें, बर्फ और ऊतक सतह संक्षेप में एक कागज तौलिया पर शुष्क करने की अनुमति देने के बाद एक सुपर गोंद का उपयोग कर vibratome मस्तिष्क पालन करना. गोंद फ्लैट ऊतक पिछले चरण में निर्मित विमान मंच पर है. असममित ऊतक आयामों के साथ, पूरबी है कि इस तरह के व्यापक आयाम नीचे चिपका vibratome ब्लेड के आंदोलन की दिशा में मदद करने के लिए संभावित ऊतक दस्तक ब्लेड से बचने के साथ समानांतर नमूना. गोंद सेट के बाद (~ 1-2 मिनट), ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ने के ऊतक के चारों ओर vibratome पकवान पीबीएस.
  6. नियंत्रण ऊतक सहित 200-400 सुक्ष्ममापी, के बीच मोटी ऊतक स्लाइस ले लीजिए, हो से 10 डिग्री के कोण ब्लेड के साथ अधिकतम कंपन दर (~ 100 हर्ट्ज) और एक धीमी ब्लेड प्रगति दर (प्रति सेकंड 0.2 मिमी), का उपयोग करते हुएrizontal. स्लाइस ध्यान से 4 बजे एक ब्रश या स्कूप और एक 24 अच्छी तरह से थाली में HBHS में रंग की दुकान के साथ ले लीजिए ° सी.
  7. एक बार बेबस नजर या एक शल्य माइक्रोस्कोप स्वस्थानी डिवाइस में दिखाई देता है, पतली वर्गों इकट्ठा करने के लिए 100 मीटर या उससे कम का टुकड़ा वेतन वृद्धि में डिवाइस दृष्टिकोण.

नोट: विशिष्ट सिलिकॉन सूक्ष्म प्रत्यारोपण डिवाइस की सतह से 300 और 500 मीटर के बीच कृंतक formaldehyde तय प्रमस्तिष्क प्रांतस्था ऊतकों में बेबस नजर से दिखाई दे रहे हैं.

  1. स्वस्थानी डिवाइस में अब ऊतक की सतह के करीब 250> सुक्ष्ममापी ऊतक के भीतर डिवाइस युक्त टुकड़ा इकट्ठा. आवश्यक मोटाई का आकलन पहले से एकत्र स्लाइस संदर्भित द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है.

नोट: बड़े उपकरणों, multishank उपकरणों और angled उपकरणों मोटा ऊतकों स्लाइस (500 सुक्ष्ममापी) एक ऊतक टुकड़ा में डिवाइस पर कब्जा करने की आवश्यकता हो सकती है, फिरसदस्य है कि दोनों लागू लेबल की पैठ और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग गहराई इन बहुत मोटी स्लाइस से अंतिम डेटा संग्रह में सीमित हो जाएगा. यदि संभव हो, vibratome ब्लेड के साथ हड़ताली डिवाइस से बचने के लिए, के रूप में इस के माध्यम से ऊतक और morphological विरूपण डिवाइस के खींचने का कारण बन सकती है.

4. ऊतक प्रसंस्करण और क्लियरिंग

  1. स्लाइस HBHS में 3x धो धोने प्रति 5 मिनट पर
  2. सोडियम borohydride में 30 मिनट कुल (15 मिनट टुकड़ा के प्रत्येक पक्ष) के लिए (5 मिलीग्राम NaBH 4 / HBHS के 1 मिलीग्राम) सेते हैं. एक स्टेनलेस स्टील या Teflon लेपित माइक्रो चम्मच और छोटे तूलिका (टेड Pella) का उपयोग स्लाइस फ्लिप. धीमे और विचारशील आंदोलनों प्रत्येक टुकड़ा फ्लिप की सफलता में सुधार होगा. ब्रश के साथ प्रत्यारोपित उपकरण के आसपास किसी भी क्षेत्र को छूने से बचें. जब संभव हो, आवश्यक (> 2 मिलीलीटर) की तुलना में काफी अधिक समाधान जोड़ने एक हेरफेर करने के लिए ऊतकों स्लाइस फ्लिप और अधिक आसानी से की अनुमति देता है.

नोट: यह कदम autofluorescence अंतर्जात कम कर देता है, इस कदम को छोड़ अगर फ्लोरोसेंट लेबल छिड़काव के दौरान लागू किया गया या XFP ट्रांसजेनिक मार्करों मौजूद हैं.

  1. कमरे के तापमान पर धो समाधान में धोने के प्रति 5 मिनट पर 3x स्लाइस धो लें.

नोट: धोने और ऊष्मायन चरणों के दौरान आंदोलन वैकल्पिक है. लेखकों अटकलें हैं कि सूक्ष्म आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों को सम्मान के साथ कड़ी प्रत्यारोपण के विवाद आंदोलन के साथ हो सकता है. हालांकि, एक कक्षीय एक कोमल दर से आगे बढ़ रही (<60 rpm) मिक्सर इस से बचने जबकि समाधान के आंदोलन में वृद्धि हो सकता है.

  1. कमरे के तापमान (फ्लिप स्लाइस एक घंटे के बाद) को धो समाधान में 2 घंटे के लिए ब्लॉक.
  2. लगभग 48 घंटे (टुकड़ा के प्रत्येक पक्ष पर 24 घंटे) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (धो समाधान में पतला) में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते
  3. 6 जल्दी धो समाधान के साथ 3 मिनट washes प्रदर्शन.
  4. 6, 1 घंटा washes (3 धोने प्रदर्शनऊतक टुकड़ा के प्रत्येक पक्ष पर धो समाधान में) तों (4 पर दुकान ° अगर धोने रातोंरात सी).
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी (धो समाधान के साथ पतला) में लगभग 48 घंटे (प्रत्येक पक्ष पर 24 घंटे) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में सेते
  6. 6 जल्दी धो समाधान के साथ 3 मिनट washes प्रदर्शन.
  7. 6, धो समाधान में 1 घंटा (प्रत्येक पक्ष पर 3 washes) washes प्रदर्शन, 4 पर दुकान डिग्री सेल्सियस अगर रातोंरात धोने.
  8. समाशोधन समाधान समाधान धो और ग्लिसरॉल आधारित "Sca एल ई U2" जोड़ने के लिए निकालें. मोटी स्लाइस (250-500 सुक्ष्ममापी) या 2-3 सप्ताह के लिए बहुत मोटी ऊतक वर्गों (> 500 सुक्ष्ममापी) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 सप्ताह साफ की अनुमति दें
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर कवर पन्नी और दुकान के साथ थाली
  10. मोटी ऊतक वर्गों (चित्रा 2b, 2c) मिलनसार बढ़ते मीडिया के रूप में समाशोधन समाधान का उपयोग कर और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील स्लाइड में माउंट. स्टोर 4 ° C प्रकाश से दूर.

5. पूर्ण तिवारी के पैनोरमा इमेजिंगssue और डिवाइस इंटरफ़ेस

  1. लंबी दूरी काम खुर्दबीन उद्देश्यों (> 2 मिमी), एक confocal खुर्दबीन या 2-photon माइक्रोस्कोप स्कैनिंग लेजर के साथ इमेजिंग शुरू करते हैं. हम एक Zeiss LSM 710, कार्ल Zeiss "जेन" सॉफ्टवेयर (2010), और एक XY कंप्यूटर नियंत्रित एक प्रत्यारोपण के चारों ओर एक 3 डी चित्रमाला छवि अनुवाद करने के लिए मंच के साथ प्रदर्शन करेंगे.

नोट: या तो सॉफ्टवेयर में समाशोधन समाधान के उद्देश्य पर एक सुधारात्मक कॉलर के माध्यम से, अपवर्तक सूचकांक के लिए सही है, या संग्रह के बाद डाटा प्रोसेसिंग में. इस प्रदर्शन में हम "u2" 1.4 Leica ज़ेन माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में समाशोधन समाधान के लिए एक अपवर्तक सूचकांक मान दर्ज करें, इस सेटिंग अपवर्तक सूचकांक बेमेल के लिए आसानी से z कदम अंतराल खाते में समायोजित कर देता है.

  1. डिवाइस निकट ऊतक में मोटे तौर पर प्रत्येक फ्लोरोसेंट कम लेजर शक्ति (0 ~ का उपयोग चैनल के लिए उपयुक्त z आयाम में z-अक्ष खिड़की और डेटा संग्रह सेटिंग्स का आकलन.5 5)% और बड़े z कदम आकार (> 25 सुक्ष्ममापी).

नोट: अतिरिक्त अंतरिक्ष ऊपर और नीचे में शामिल हैं जब z-अक्ष की स्थापना जब नयनाभिराम डेटा संग्रह के लिए स्थापित है, के रूप में पूरी तरह से फ्लैट ऊतक स्लाइड गिलास (~ 20 सुक्ष्ममापी प्रत्येक दिशा) पर झूठ नहीं बोल सकता.

  1. Xy केंद्र पर अपने अंतिम पैनोरमा के उद्देश्य सेट, जेन चित्रमाला सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए, संग्रह प्रत्येक (x और y) अक्ष के लिए ब्याज की अपने क्षेत्र को कवर करने के लिए आवश्यक पदों की संख्या का निर्धारण.
  2. Reassess और संग्रह विंडो z-अक्ष को अंतिम रूप देने.
  3. मैन्युअल डिटेक्टर संवेदनशीलता और लेजर शक्ति सेट करने के लिए वृद्धि की गहराई के साथ उचित रैंप, उद्देश्य आम तौर पर लगभग एक ही छवि तीव्रता ऊतक टुकड़ा में इमेजिंग गहराई की परवाह किए बिना, को बनाए रखने पर भी उच्च पृष्ठभूमि शोर से बचने के.
  4. प्रत्येक फ्लोरोसेंट छवि डेटा श्रृंखला ले लीजिए. यदि आवश्यक हो अतिव्यापी संकेतों से बचने के लिए, लेजर लाइन चलानेएस sequentially.

नोट: यदि उपलब्ध है, स्वचालित रूप से संग्रह के दौरान हार्ड ड्राइव डेटा को बचाने के लिए सॉफ्टवेयर स्थापित.

  1. सॉफ्टवेयर सेटिंग्स बदलें "reflectance" और "संप्रेषण" डेटा एकत्र करने के लिए, और एक लंबी, अधिक छेदक तरंग दैर्ध्य लेजर (जैसे 633 एनएम) का उपयोग करने के लिए इन चैनलों पर कब्जा. Reflectance "और" संप्रेषण "संग्रह के लिए उपयुक्त लेजर शक्ति और डिटेक्टर संवेदनशीलता का निर्धारण और प्रत्यारोपित डिवाइस के चारों ओर एक ही संग्रह श्रृंखला को दोहराएँ.
  2. बाद में प्रसंस्करण, मात्रा का ठहराव, और विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करें.

Representative Results

मस्तिष्क प्रत्यारोपित meas 1 मस्तिष्क एम्बेडेड घटकों से किसी भी खोपड़ी घुड़सवार घटकों को अलग से ऊतक स्लाइस में एकत्र किया जा सकता है, चित्रा 2a एक दंत सीमेंट headcap के एक तरफ और एक विदेश मंत्रालय केबल आसपास Kwik - एसआईएल के एक हिस्से को हटाने के परिणाम से पता चलता है. एक चूहे की खोपड़ी पर. एक टांका लोहे एक धूआं हुड में दंत सीमेंट और Kwik - एसआईएल को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Kwik - एसआईएल के माध्यम से धीरे धीरे excavating निश्चित मस्तिष्क की सतह के नीचे से केबल और किसी भी गैर प्रत्यारोपित विदेश मंत्रालय संरचनाओं अगले माइक्रो कैंची से काटा गया.

टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, लेबलिंग, और ऊतक समाशोधन, सरल कस्टम बनाया स्लाइड बढ़ते मोटी ऊतक स्लाइस (चित्रा 2b) के लिए उपयोगी होते हैं. एक घुड़सवार मस्तिष्क एक प्रत्यारोपित microdevice युक्त टुकड़ा 2c चित्र में दिखाया गया है. इमेजिंग स्लाइड के दोनों ओर के माध्यम से आप एक डिवाइस के चारों ओर इंटरफ़ेस आकलन करने की अनुमति है, के रूप में 3 चित्र में प्रदर्शन कर सकते हैं (चित्रा 3a) जहां microglia एक विदेश मंत्रालय की सिलिकॉन समर्थन के साथ एक तरफ से दिखाई दे रहे हैं और इलेक्ट्रोड साइटों और निशान के साथ microglia अन्य पक्ष (3b चित्रा) पर दिखाई दे रहे हैं.

एक बार घुड़सवार, ऊतक एक XY अनुवाद चरण का उपयोग imaged किया जा सकता है. पूरे ऊतकों स्लाइस भर फ्लोरोसेंट लेबल के Overviews वांछित संकल्प (4 चित्रा) में उत्पन्न किया जा सकता है. Morphologically संरक्षित प्रत्यारोपित microdevices आसपास के ऊतकों इंटरफ़ेस का विस्तृत परीक्षा स्थानीय ऊतक प्रतिक्रिया (5 चित्रा) के विश्लेषण के लिए उच्च वृद्धि के तहत एकत्र किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रक्रिया का अवलोकन (एसी). ब्रेन सूक्ष्म प्रत्यारोपण सर्जरी finaKwik - एसआईएल तुरंत डिवाइस आसपास बहुलक की एक परत के साथ lized, एक ऐक्रेलिक सीमेंट को कवर द्वारा पीछा किया. (डी, ई) इच्छामृत्यु के बाद, एक्रिलिक परत दूर जला दिया है, और डिवाइस की खोपड़ी घुड़सवार घटकों प्रत्यारोपित घटकों से सिलिकॉन elastomer के माध्यम से काटने से अलग हो रहे हैं. (च, छ) मस्तिष्क तो खोपड़ी से निकाल दिया जाता है और कटौती करने के लिए और vibratome चरण के लिए मुहिम शुरू की है. (एच) ऊतक स्लाइस, एक ऊतक टुकड़ा युक्त डिवाइस सहित एकत्र कर रहे हैं. ऊतक (एल) तो और प्रसंस्कृत किया जा सकता है विस्तृत माइक्रोस्कोपी के लिए कस्टम कक्षों में रखा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 (क) साफ़ Kwik एसआईएल सिलिकॉन elastomer सु.एक केबल इलेक्ट्रोड सरणी (तीर) rrounding दूर एक perfused कृंतक एक टांका लोहे का उपयोग सिर पर दंत सीमेंट टोपी में एक खिड़की के जलने से उजागर किया गया है. (ख) को समायोजित करने के लिए एक मोटी ऊतक टुकड़ा के दोनों ओर में इमेजिंग, सरल "स्लाइड कक्षों" एक प्लास्टिक स्लाइड काटने और दोनों ओर से coverglass ऊतक के आसपास और पालन समाधान बढ़ते द्वारा बनाया जा सकता है. (ग) बरकरार प्रत्यारोपण (लाल तीर) के साथ एक चूहा मस्तिष्क के ऊतकों टुकड़ा बढ़ते के बाद दिखाया गया है. ऊतक के दोनों ओर जल्दी से इस सेटअप के साथ माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए सुलभ है. पैमाने के लिए, पैनल (एक) तल पर भर में 25 मिमी है, जबकि पैनल (ख, ग) तल पर भर में 80 मिमी.

चित्रा 3
चित्रा 3 अधिकतम int.z ensity 40 सुक्ष्ममापी मोटी छवि के ढेर के अनुमानों, पीठ (क) और (ख) एक प्रत्यारोपित microelectrode सरणी के सामने के आसपास एकत्र. Microglia (विरोधी Iba1 और Alexa Fluor 633, सफेद के साथ लेबल) और लेजर प्रकाश (लाल) reflectance, डिवाइस की सतह से एकत्र, क्रमिक रूप से एक 400 सुक्ष्ममापी मोटी ऊतक टुकड़ा के दोनों पक्षों से imaged थे. के रूप में मस्तिष्क प्रत्यारोपण अक्सर अपारदर्शी हैं, दोनों पक्षों के लिए ऑप्टिकल का उपयोग के साथ बढ़ते लेबल खुर्दबीन उद्देश्य के लिए सम्मान के साथ प्रत्यारोपण "के पीछे" ऊतक संरचनाओं की एक स्पष्ट दृष्टि प्रदान करता है. पैमाने बार 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 4
चित्रा 4 एक लेबल DCHist एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर पर एक कंप्यूटर नियंत्रित मंच का उपयोग imaged टुकड़ा. (क) सेल नाभिक (Hoechst ३३,३४२ साथ दाग) और (ख) / monocytes microglia(विरोधी Iba1 के साथ लेबल) एक साथ अलग - अलग चैनलों पर imaged थे. (ग) पारेषण प्रकाश और reflectance भी एकत्र किए गए थे, Hoechst और Iba1 डेटा के लिए सम्मान के साथ 4 सप्ताह के प्रत्यारोपण के स्थान दिखा. (घ) सभी चैनलों लेकिन संचरण के ओवरले भी दिखाया गया है. सफेद आयताकार क्षेत्र सही में प्रदर्शित होने के छवियों में विस्तार किया है. स्केल बार 1 मिमी.

चित्रा 5
5 चित्रा एक खुर्दबीन कंप्यूटर नियंत्रित चरण और उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग, मनोरम इमेजिंग डेटा इम्प्लांट के आसपास एकत्र किया जा सकता है. (क) reflectance और transmittance (ख) डिवाइस के स्थानीयकरण अनुमति है, जबकि फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी या रासायनिक लेबल (ग, microglia और मैक लेबलिंग विरोधी Iba1rophages) ऊतक बरकरार इंटरफ़ेस के साथ ऊतक घटकों के विस्तृत इमेजिंग की अनुमति देते हैं. स्केल बार 200 सुक्ष्ममापी.

Discussion

"डिवाइस कब्जा प्रोटोकॉल" (DCHist) विधि का प्रदर्शन यहां मस्तिष्क के ऊतकों और ऊतक प्रत्यारोपण के बीच morphologically संरक्षित बातचीत के करीब histological मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है. DCHist ऊतक संग्रह खोपड़ी घुड़सवार उपकरण घटकों के मस्तिष्क में प्रत्यारोपित घटकों से सावधान जुदाई की आवश्यकता है. DCHist भी एक मोटी histological ऊतक टुकड़ा (> 250 सुक्ष्ममापी) का संग्रह की आवश्यकता है. ये ऊतक वर्गों, एक बार लेबल, को मंजूरी दे दी है, घुड़सवार, और imaged, आरोपण चोट या बाद निबाह उपकरणों के लिए पुरानी प्रतिक्रिया में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. उन्नत माइक्रोस्कोपी उपकरण का उपयोग, ऊतक और युक्ति के बीच इंटरफेस और imaged किया जा सकता है और अधिक विस्तार में विश्लेषण के रूप में 3-5 आंकड़े में दिखाया गया है.

अपने वर्तमान रूप में प्रस्तुत तकनीक धीरे धीरे दूर दो भाग दंत सीमेंट और डिवाइस आरोपण की बात करने के लिए नीचे Kwik एसआईएल से बनाया headcap खोखला करना करने की क्षमता पर भरोसा करते हैं.दंत सीमेंट कि दूर जला दिया जा सकता है या अन्यथा हटा दिया और एक स्पष्ट सिलिकॉन elastomer है जिसके माध्यम से छोटे कैंची नेत्रहीन बहुत सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित उपकरण अपनी खोपड़ी घुड़सवार घटकों से अलग करने में सहायता करने के लिए निर्देशित किया जा सकता है का उपयोग. खोपड़ी के तहत और मस्तिष्क के ऊपर डिवाइस में कटौती करने के लिए यह बगल में इकट्ठा करने का प्रयास करने की सिफारिश की है, नहीं के रूप में समाविष्ट खोपड़ी मस्तिष्क घुड़सवार एक महत्वपूर्ण राशि से बाहर खींच जाएगा.

हालांकि पतली, NeuroNexus टेक्नोलॉजीज से एक जूते के तल्ले का मध्य भाग meas जैसे छोटे प्रत्यारोपण, सबसे DCHist करने के लिए उत्तरदायी हैं, सिद्धांतों एक डिवाइस shanks या microelectrode arrays के लिए सीमित नहीं हैं. संग्रह और इमेजिंग रणनीतियों आवश्यकताओं के साथ किया जा रहा है कि वे किसी भी खोपड़ी माउंट से अलग किया जाना चाहिए और एक मोटी ऊतक अनुभाग के भीतर एकत्र, मोटे तौर पर बहु ​​- जूते के तल्ले का मध्य भाग उपकरणों और cannulas जैसे बड़े प्रत्यारोपण के लिए लागू कर रहे हैं. हालांकि लेखकों ऊतक के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैंआसपास के cortical प्रत्यारोपण, मस्तिष्क में गहरी चालित उपकरणों को भी और एकत्र किया जा सकता है imaged. प्रत्यारोपण प्रविष्टि की गहराई में एक टुकड़ा डिवाइस बेतहाशा प्रविष्टि के ज्ञात कोण से विचलित नहीं करता प्रत्यारोपण के कब्जा को प्रभावित नहीं करना चाहिए.

सीमाओं DCHist विधि के उपयोगी आवेदन करने के लिए मौजूद हैं. Micrometers के सैकड़ों के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों वर्गों छवि को चुनौती दे रहे हैं, सफेद पदार्थ के क्षेत्रों में विशेष रूप से, हालांकि ऑप्टिकल समाशोधन समाधान बहुत विभिन्न ऊतकों में 21 इमेजिंग गहराई में सुधार कर सकते हैं. आगे इमेजिंग गहराई में सुधार करने के लिए, दो photon माइक्रोस्कोपी उत्तेजना ऑप्टिकल वर्णित समाशोधन के साथ साथ नियोजित हो सकता है.

वर्णित विधि का एक अन्य संभावित सीमा विशिष्ट फ्लोरोसेंट immunohistochemistry तरीकों और एंटीबॉडी के शोधकर्ताओं द्वारा नियोजित किया जा सकता है. निष्क्रिय प्रसार आम तौर पर निश्चित ऊतकों के माध्यम से इन मार्करों के समावेश ड्राइवऔर प्रतिजन बाध्यकारी साइटों पर. अंतिम एंटीबॉडी काम कर रहे सांद्रता लेबल प्रवेश को अधिकतम करने के लिए है जबकि पृष्ठभूमि लेबलिंग के उच्च स्तर से बचने के लिए मामले के आधार द्वारा एक मामले पर शोधकर्ताओं ने निर्धारित किया जाना चाहिए. एंटीबॉडी लेबलिंग चर स्लाइस कि हूबहू संसाधित कर रहे हैं के बीच नहीं हो सकता है, लेकिन अलग अलग एंटीबॉडी उनके घुसना करने के लिए और अपने प्रतिजन टैग करने की क्षमता में काफी आसानी से कुछ एंटीबॉडी प्रतिजनों के कई सैकड़ों micrometers गहरी और दूसरों प्रतिजनों लेबलिंग micrometers के दसियों केवल गहरी लेबलिंग के साथ भिन्न हो सकते हैं चाहिए. ठेठ सांद्रता से अधिक एंटीबॉडी लेबल आवेदन के कई दिनों के लिए लागू करने के द्वारा इस प्रसार में सुधार लाने का वर्णन है, और एक पतला डिटर्जेंट युक्त और सीरम अवरुद्ध समाधान में. समय - समय पर स्लाइस flipping भी लेबलिंग को बढ़ावा देता है. एंटीजन रिट्रीवल कदम और वैकल्पिक निर्धारण प्रक्रियाओं (जैसे glutaraldehyde, माइक्रोवेव, आदि) में विशिष्ट प्रतिजनों के लिए उपयुक्त हो सकता है. एंटीबॉडी fluoroch माध्यमिकरोम conjugates भी उनके प्रदर्शन लेबलिंग मोटी वर्गों में भिन्न हो सकता है, यद्यपि यह Invitrogen से Alexa Fluor लेबलों का उपयोग लेखकों द्वारा नहीं देखा गया. वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक पशु विषयों ब्याज की प्रकार की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त एंटीबॉडी लेबल पैठ के साथ मुद्दों से बचने के लिए उपयोग किया जा सकता है, EGFP जैसे कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन, के रूप में, formaldehyde उपचार के बाद उनके प्रतिदीप्ति बनाए रखने के लिए, और तुरंत ऊतक वर्गों में visualized किया जा सकता है.

DCHist तकनीक का एक शक्तिशाली सेट पर कब्जा करने और मस्तिष्क के ऊतकों पर प्रत्यारोपित microdevices के प्रभाव का विश्लेषण है. साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी गुणवत्ता और इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा 22 डेटा के vivo मूल्यांकन में इस histological प्रोटोकॉल युग्मन बहुत शरीर क्रिया विज्ञान परिवर्तनशीलता और गिरावट के जैविक स्रोतों के बारे में हमारी समझ को सुधार सकता है. विशेष रूप से प्रत्यारोपित तंत्रिका कृत्रिम उपकरणों के क्षेत्र विस्तृत DCHist भारतीय सैन्य अकादमी से लाभ हो सकता हैबरकरार इंटरफ़ेस / डिवाइस ऊतक ging biologically तटस्थ विदेश मंत्रालय के उपकरणों के आगे विकास को सूचित.

Disclosures

लेखक कोई प्रासंगिक खुलासे की घोषणा, वित्तीय या अन्यथा है.

Acknowledgments

सभी प्रयोगों पर्ड्यू पशु की देखभाल और उपयोग समिति और पर्ड्यू विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु कार्यक्रम के पर्यवेक्षण के अंतर्गत किया गया.

विश्वसनीय तंत्रिका प्रौद्योगिकी कार्यक्रम के हिस्से के रूप में यह काम रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA) माइक्रोसिस्टम्स प्रौद्योगिकी कार्यालय (एमटीओ), डॉ. जैक डब्ल्यू जमीमा (jack.judy @ darpa.mil) के तत्वावधान में प्रायोजित किया गया था के माध्यम से अंतरिक्ष और नौसेना वारफेयर सिस्टम कमान (SPAWAR) सिस्टम (एसएससी) केंद्र प्रशांत अनुदान सं N66001-11-1-+४,०१३.

लेखकों के लिए अपने माइक्रोस्कोपी विशेषज्ञता को साझा करने के लिए मिखाइल Slipchenko, डॉन तैयार, ग्रेग रिक्टर, हारून टेलर और केविन Eliceiri धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
H–chst 33342 Invitrogen 14533 DNA marker
Rabbit anti-Iba1 Wako (Japan) 019-19741 Monocyte antibody
Dental acrylic Lang Dental (various distributors) Jet Denture Repair Powder & Liquid Headcap construction
Kwik-Sil World Precision Instruments KWIK-SIL Covering exposed cranial implants
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121 Tissue processing
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Tissue processing
Urea Sigma-Aldrich U4883 Clearing solution
Glycerol Sigma-Aldrich G20225 Clearing solution
Equipment
Curved micro-scissors World Precision Instruments 14208 Cutting implant before removing brain
Razor blades Ted Pella (various sizes) For use with Brain Block
Acrylic Brain Matrice Ted Pella 15054 Brain Block to create initial plane in tissue
Plastic slides Ted Pella 260225 Mounting tissue
Cover glass Ted Pella (various sizes) Mounting tissue
Electrode arrays NeuroNexus Technologies (various designs) Example MEAs
Vibratome Leica VT1000 S Specific system used in presented method
Vibratome blades (various suppliers) Collecting slices
24-well plates (various suppliers) Storing and processing tissue slices
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage Carl Zeiss Microscopy Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software Specific system used in presented method
Soldering iron (various suppliers) Excavating headcap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
  2. Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
  3. Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
  4. Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
  5. Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
  6. Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
  7. Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
  8. Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
  9. Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
  10. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
  11. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
  12. Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
  13. Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
  14. Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
  15. Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
  16. Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
  17. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
  18. Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  20. Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
  21. Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
  22. Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).

Tags

तंत्रिका जीव विज्ञान 72 अंक तंत्रिका विज्ञान बायोमेडिकल इंजीनियरिंग मेडिसिन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मस्तिष्क Neuroglia न्यूरॉन्स immunohistochemistry (आईएचसी) Histocytological तैयार करने की तकनीक माइक्रोस्कोपी Confocal nondestructive परीक्षण bioengineering (आदमी मशीन सिस्टम) बायोनिक्स ऊतक विज्ञान मस्तिष्क प्रत्यारोपण microelectrode arrays immunohistochemistry neuroprosthetics मस्तिष्क मशीन इंटरफेस माइक्रोस्कोपी मोटी ऊतक ऑप्टिकल समाशोधन पशु मॉडल
मस्तिष्क प्रत्यारोपित microdevices और आसपास के ऊतकों के बरकरार histological विशेषता
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woolley, A. J., Desai, H. A., Gaire, … More

Woolley, A. J., Desai, H. A., Gaire, J., Ready, A. L., Otto, K. J. Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue. J. Vis. Exp. (72), e50126, doi:10.3791/50126 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter