Summary
발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.
Abstract
병아리 배아 신경 튜브의 일렉트로는 신경 세포에 외래 유전자의 발현에 대한 신속하고 효율적인되는 등 많은 장점이 있습니다. 이 논문에서 우리는, 특별히 신경 전구 세포의 하위 집합에 레이블을 지정하기 위해 E2.75에 새 후뇌로 DNA를 electroporate하는 방법을 독특하게 보여줍니다 방법, 방법 개발의 많은 고급 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 수행하는 방법 제공 최대 E14.5합니다. 기반의 플라스미드와 후뇌 세포 (의 interneurons, DA1의 지느러미 가장 하위 그룹)의 하위에 GFP 발현을 유도하는 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템 - 우리는 특정 증강 요소, 크레 / 훈제 연어 등의 소설 유전 도구를 활용했다. 축삭의 탄도와 DA1 축삭의 목표는 다양한 뇌간 지역에서 초기 및 후기 배아 단계에서 다음입니다. 이 전략은 배아 후뇌에 대한 관심의 세포를 타겟팅하고 tra에 대한 고급 기술에 기여개발의 여러 단계에서 회로 형성의 cing.
Introduction
후뇌 오름차순와 신경 네트워크를 내림차순를 통해 중앙과 주변 신경 시스템 간의 통신에 의한 신경계의 중요한 중계 허브를 나타냅니다. 그것은 호흡, 의식, 청각,와 모터 조정 1-3 등의 기본적인 기능을 조절한다. 초기 배아 발달 동안 척추 후뇌는 일시적으로 서로 다른 신경 세포 유형을 형성하고 여러 뇌간 핵 센터 4 생성되는 반복 rhombomeres로의 전후방 (AP) 축을 따라 세분화된다. 후뇌는 개별 신경 세포의 전구 세포가 지정되고 별개의 DV 위치에 3,5,6을 차별화하는 기초와 날개의 접시에 자사의 지느러미 - 복부 (DV) 축을 따라 구분됩니다. 초기 AP와 DV 특정 신경 세포의 패턴 기능 뇌간 회로에의 설립을 관리하는 방법은 크게 알려지지 않은 것입니다.
이 기본에 대한 지식을 얻기 위해질문 도구는 초기 후뇌에있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하려면보다 고급 단계에서 자신의 축삭 탄도와 연결을 추적하기 위해 필요합니다. 우리는 이전에 특정 증강 요소를 활용하고, 초기 병아리 배아 7-9 지느러미 척추의 interneurons의 축삭 궤적을 추적 크레 / LoxP 기반 조건식 시스템에있다. 현재 원고에서 우리는 후뇌를 대상으로하고 수정 일렉트로 전략과 PiggyBac 사용 후기 배아 후뇌의의 interneurons, 축삭과 시냅스 목표를 라벨에 대한 실험 패러다임 업그레이드 - 중재 DNA 전위합니다. 우리의 새로운 전략은 2 최대 12 일 ~ 후뇌과 축삭 돌기 다양한 배아 단계에서 시냅스 사이트의 추적의 한면에 서로 다른 신경 세포 아형의 태그가 일렉트로 다음 수 있습니다. 이 방법에 따라, 우리는 후뇌의의 interneurons의 지느러미 - 대부분의 서브 그룹 (dA1/Atoh1을 + 표시 (10)의 여러 계층에서 폼 시냅스에 발견되었다.
병아리의 electroporation의 조합은 유전자가 신경 세포와 개발의 많은 고급 단계에서 투영 사이트 분석 추적 뇌의 신경 네트워크의 형성을 연구 및 회로 형성을 제어하는 분자 메커니즘을 해명하는 독특한 플랫폼을 제공합니다.
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Protocol
1. 후뇌의 Electroporation에
1.1 에그 처리
- 가습 배양기 (37-38.5 ° C)에서 수평으로 계란을 넣습니다. 배아들은 16-17 (HH) 단계 (25-30 somites)에 도달했을 때, 배양 65 ~ 70 시간 후 electroporation하여 있습니다.
- 인큐베이터에서 계란을 제거, 그들은 수평 위치에 남아 있습니다.
1.2 준비
- 유리 모세관 (0.5 mm 직경)을 당깁니다.
- 펄스 발생기에 어댑터 홀더 구부러진 L-모양의 금 Genetrodes 전극 (3 mm 직경)를 연결합니다. 일렉트로 매개 변수는 25 볼트 5 펄스 수, 45 밀리 초 펄스 길이 300 밀리 초 펄스 간격이 (가) 있습니다.
- 입 피펫, 10 ML의 주사기 바늘, 파라 필름 (parafilm) 스트립, 부드러운 브러시, 날카로운 해부 가위, 25 ML 멸균 PBS 용액을 준비합니다. 이 금액은 일반적으로 계란 트레이 (18 알)을 처리하기에 충분합니다.
- DNA 플라스미드의 적절한 혼합 (5 ㎍ / ㎕의 각을)를 준비하고DNA 주사를 시각화하는 0.025 % 빠른 그린 염료에 대해 추가합니다. 보통 4 μL의 볼륨 트레이의 주입을위한 충분합니다.
1.3 윈도우, 사출 및 Electroporation에
- 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 청소합니다.
- 공기에 배아 노출 시간을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 계란을 처리합니다.
- 가위 끝 계란 극에 구멍을 뚫어 주사기와 알부민의 3-4 ML를 제거합니다. 그것은 생존을 감소로 알부민의 큰 금액을 제거하지 마십시오.
- 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질의 상단 중앙에 작은 타원형 창 (2.5 × 2 cm 크기)를 엽니 다.
- 전체 과정 동안 건조를 방지하기 위해 태아의 상단에 PBS 몇 방울을 드립.
- 유리에 DNA 혼합물의 작은 금액을로드하면 입 피펫을 사용하여 모세관.
- 쪽으로의 후방 끝 배아를 놓습니다. 배아가 명확하게 볼 수로 잉크가 주입이 단계에서 필요하지 않습니다. 잉크 분사 증가 방지배아 생존. ~ 45 °에서 모세관을 잡고 꼬리 후뇌에 침투. 배 주위로부터 막을 제거하지 마십시오. 공기 방울을 형성하지 않고 후뇌 루멘 내쉬고 조심스럽게 DNA 용액을 주입. DNA 솔루션은 전방으로 펼쳐집니다.
- 바로 DNA 주입 한 후, 정확한 AP 및 대상을 목표로 DV의 후뇌 위치에서 평행 전극을 배치합니다. 이 가능성을 줄일 수 있으므로, 마음을 건드리지 않고 약간 ventrally 전극을 밀어 넣습니다. electroporator를 펄스. 전극 (그림 1A) 전기 전도도를 나타내는 거품으로 덮여해야합니다.
- 조심스럽게 전극을 제거하고 배아를 냉각하고 거품을 제거하기 위해 PBS 몇 방울을 똑. 배양 중에 건조를 방지하기 위해 파라 필름 (parafilm) 스트립이 제대로 개방 계란을 밀봉하십시오. 부드러운 브러시로 PBS에 전극을 세척 할 것.
- 시간의 원하는 기간 동안 인큐베이터에 계란을 넣습니다. 배아의 생존을 2 ~ 3 일 후에 약 90 %로일렉트로, 그리고 50 %의 electroporation 후 최대 12 일이 줄어 듭니다.
2. 배아의 분석
2.1 평면 마운트 준비와 면역
- 후뇌의 평면 마운트 준비는 쉽게 현미경 또는 입체 음향 현미경으로 축삭을 시각화하기 위해 E6.5까지 수행 할 수 있습니다.
- 주변 점막과 혈관에서 분리하여 조심스럽게 배아를 해부. PBS를 포함하는 코팅 페트리 접시 - 작은 실리콘에 배아를 놓습니다. dorsally에 직면 텅스텐 핀으로 접시에 배아를 연결합니다. 후뇌 날카로운 유리 모세관을 사용하여 지붕 플레이트 등의 슬릿을 수행합니다.
- 날카로운 핀셋 및 마이크로 가위를 사용하면 머리의 상단 부분을 잡고 주동이의 꼬리에 매우 신중 후뇌 조직을 당겨. 후뇌의 분리 후 깨끗한 준비 도달하기 위해 남아있는 복부 조직을 제거합니다.
- 4와 후뇌을 품어상온에서 1 ~ 2 시간 동안 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (RT). PFA를 제거하는 PBT (PBS/0.1 % 트리톤 X-100)와 후뇌을 씻으십시오.
- 평면 장착 hindbrains에서 면역 형광에 대한 차단 솔루션을 500 μL (4시 ON 1 차 항체 ° PBT와 C. 워시 (15 분 × 3)와 RT 품어에서 2 시간 동안 PBT와 부화에있는 염소 혈청의 5 %를 추가합니다. 품어은 RT에서 2 시간 동안 2 차 항체. PBT (15 분 × 3)로 씻으십시오.
- 유리 슬라이드에 dorsally 직면 후뇌를 놓습니다. 후뇌에 형광등 설치 미디어를 추가 할 수 있습니다. 슬라이드 후뇌을 평평하게하는 유리 모세관 또는 텅스텐 바늘을 사용합니다.
- 커버 슬립에 의해 조직의 압박을 방지하기 위해 각 모서리에 그리스의 작은 금액을 추가합니다. 후뇌의 상단에 커버 슬립을 조심스럽게 배치하고 공기 방울을 피하십시오. 준수를위한 유리제 가장자리를 커버하기 위해 매니큐어를 추가합니다.
2.2 극저온 섹션과 면역 형광
- 뇌간 CA의 극저온 섹션N 축삭 궤적을 시각화하는 모든 단계에서 수행 할 수. 그러나, E6.5 후이 너무 두껍게되어 평면 장착 배아에서 축삭을 시각화하는 데 어려움으로 인해 선호하는 방법이어야한다. 또한, 시냅스의 데모 조직과 현미경 고배율보기의 단면이 필요합니다.
- 배아를 해부하고 모든 주변 조직을 제거합니다. PBS로 씻어. 마이크로 가위와 날카로운 핀셋을 사용하여 수질의 꼬리 부분에서 배아를 잘라. 소뇌와 중뇌 사이의 넓은 절개를 확인하고 전체 뇌간를 제거합니다. 조직 수질, 뇌교와 소뇌를 포함해야합니다.
- PBS (10 분 × 3)로 씻어 4에서 밤새 4 % PFA (ON) ° C에서 뇌간을 수정하고 ON 4 ° C에서 침몰까지 30 % 자당에 품어.
- 10월 (최적 절삭 온도) 화합물 CRYO-금형 후뇌를 포함하고, 냉동, 다른 곳과 마찬가지로 11 설명까지 -20 ° C에 배치합니다.
- 슬라이드를 건조. RT에서 2 시간 동안 각 슬라이드에 100 μl를 차단 솔루션을 추가합니다. 항체 100 μl를 (원하는 농도 차단 용액에 희석)을 추가합니다. 1 차 및 2 차 항체 배양 기간은 4시에 ON으로 각각 RT에서 ° C 또는 2 시간. 각 배양 시간 동안 부드럽게 건조를 방지하기 위해 슬라이드의 상단에 파라 필름 (parafilm) 스트립을 추가합니다. 항체 사이의 PBS (10 분 × 3)로 씻으십시오. 필요한 경우, RT에서 20 분 동안 PBS에 희석 1:1,000 DAPI을 (4'-6-Diamidino-2-페닐 인돌) 추가합니다. PBS로 씻어.
- 형광등 설치 미디어 슬라이드를 장착합니다. 분석하기 전에 1 시간 동안 건조하자.
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Representative Results
이 프로토콜은 최근 병아리 후뇌 10의 interneurons의 DA1 하위 그룹의 축삭 패턴 및 프로젝션 사이트를 발견하는 데 사용되었다. 특히 이러한 축삭에 레이블을 지정하려면, 이전에 척추 DI1 신경 8,12,13 특정으로 특징 된 증강 요소 (Atoh1은), 후뇌 DA1 세포를 10으로 표현할 수 있도록이 확인했습니다. 요소는 크레 재조합 플라스미드 크레 따라 세포질 GFP 기자 (; 그림 1BI pCAGG-LoxP 스톱 LoxP-cGFP)와 함께 E2.75에 공동이 - electroporation하여 상류로 복제되었다. Hindbrains은 평면 마운트 준비로 48 시간 다음의 electroporation을 분석하고 두 콘트라 측면 오름차순 축삭 돌기 패턴 (그림 2A)를 공개했다; 하나의 기관이 독점적 등의 삭조에 길쭉한 것이 6-7 rhombomeres에 위치한 DA1 신경 세포에서 파생 된 반면, 다른 rhombomeres 2-5과 측면 삭조으로 확장에서 유래.
14,15을 적용 하였다. 두 개의 PB 팔 (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB) 사이에 복제 기자 크레 - 조건부 myristoylated-GFP (mGFP) 카세트, Atoh1와 함께 E2.75에 electroporation하여 한 :: 크레 증강은 그리고 transposase 벡터 (CAG :: PBase). 이 전략에 electroporation하여 크레 조건부 mGFP는 병아리 염색체에 통합되어 결과적으로 정지 카세트 DA1 세포 (그림 1BII, 10)에서 GFP의 장기간 발현을 가능하게 만 DA1 신경 세포에서 제거됩니다. 그것은 오히려 세포질에 희석 것보다 축삭 막 따라 지역화되도록 막 GFP의 고정 끈 그것의 myristoylated 형태. Brainstems는 E13.5에서 수집 및 시상 부분 (그림 2B)로 분석 하였다. DA1 축삭은 소뇌에 축적하고 외부 GR으로 확장 할 수 발견되었습니다 Zic1 + 세포에 의해 표시됩니다 anular 층 (EGL).
소뇌 DA1 축삭의 시냅스 목표도 분석 하였다. E2.75 배아는 시냅스 소포 단백질 2 (SV2) - GFP의 Atoh1 :: 크레 증강 및 PB transposase (그림 1BIII)와 함께 플라스미드 기자 16, 17,와 electroporation하여 하였다. 이 방법은 DA1 축삭 말단의 시냅스 소포에서 GFP 기자의 표현을 할 수 있습니다. 소뇌는 E13.5에서 단면이고 일반적인 사전 시냅스 마커 synaptotagmin 18,19뿐만 아니라, 함께 조롱박 층 (그림 3A의, 3B)를 레이블 calbindin로 염색. SV2-GFP + 시냅스 소포가 소뇌 DA1 후뇌의의 interneurons의 시냅스 연결을 나타내는 조롱박 층 등 다양한 소뇌 지역에서 발견되었다.
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그림 1 (A) E2.75 병아리 후뇌에서의 electroporation 기술의 그림 (B) 조건 후뇌 DA1의 interneurons 레이블을 지정하는 데 사용되는 플라스미드의 계획, (I) :.. 구문은 Cre 호텔 - 재조합 cDNA의 상류 복제 Atoh1 증강 요소를 포함 및 전사 STOP 카세트가 CAGG 인핸서 / 프로모터 모듈과 세포질 GFP 유전자 (cGFP) 사이에 삽입 된 플라스미드 조건부 기자. . DA1 뉴런에 GFP의 조건식에 의해 Atoh1 :: 크레 (II) 구동 : 구조적 후뇌 세포를 라벨을 PiggyBac 조옮김 방법. 구문은 플라스미드 Atoh1 :: 크레 증강, 크레 조건부 기자 카세트, myristoylated GFP (mGFP)는 두 개의 PB 팔 (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB) 사이에 복제되는, 그리고 Pbase의 transposase 플라스미드 있습니다.DA1 신경 세포의 게놈에 기자 카세트의 통합은 CAG :: PBase 및 Atoh1 :: 크레 벡터에 의해 구동됩니다. (III) : 후뇌의의 interneurons의 시냅스 대상 레이블을 비슷한 PiggyBac 조옮김 방법. 플라스미드 크레 조건부 기자는 두 개의 PB 팔 (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB) 사이에 둘러싸인 시냅스 SV2-GFP를 포함한다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. DA1의 interneurons의 축삭 궤도 (A). E4.5 후뇌의 평면 장착 준비는 두 개의 오름차순 DA1 축삭 책자 (녹색 화살표)를 보여줍니다. neurofillament 마커 3A10 (적색) rhombomere 국경을 표시하는 데 사용됩니다. (B) 시상E13.5 태아의 소뇌의 부분은 소뇌에 축적 DA1 축삭 (녹색)을 보여줍니다. EGL 세포 Zic1 (적색)로 표시되어 있습니다. EGL, 외부 세분화 된 계층은 눈금 막대가 표시됩니다.
그림 3. DA1의 interneurons의 시냅스 대상 (A). 라벨 핵에 표시 조롱박 층과 DAPI에 Calbindin와 E13.5 소뇌 스테인드의 시상 부분 (핑크) (파란색). (B). A. SV2-GFP에 표시된 영역의 높은 배율의 뷰는 DA1 시냅스 (녹색)가 소뇌의 조롱박 층 (핑크)에 표시됩니다 표시. 일반 사전 시냅스 마커 synaptotagmin (적색) SV2-GFP + 시냅스 (노란색 화살표)와 공동으로 표현된다. Calb, Calbindin, S-태그, synaptotagmin. 스케일 바는 표시됩니다.
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Discussion
비켜 electroporation에있는 병아리 신경 시스템 개발 20시 세포의 사양과 축삭 지침을 검토하는 가능한, 신뢰할 수있는 효과적인 도구입니다. 이 프로토콜에서는 특정의 interneurons의 조건 라벨을 사용 증강 요소를 사용하여 E2.75에 병아리 후뇌에있는 일렉트로의 모드를 설명합니다. 이 전략은 배아의 고급 단계에서 축삭 노선 계획과 시냅스 사이트의 추적을 가능하게 병아리 게놈에 외부 유전자를 삽입하는 PiggyBac 매개 전위 시스템과 결합됩니다.
병아리 후뇌의 레이블 축삭 / 시냅스 이전에 방법은 라벨 또는 실험에게 21-23를 접목 고전 역행 또는 선행 성 염료를 포함되어 있습니다. 이러한 연구는 후뇌 오름차순와 축삭 책자를 내림차순에 중요한 결과를 기여했다. 그러나 일부 궤적과 예측은 이러한 세포의 방법에 의해 간과되었다. 식용 보의 이온,보고 funiculi에 투사 뉴런의 하위 그룹의 분자 ID는 공개 할 수 없습니다. 우리의 결합 된 일렉트로의 방법과 유전자 추적을 유지는 축삭 탐색 및 프로젝션 목표 10에 자신의 사양 단계에서 선택한 후뇌 신경 세포의 발달을 따르는 고유 한 기능을 제공합니다. 특히, 우리의 접근 방식은 이전 시간에 8,9의 짧은 기간 동안 척수 등쪽에의 interneurons의 축삭 궤적을 추적하기 위해 적용되었다.
설명 도구는 축삭 돌기를 제어 분자 메커니즘을 발견하는 역할을 할 수있다; 유전자 코드 (예 : 임 homeo-도메인 코드)를 선택적으로 축삭 성장의 enhancer-Cre/Lox-based 접근과 영향력을 이용하여 특정 신경 세포의 하위 그룹에 수정 된 와 연결이 8,10가 뒤를이었다. 따라서,이 프로토콜은 셀 라벨뿐만 아니라 원하는 세포에 유전자 조작을위한뿐만 아니라 유용 할 수 있습니다.
ve_content는 "OVO 유전자 전달 방법에서와 같은 일렉트로의 장점> 하나는 일렉트로 24 다음 3 시간 이내에 이미 관찰 표현의 신속성이다. 그러나 나중에 발달에서 세포 분열과 멀리 도입 된 유전자 페이드의 과도 발현 단계.이 제한을 무시하려면 우리는 OVO 유전자 삽입에 대한 PiggyBac 치환 방법을 사용했다.이 도구는 이전의 방법에 비해, 일렉트로 후 훨씬 고급 단계에 대한 강력한 방식으로 축삭과 시냅스의 추적을 할 수 있습니다. 우리가 쉽게 감지 할 수 있으므로 일렉트로 (E14.5)에 따라 십이일에 신경을 레이블, 심지어는 부화 후 등 시간의 긴 기간에 대해이 방법을 사용하는 매우 그럴듯.공간과 시간 제한 매너있는 세포의 일방적 타겟팅 병아리 신경 튜브의 electroporation 릴레이의 또 다른 혜택을 누릴 수 있습니다. 이 B에 축삭 궤적을 추적 할 수 있습니다단계 - 의해 - 단계 기준에 후뇌의 측면을 OTH, 어떤 포유류에 따라 어렵습니다. 이 대부분 일방적 인 계획을 추적하고 IPSI와 콘트라 측면 축삭 책자의 기원 사이에 분리 할 수있는 능력을 복잡 모두 신경관의 측면에서 원하는 세포를 라벨에 있기 때문에 세균 라인 transgenesis 결과입니다. 궁극적으로, 마우스 및 병아리 뇌간 신경 3,5 사이의 유사성의 높은 정도에 따라, 우리의 기술은 배선과 개발 척추 후뇌에있는 뉴런의 어셈블리에 대한 새로운 지식을 얻을 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
우리의 기술의 장점이기는하지만, 증강 요소의 사용은 신경관 세포 특이성과 증강 - GFP의 구조의 표현의 타이밍 신중한 평가가 필요 병아리 리포터 유전자의 조건식을 유도하기 위해, 일부 증강 요소의 도입에서 발견되었다 우리의 시스템은 몇 반면, 후뇌에서 GFP의 비 제한 표정을 운전하는다른 사람이 아닌 특정 초기에 발현하지만 늦게 신경관 단계 (데이터가 표시되지 않음) 굴복. 또한, 우리의 전략은 현재 리포터 유전자의 시간적 특정 표현을 지원하지 않습니다. 따라서, 우리는 가능한 별개의 소뇌 영역을 대상으로 여러 축삭 책자를 투사 할 수 있습니다 DA1의 interneurons, 조기 이상 태생의 하위 구별 할 수 없습니다. 일시적으로 온 / 오프 후뇌 뉴런에 GFP의 발현을 전환하는 추가 도구의 유전자 구조는 더 정확하게 배아 / 성인 뇌간에있는 축삭 궤적과 시냅스의 발달을 따라 도움이 될 것입니다. 마지막으로, 우리의 일렉트로 전략의 기술적 단점은 계란, 혈관 감싸는 세포막에서의 위치에 따라 E2.75-3 이후 단계에서이 조작에 태아의 어려움이다. 이 제한은 나중에 개발에 태어난 후뇌 뉴런의 추가 하위 유형으로 우리의 플라스미드의 타겟팅을 방지합니다.
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Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 | |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound | |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
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