Электропорации Hindbrain Трейс аксонов траектории и Synaptic Цели у эмбрионов кур

Summary

Как нейронных сетей устанавливаются в эмбриональном мозге является фундаментальным вопросом в развитии нейробиологии. Здесь мы объединили метод электропорации с новых генетических инструментов, таких как Cre / LOX-плазмиды и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в заднем мозге птичьего маркировать интернейронов спинного и отслеживать их аксональное прогнозы и синаптических целей на различных стадиях развития.

Abstract

Электропорации цыпленок эмбриональной нервной трубки имеет много преимуществ, таких как быстрое и эффективное для экспрессии чужеродных генов в нервных клетках. В этой рукописи мы предлагаем способ, который демонстрирует, как однозначно электропорации ДНК в мозге на птичьем E2.75 для того, чтобы специально маркировать подмножество нейронных предшественников, и как следовать их аксональное прогнозы и синаптической цели на много продвинутых стадиях разработки, до E14.5. Мы использовали новые генетические инструменты, включая конкретные элементы усилителя, Cre / Жидкий кислород - на основе плазмид и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в целях обеспечения GFP выражение в подтип заднего мозга клеток (спинной наиболее подгруппе интернейронов, dA1). Траектории аксонов и задач dA1 аксоны следуют на ранних и поздних стадиях эмбриогенеза в различных регионах мозга. Эта стратегия способствует передовые методы таргетинга интерес клетки в эмбриональном мозге и траCING схемы формирования на различных стадиях развития.

Introduction

Задний мозг представляет одного из ключевых узлов реле нервной системы, общаясь между центральной и периферической нервной системы с помощью восходящих и нисходящих нейронных сетей. Он регулирует основные функции, включая дыхание, сознание, слуха, координации движений и ^1-3. Во время раннего эмбрионального развития, заднего мозга позвоночных временно разделена по его передне-задней (AP) оси в повторяющихся ромбомеры, в которых различные типы клеток нейронов формируются и создания нескольких центров ядер ствола мозга ^4. Задний мозг также разделен вдоль его спинной-вентральной (DV) оси в базальной и крыльев пластины, на которой дискретных нейронных предшественников стать указан и дифференцироваться в различных местах DV ^3,5,6. Как раннее AP и DV-конкретные нейронные паттерны, регулирующие создание функциональной схемами мозга в значительной степени неизвестно.

Чтобы получить знания по этой фундаментальнойВопрос, инструменты необходимы для того, чтобы обозначить конкретные группы нейронов в мозге и ранней проследить их аксональное траекторий и связи на более поздних стадиях. Ранее мы уже использовали конкретных элементов усилителя, и Cre / LoxP основе системы условного выражения для отслеживания траектории аксональное задних спинальных интернейронов в начале куриного эмбриона ^7-9. В текущем рукописи мы нацелены на заднем мозге и модернизированные экспериментальной парадигмы для маркировки поздних эмбриональных интернейронов заднего мозга, аксоны и их синаптических целей, с использованием модифицированной стратегии электропорации и PiggyBac - опосредованного переноса ДНК. Наши новые стратегии позволяет пометки различных подтипов нейронов в одну сторону заднего мозга и отслеживание их аксонального проекции и синаптической сайтов на различных стадиях эмбриогенеза, от 2 до 12 дней после электропорации. На основе этого метода, мы обозначили наиболее спинно-подгруппе интернейронов заднего мозга (dA1/Atoh1 ⁺ 10.

Сочетание электропорации цыпленок, генетические отслеживания нейронов и анализ проекции места на гораздо поздних стадиях развития предоставляет уникальную платформу для изучения формирования нейронных сетей в мозге и выяснить молекулярные механизмы, которые управляют схемой формирования.

Protocol

1. Hindbrain Электропорацию

1.1 обработки яйца

1. Место яйца горизонтально в увлажненном инкубаторе (37-38.5 ° C). Эмбрионы электропорации после 65-70 ч инкубации, когда они достигают 16-17 (HH) этапе (25-30 сомитами).
2. Удалите яйца из инкубатора, они остаются в горизонтальном положении.

1.2 Подготовка

1. Потяните стеклянные капилляры (диаметром 0,5 мм).
2. Соединение изогнутые L-форме золота Genetrodes электродами (3 мм в диаметре) с адаптером держатель с генератором импульсов. Электропорацию параметры включают в себя 25 вольт, 5 числа импульсов, 45 мс длительность импульса 300 мс импульс интервалами.
3. Подготовить рот пипеткой, 10 мл игла шприца, парафильм полосы, мягкой щеткой, острые рассечение ножницами и 25 мл стерильного раствора PBS. Эта сумма, как правило, достаточно для обработки для яиц (18 яиц).
4. Подготовка адекватной смесь ДНК плазмиды (5 мкг / мкл) идобавить около 0,025% Быстрая краска Зеленая визуализировать инъекции ДНК. Обычно объемом 4 мкл, является достаточным для введения лотка.

1,3 Windowing, инъекции и электропорации

1. Очистите яичную скорлупу с 70% этанола.
2. Ручка одно яйцо в то время, чтобы свести к минимуму время эмбрионального воздействия воздуха.
3. Сделайте отверстие в яйце полюса с ножницами и удалить концы 3-4 мл альбумина со шприцем. Не удалять большее количество альбумина так как он снижает жизнеспособность.
4. Открыть небольшое овальное окно (2,5 х 2 см размер) в верхней центральной части яичной скорлупы использованием рассечение ножницами.
5. Капельное несколько капель PBS в верхней части эмбриона, чтобы предотвратить сухость в течение всего процесса.
6. Загрузка небольшое количество ДНК смесь в стеклянный капилляр использованием рот пипеткой.
7. Поместите эмбриона с его задним концом к вам. Нет чернил инъекций не требуется на данном этапе как зародыш был четко виден. Как избежать увеличения чернил инъекцийэмбриональной выживаемости. Проникнуть хвостового заднего мозга путем проведения капиллярного при ~ 45 °. Не удаляйте мембраны со всего эмбриона. Введите ДНК раствор осторожно в просвет заднего мозга и выдох без образования пузырьков воздуха. Раствор ДНК распространяется вперед.
8. Сразу после инъекции ДНК, поместите параллельными электродами в точное AP и DV заднего мозга позиции вы стремитесь цели. Нажмите на электроды немного снизу, не прикасаясь к сердцу, так как это может уменьшить жизнеспособность. Пульс электропоратора. Электроды должны быть покрыты пузырьками, чтобы указать, электропроводности (рис. 1А).
9. Осторожно выньте электроды и капать несколько капель PBS для охлаждения эмбриона и, чтобы удалить пузырьки. Печать яйцо открывается правильно с полосой парафином для предотвращения высыхания во время инкубации. Вымойте электродов в PBS с мягкой щеткой.
10. Поместите яйцо в инкубаторе в течение желаемого промежутка времени. Выживаемость эмбрионов составляет приблизительно 90% через 2-3 дня послеэлектропорации, а также снижает до 50% 12 дней после электропорации.

2. Анализ Эмбрионы

2.1 Плоские крепления подготовки и иммунофлюоресценции

1. Плоские крепления препараты заднего мозга может быть выполнена до E6.5 легко визуализировать аксонов под микроскопом или стерео-микроскопа.
2. Проанализируйте эмбриона тщательно отделив ее от окружающих оболочек и кровеносных сосудов. Поместите эмбриона в небольшом Силикон - покрытием чашке Петри, содержащую PBS. Прикрепить эмбриона к блюду с вольфрамом штырьков, расположенный напротив сверху. Выполните рассечение в заднем мозге крыши пластины с использованием резких стеклянных капилляров.
3. Используя острый пинцет и микроножниц удерживать верхнюю часть головы и тянуть заднего мозга ткани очень тщательно от ростральнее хвостового. После разделения задний мозг удалить остатки вентральной ткани, чтобы достичь чистого препарата.
4. Выдержите заднего мозга с 4% Параформальдегида (PFA) раствор в течение 1-2 ч при комнатной температуре (RT). Промыть заднего мозга с PBT (PBS с 0,1% Triton X-100), чтобы удалить из PFA.
5. Для иммунофлуоресценции с плоским установлен hindbrains добавляют 500 мкл блокирующего раствора (5% козьей сывороткой в ПБТ и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре инкубировать с ^1-го антитело ON при 4 ° C. Промыть PBT (15 мин × 3). Инкубируют со ^2-й антител в течение 2 ч при комнатной температуре. Промыть PBT (15 мин × 3).
6. Поместите задний мозг сталкивается дорсально на предметное стекло. Добавить люминесцентные монтажа носителя, на заднем мозге. Используйте стеклянные капилляры или вольфрама иглы для выравнивания заднего мозга на слайде.
7. Добавить небольшое количество смазки на каждом углу, чтобы предотвратить сдавливание ткани на покровное стекло. Аккуратно покровным стеклом в верхней части заднего мозга и избежать пузырьков воздуха. За верность добавить лак для ногтей для покрытия кромок стекла.

2.2 Cryo-секций и Иммунофлуоресценция

1. Крио-разделов мозга CAN быть выполнена на любой стадии для визуализации аксональное траекторий. Тем не менее, после E6.5 это должно быть предпочтительным методом из-за трудности для визуализации аксонов в плоской установлен эмбриона, который становится слишком толстым. Кроме того, демонстрация синапсов требует срезов тканей и высоким увеличением вид под микроскопом.
2. Проанализируйте эмбриона и удалить все окружающие ткани. Полоскание с PBS. Вырезать эмбриона на каудальной части продолговатого мозга с использованием микро-ножницы и пинцет острый. Сделайте широкий разрез между мозжечком и средним мозгом и удалить весь мозга. Ткань должна содержать мозга, моста и мозжечка.
3. Исправить ствола мозга в 4% PFA в течение ночи (ON) при 4 ° С, промыть PBS (10 мин х 3) и инкубировать с 30% сахарозы для ВКЛ при 4 ° С до тонущего.
4. Вставить в задний мозг крио-формы с ОСТ (оптимальная температура резка) соединения и не поместить его при температуре -20 ° С до замораживания, как описано в другом месте ^11.
5. Сушат слайды. Добавить 100 мкл блокирующего раствора на каждый слайд в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавить 100 мкл антитела (разведенного в блокирующем растворе до желаемой концентрации). Инкубационный период ^1-й и ^2-й антител включается при 4 ° С или 2 часа при комнатной температуре, соответственно. Для каждого времени инкубации, осторожно добавляют парафином полосы на верхней части слайда, чтобы предотвратить сухости. Промыть PBS (10 мин х 3) между антителами. При необходимости добавьте 1:1000 Dapi (4'-6-диамидино-2-фенилиндол), разведенного в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре. Полоскание с PBS.
6. Монтаж салазок с люминесцентными монтажа средств массовой информации. Дайте высохнуть в течение 1 ч перед анализом.

Representative Results

Этот протокол был недавно использован, чтобы раскрыть аксонов модели и проекции сайтах dA1 подгруппе интернейронов в заднем мозге цыпленок ^10. Чтобы специфично метить эти аксонов, энхансер (Atoh1), который ранее был охарактеризован как специфичные для нейронов спинного dI1 ^8,12,13, было подтверждено быть выражено в мозге dA1 клетки ^10. Элемент был клонирован вверх по течению до Cre рекомбиназу и сотрудничество электропорации в E2.75 наряду с Cre зависимой цитоплазматической репортера GFP плазмиды (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP; 1BI рисунок). Hindbrains были проанализированы 48 часов После электропорации плоскими монтажа подготовке и выявил два противопоказания восходящей боковой проекции аксональное моделей (рис. 2А), один тракт исключительно происходит от dA1 нейронов, расположенных в 6-7 ромбомеры, что вытянутые в спинной канатика, в то время как другие возник из ромбомеры 2-5 и расширен в боковом канатика.

14,15. Репортера CRE-условно-миристоилированного-GFP (mGFP) кассету, клонированных между двумя группами PB (PB-CAG-LoxP-СТОП-LoxP-mGFP-PB), подвергали электропорации в E2.75 вместе с Atoh1 :: Cre усилитель и транспозазой вектор (CAG :: PBase). В этой стратегии электропорации Cre-условный mGFP интегрирован в хромосомы цыпленок и, следовательно, СТОП кассеты удаляется только в dA1 нейронов, что позволяет длительное экспрессии GFP в dA1 клеток (рис. 1BII; ^10). Миристоилированного форме GFP тросов его к мембране так, что он локализован вдоль мембраны аксона вместо того, разбавленный в цитоплазме. Brainstems были собраны на E13.5 и проанализированы в сагиттальных срезах (рис. 2В). dA1 аксоны были найдены накапливаться в мозжечке и продолжится в сторону внешнего гр фиброзного слоя (EGL), который отмечен Zic1 ⁺ клеток.

Synaptic цели dA1 аксонов в мозжечке были также проанализированы. E2.75 эмбрионов подвергали электропорации с белком синаптических везикул 2 (SV2)-GFP репортерной плазмидой ^16,17, наряду с Atoh1 :: Cre усилитель и PB транспозазы (рис. 1BIII). Этот метод позволяет выражения GFP репортера в пресинаптических пузырьках из dA1 аксонального концов. Мозжечок была разделена на E13.5 и окрашивают с общим пресинаптических маркеров синаптотагмин ^18,19, а также с кальбиндин что маркирует слой Пуркинье (фиг. 3А, 3В). SV2-GFP ⁺ синаптические пузырьки были обнаружены в нескольких мозжечка регионах, включая слой Пуркинье, с указанием синаптических связей dA1 интернейронов заднего мозга в мозжечке.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
На рисунке 1 (А) Иллюстрация метод электропорации в E2.75 цыпленок заднего мозга (B) Схема плазмиды использовали для условного обозначения задний мозг dA1 интернейронов; (I).. Конструкции включают в себя элемент Atoh1 усилитель клонировали выше для рекомбиназы Cre-кДНК и условные репортерной плазмидой, в которой транскрипции кассеты СТОП вставляется между CAGG энхансер / промотор модуль и цитоплазматический ген GFP (cGFP). Условное выражение GFP в dA1 нейронов обусловлена ​​Atoh1 :: Cre (II). PiggyBac метод транспозиции, чтобы конструктивно маркировать клетки заднего мозга. Конструкции включают Atoh1 :: Cre усилитель плазмиды, Cre-условный репортер кассета, в которой миристоилированного GFP (mGFP), клонируют между двумя рукавами PB (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB) и транспозазу PBase плазмиды.Интеграция репортер кассеты в геном нейронов dA1 обусловлен CAG :: PBase и Atoh1 :: Cre векторов. (III): Аналогичный метод транспозиции PiggyBac маркировать синаптических целей интернейронов заднего мозга. CRE-условное репортера плазмиды включает синаптической SV2-GFP окружении между двумя рукавами PB (PB-LoxP-СТОП-LoxP-SV2-GFP-PB). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Аксонов траектории dA1 интернейронов (A):. Плоским установлен подготовки E4.5 задний мозг демонстрирует два возрастанию dA1 аксонального путей (зеленый, стрелки). Neurofillament маркером 3A10 (красный) используется для обозначения ромбомере границ. (B) сагиттальныйчасть мозжечка E13.5 эмбрионов демонстрирует dA1 аксонов (зеленый) накапливаются в мозжечке. EGL клетки метили Zic1 (красный). EGL, внешний зернистом слое, масштабной линейки отмечен.

Рисунок 3. Synaptic цели dA1 интернейронов (A):. Сагиттальной части мозжечка E13.5 окрашивали кальбиндин (розовый) Марку Пуркинье слой и DAPI (синий) для обозначения ядер. (B). При большем увеличении отмеченной области А. SV2-GFP помечены dA1 синапсов (зеленый) показаны на слой Пуркинье мозжечка (розовый). Общая пресинаптических маркеров синаптотагмин (красный) экспрессируется совместно с SV2-GFP ⁺ синапсов (желтый, стрелки). Calb, кальбиндин, S-Tag, синаптотагмин. Шкала индикатора маркируются.

Discussion

В ово электропорации является выполнимой, надежный и эффективный инструмент для изучения спецификации клеток и аксонов во куриных развития нервной системы ^20. В этом протоколе мы опишем способ электропорации у кур на заднем мозге E2.75 использованием усилителя элементы, которые позволяют условной маркировки конкретных интернейронов. Эта стратегия в сочетании с PiggyBac-опосредованный перенос система для вставки чужеродных генов в геноме цыпленок, который дает возможность отслеживания аксонов маршрутов, выступы и синаптических сайтов на поздней стадии эмбриогенеза.

Известные способы этикетке аксонов / синапсов в мозге куриного включены классические ретроградная или антероградной красителя маркировки или прививка экспериментов ^21-23. Эти исследования способствовали важные выводы на заднем мозге восходящие и нисходящие аксональное путей. Однако некоторые траекторий и прогнозы были упускать из виду этих клеточных подходов. В Addit ионной, молекулярной идентичности подгрупп нейронов, которые проецируются в отчетном Funiculi, выявить не удалось. Наш комбинированный метод электропорации и поддерживать генетическое трассировка предоставляет уникальную возможность следить за развитием выбранных нейронов заднего мозга от их стадии спецификации аксональное навигации и проекционные задачи ^10. Примечательно, что наш подход был ранее применен проследить траектории аксонов спинного мозга спинного интернейронов на более короткие периоды времени ^8,9.

Описанные инструменты могут также служить, чтобы раскрыть молекулярные механизмы, которые регулируют аксонального проекции; генетического кода (например, Лим гомео-кодовой области), селективно изменение в определенном нейронов подгруппы использованием enhancer-Cre/Lox-based подход и воздействие рост аксонов и подключения последовали ^8,10. Следовательно, этот протокол может быть полезна не только для мечения клеток, но и для генетических манипуляций на нужные ячейки.

ve_content "> Одним из преимуществ электропорации, как в ово способ доставки генов является быстрота выражение, которое наблюдается уже в течение 3 часов после электропорации ^24. Тем не менее, временной экспрессии введенного гена исчезает с клеточных делений на более позднем развитии этапов. Чтобы изменить это ограничение, мы использовали метод PiggyBac переложении для вставки в ово гена. Этот инструмент позволяет отслеживать аксонов и синапсов в прочном образом на протяжении большей поздних стадиях после электропорации, по сравнению с предыдущими методами. поскольку мы могли легко обнаружить меченых нейронов до 12 дней после электропорации (E14.5), весьма правдоподобно использовать этот подход даже для более длительных периодов времени, в том числе после вылупления.

Еще одно преимущество куриных нервной трубки электропорации реле на односторонние, направленные против клеток в пространственные и временные ограничения манеры. Это позволяет проследить аксональное траекторий на Bпротивном сторонах заднего мозга в стадии пошаговой основе, который тверже следовать у млекопитающих. Это главным образом потому зародышевой линии трансгенез результаты при маркировке нужные ячейки в обеих сторонах нейронных трубки, усложняя возможность отслеживать односторонних прогнозов и отделить между пунктами отправления ипси и противопоказания аксональное боковых путей. В конечном счете, на основе высокой степени гомологии между мышей и куриных мозга нейроны ^3,5, наша техника обеспечивает мощный инструмент, чтобы получить новые знания по сборке проводки и нейронов в развивающемся мозге позвоночных.

Хотя преимущества нашей техники, использование элементов усилителя ездить условное выражение репортер генов у кур нервной трубки требует тщательной оценки для сотовых специфичности и сроках выражение усилитель-GFP конструкций, внедрение некоторых элементов усилителя были найдены в наших систему, чтобы управлять неограниченным выражения GFP в заднем мозге, тогда как несколькодали другие неспецифические выражение на ранних, но не поздно, нейронные стадии трубки (данные не показаны). Кроме того, наша стратегия настоящее время не поддерживает височно-специфическую экспрессию гена-репортера. Следовательно, мы не можем различать рано или позже происхождения подгруппы dA1 интернейронов, которые, возможно проецировать разные участки аксональное целевой различных областях мозжечка. Генетические строительство дополнительных инструментов для временного включения / выключения выражения GFP в заднем мозге нейроны будет полезно следовать точнее развитие аксонов и синапсов траектории в эмбриональном / взрослого мозга. Наконец, технический недостаток нашего электропорации стратегии является недоступность эмбриона к этой манипуляции на этапах за E2.75-3, из-за его позиции в яйце, кровеносные сосуды и обволакивающее мембран. Это ограничение предотвращает действия, направленные против нашей плазмид в дополнительных подтипов заднего мозга нейронов, которые рождаются позже в развитии.